VEGF对非小细胞肺癌转归的影响对非小细胞肺癌转归的影响中国武警医学院附属医院肿瘤中心中国武警医学院附属医院肿瘤中心 穆海玉穆海玉 前言前言n 肺癌是当今世界上对人类健康和生命危害最大的恶性肿瘤，随着传统肺癌是当今世界上对人类健康和生命危害最大的恶性肿瘤，随着传统化疗进入了一个平台期，靶向治疗引起人们的高度关注。实验显示新生化疗进入了一个平台期，靶向治疗引起人们的高度关注。实验显示新生血管生成是肿瘤生长与转移的解剖学和生理学基础，因此研究可能影响血管生成是肿瘤生长与转移的解剖学和生理学基础，因此研究可能影响肺癌血管生成的因素，寻找有效的抗血管生成药物，可望在很大程度上肺癌血管生成的因素，寻找有效的抗血管生成药物，可望在很大程度上改变肺癌治疗的现状。研究显示：血管内皮生长因子（改变肺癌治疗的现状。研究显示：血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor VEGF）是肺癌血管生成的关键因素。本是肺癌血管生成的关键因素。本实验采用实验采用SP免疫组织化学方法，检测肺癌组织中免疫组织化学方法，检测肺癌组织中VEGF的阳性表达，分的阳性表达，分析研究它与微血管密度（析研究它与微血管密度（microvessel density MVD）之间的关系及之间的关系及与临床病理、组织分型和转移之间的联系，以探讨与临床病理、组织分型和转移之间的联系，以探讨VEGF在肺癌血管生在肺癌血管生成中的作用。成中的作用。对象及分组对象及分组 （1） 肺癌组：共肺癌组：共40例，平均年龄例，平均年龄52.6岁，其中男岁，其中男21例，女例，女19例。所有患者术前均未接受放化疗。所有标本均重新切片后经例。所有患者术前均未接受放化疗。所有标本均重新切片后经HE染色证实为肺癌。其中鳞癌染色证实为肺癌。其中鳞癌21例，腺癌例，腺癌14例，小细胞未分化例，小细胞未分化癌癌 5例；高分化例；高分化20例，中分化例，中分化7例，低分化例，低分化8例；例；期期期期21例，例，期期期期14例。例。 （2） 肺良性病组：共肺良性病组：共12例，男例，男9例，女例，女3例；平均年龄例；平均年龄49.8岁。岁。标本重新切片后经标本重新切片后经HE染色证实染色证实7例为结核球、例为结核球、5例为肺炎。例为肺炎。 （3） 正常对照组：共正常对照组：共10例，男例，男6例，女例，女4例；平均年龄例；平均年龄47.6岁。岁。经经HE染色证实为正常肺组织。染色证实为正常肺组织。方法方法 所有石蜡标本均行所有石蜡标本均行5切片，连续切切片，连续切4片，置片，置60度烤箱内烤度烤箱内烤30分钟。分钟。所有切片分别经二甲苯脱蜡，无水酒精及其它不同浓度酒精脱苯，所有切片分别经二甲苯脱蜡，无水酒精及其它不同浓度酒精脱苯，自来水洗自来水洗2分钟水化。必选一张切片行分钟水化。必选一张切片行HE染色核实病理诊断。采染色核实病理诊断。采用用SP免疫组织化学染色法，按药盒操作规程进行。以免疫组织化学染色法，按药盒操作规程进行。以PBS代替一代替一抗作阴性对照，用武汉博士德生物工程有限公司提供的已知阳性抗作阴性对照，用武汉博士德生物工程有限公司提供的已知阳性切片作阳性对照。切片作阳性对照。结果判定结果判定n VEGF表达的判定：镜下癌细胞浆呈棕黄色颗粒状表达的判定：镜下癌细胞浆呈棕黄色颗粒状者为阳性，细胞浆呈透明或无色者为阴性，每张切者为阳性，细胞浆呈透明或无色者为阴性，每张切片中观察片中观察5个高倍视野个高倍视野200， 每一视野记数每一视野记数100个细胞，阳性染色细胞个细胞，阳性染色细胞10%为为阴性，阴性，10%为阳性。为阳性。nMVD的测定：的测定：参考参考Weidner方法，先在低倍镜下扫视整个切方法，先在低倍镜下扫视整个切片，确定对片，确定对FAg明显着棕褐色微血管密度最高区，即明显着棕褐色微血管密度最高区，即 “热点热点”。然后换成高倍镜进行记数。凡在肿瘤组织中与邻近微血管、肿瘤然后换成高倍镜进行记数。凡在肿瘤组织中与邻近微血管、肿瘤细胞及其它结缔组织分界清楚的任何一个染成棕褐色的细胞或细细胞及其它结缔组织分界清楚的任何一个染成棕褐色的细胞或细胞簇均被认为是一个血管；只要结构不相连，其分枝结构也算作胞簇均被认为是一个血管；只要结构不相连，其分枝结构也算作一个血管。但不能用有无红细胞的出现及是否形成管腔来记数血一个血管。但不能用有无红细胞的出现及是否形成管腔来记数血管数。已形成明显肌层的血管不参与计数，结果以管数。已形成明显肌层的血管不参与计数，结果以3个视野血管个视野血管的均数表示。的均数表示。n计量资料数据采用计量资料数据采用均数均数标准差标准差表示表示，所得，所得数据采用数据采用t检验和方差分析；计数资料采用检验和方差分析；计数资料采用x2检验。检验。统计学处理统计学处理结果结果1-三种肺组织中三种肺组织中MVD分布情况分布情况 n阳性染色局限于血管内皮细胞膜，呈棕褐阳性染色局限于血管内皮细胞膜，呈棕褐色，微血管形态不规则，在癌组织中的分色，微血管形态不规则，在癌组织中的分布呈异质性，大多集中在肿瘤边缘。布呈异质性，大多集中在肿瘤边缘。 n MVD肺癌组肺癌组 40 20.78 5.86 良性组良性组 12 6.83 1.23 正常组正常组 10 5.20 1.13P值值 P良良=0.003 P正正=0.002表表1 MVD在三种肺组织中的表达在三种肺组织中的表达 VEGF着色为棕黄色颗粒，阳性染色主要分布于癌细着色为棕黄色颗粒，阳性染色主要分布于癌细胞胞浆中，在肿瘤坏死灶周围尤为明显。肺癌组织胞胞浆中，在肿瘤坏死灶周围尤为明显。肺癌组织VEGF阳性率显著高于肺良性病变和正常对照组。阳性率显著高于肺良性病变和正常对照组。见表见表2结果结果2-VEGF在三种肺组织中的表达在三种肺组织中的表达 例数例数 VEGF+ VEGF- P值值肺癌肺癌 40 25 15 P癌症癌症-良性良性=0.014肺良肺良 12 2 10 P癌症癌症-正常正常=0.001正常正常 10 0 10 P良性良性-正常正常=0.542表表2 VEGF在三种肺组织中的表达在三种肺组织中的表达结果结果3 MVD、 VEGF表达与临床参数之间的关系表达与临床参数之间的关系nMVD与原发肿瘤大小、组织学分级、淋巴转移有关，与原发肿瘤大小、组织学分级、淋巴转移有关，而与病理分型无关，见表而与病理分型无关，见表3。nVEGF与原发肿瘤大小、淋巴转移有关，而与组织与原发肿瘤大小、淋巴转移有关，而与组织学分级、病理分型无关，见表学分级、病理分型无关，见表3。临床病理特征临床病理特征 N MVD P VEGF P + -肿瘤大小肿瘤大小 5cm 19 17.16 4.11 0.003 11 8 0.0215cm 16 25.63 4.77 14 2组织学分级组织学分级 高 20 17.35 4.22 0.000 13 7 0.629 中 7 23.14 4.38 0.023 5 2 0.897 低 8 28.25 4.20 7 1病理分型病理分型鳞癌 21 20.24 56.1 0.72 14 7 0.504腺癌 14 22.21 6.74 11 3 淋巴结转移淋巴结转移有 13 26.62 4.58 0.002 12 1 0.02无 22 17.73 4.13 13 9 表表3 非小细胞肺癌非小细胞肺癌MVD、VEGF表达与临床参数之间的关系表达与临床参数之间的关系VEGF MVD P值值 阳性（阳性（ 25 例例 ） 23.405.29 P=0.012阴性（阴性（15例）例） 16.403.85结果结果4-肺癌肺癌VEGF表达与表达与MVD的关系的关系表表4讨论讨论 n一、肺癌的微血管密度：肿瘤是代谢高度旺盛的细胞，在肿瘤发生的一、肺癌的微血管密度：肿瘤是代谢高度旺盛的细胞，在肿瘤发生的早期，肿瘤细胞可通过组织渗透而维持其生长，此期肿瘤处于高增生早期，肿瘤细胞可通过组织渗透而维持其生长，此期肿瘤处于高增生和高凋亡平衡的休眠状态当肿瘤直径和高凋亡平衡的休眠状态当肿瘤直径1mm后，肿瘤必须产生提供后，肿瘤必须产生提供自身营养的新血管，血管新生是肿瘤生长与发展的必经之路自身营养的新血管，血管新生是肿瘤生长与发展的必经之路,与实体与实体瘤的发生和转移有着不可分割的密切关系瘤的发生和转移有着不可分割的密切关系 。应用特异性抗体标记肿瘤。应用特异性抗体标记肿瘤组织血管内皮细胞，记数单位面积中的微血管数目，即为微血管密度组织血管内皮细胞，记数单位面积中的微血管数目，即为微血管密度（MVD），），通过它可衡量肿瘤血管生成的活跃程度。通过它可衡量肿瘤血管生成的活跃程度。n资料报道：包括肺癌在内的肿瘤组织内资料报道：包括肺癌在内的肿瘤组织内MVD明显增高，并与预后呈明显增高，并与预后呈显著负相关。我们的试验显示：微血管在癌组织中的分布呈异质性，显著负相关。我们的试验显示：微血管在癌组织中的分布呈异质性，大多集中在肿瘤边缘，肺癌组织大多集中在肿瘤边缘，肺癌组织MVD显著高于肺良性病变和正常组显著高于肺良性病变和正常组织，差异具有统计学意义（织，差异具有统计学意义（p0.01），）， 而肺良性病变和正常组织而肺良性病变和正常组织的的MVD无显著差异。通过比较非小细胞肺癌不同状态下无显著差异。通过比较非小细胞肺癌不同状态下MVD表达，表达，我们发现肺癌的我们发现肺癌的MVD与原发肿瘤的大小、淋巴结转移状态、肿瘤的与原发肿瘤的大小、淋巴结转移状态、肿瘤的分化程度密切相关（分化程度密切相关（p0.01），）， 证实肺癌组织新生血管活跃，证实肺癌组织新生血管活跃，MVD是反映和判断肺癌血管生成状态以及临床转归的一个独立、相是反映和判断肺癌血管生成状态以及临床转归的一个独立、相关性良好的指标，关性良好的指标， n二、肺癌的血管内皮生长因子高表达：肺癌血管生成过程主要两二、肺癌的血管内皮生长因子高表达：肺癌血管生成过程主要两类因子调节类因子调节:血管生成促进因子和抑制因子，前者中功能最强、血管生成促进因子和抑制因子，前者中功能最强、作用最直接的是作用最直接的是VEGF 。 在肺癌组织中，肿瘤的快速增殖导致细在肺癌组织中，肿瘤的快速增殖导致细胞乏氧等一系列因素它诱导胞乏氧等一系列因素它诱导VEGF的异常分泌，表现为肿瘤组织的异常分泌，表现为肿瘤组织内的高表达。内的高表达。nVEGF能够特异性地与血管内皮细胞膜上的受体结合，刺激能够特异性地与血管内皮细胞膜上的受体结合，刺激内皮细胞的分裂、增殖、迁移，促使毛细血管绊形成并向瘤内皮细胞的分裂、增殖、迁移，促使毛细血管绊形成并向瘤体内延伸，诱导肿瘤血管新生，导致肿瘤内大量结构和功能体内延伸，诱导肿瘤血管新生，导致肿瘤内大量结构和功能异常的微血管数量增加，满足肿瘤对代谢的需要。异常的微血管数量增加，满足肿瘤对代谢的需要。 VEGF信信号传导通路在肿瘤的血管生长调控中非常重要，国内外许多号传导通路在肿瘤的血管生长调控中非常重要，国内外许多实验都通过干扰这个通路来研究调控肿瘤的血管生长。实验都通过干扰这个通路来研究调控肿瘤的血管生长。n一些研究发现：无论是在体外培养的肿瘤细胞、动物模型，还是一些研究发现：无论是在体外培养的肿瘤细胞、动物模型，还是人体肿瘤组织中均有人体肿瘤组织中均有VEGF的高表达，肺癌组织的高表达，肺癌组织VEGF表达的阳性表达的阳性率、阳性细胞数和染色强度均高于癌旁正常组织。本研究检测了率、阳性细胞数和染色强度均高于癌旁正常组织。本研究检测了40例肺癌患者组织标本显示：例肺癌患者组织标本显示： VEGF主要分布于肿瘤胞浆中，在主要分布于肿瘤胞浆中，在肿瘤坏死灶中尤为明显。癌组织中肿瘤坏死灶中尤为明显。癌组织中 VEGF阳性率显著高于肺良性阳性率显著高于肺良性病变组织及正常对照组织（病变组织及正常对照组织（ p0.01）;肺良性病变组织及正常肺良性病变组织及正常对照组织的对照组织的VEGF阳性率差异无显著性，表明阳性率差异无显著性，表明VEGF与肺癌的血管与肺癌的血管生成具有极其密切关系。生成具有极其密切关系。n三、三、VEGF的高表达与临床特征：的高表达与临床特征：VEGF的过表达促使肺癌组织新生的过表达促使肺癌组织新生血管增加，而肿瘤新生幼稚血管的结构缺乏完整性，管壁仅排列一血管增加，而肿瘤新生幼稚血管的结构缺乏完整性，管壁仅排列一层内皮细胞，并且由于缺乏平滑肌，基底膜变薄或消失缺如，肺癌层内皮细胞，并且由于缺乏平滑肌，基底膜变薄或消失缺如，肺癌细胞易于侵蚀血管，使肿瘤细胞极易脱离母体进入血管，造成肺癌细胞易于侵蚀血管，使肿瘤细胞极易脱离母体进入血管，造成肺癌的血行转移。学者们通过对手术切除的肺癌患者的血行转移。学者们通过对手术切除的肺癌患者VEGF表达高低的测表达高低的测定以及术后生存率的观测发现：肺癌患者中定以及术后生存率的观测发现：肺癌患者中VEGF高表达者的术后生高表达者的术后生存时间较短，且较早复发。另外一些研究也显示：肺癌组织血管新存时间较短，且较早复发。另外一些研究也显示：肺癌组织血管新生与患者的生存期密切关联，呈十分良好的相关性，生与患者的生存期密切关联，呈十分良好的相关性，n通过评价非小细胞肺癌通过评价非小细胞肺癌VEGF表达与临床特征的关系，我们注意表达与临床特征的关系，我们注意到：肿瘤直径到：肿瘤直径5cm组组VEGF阳性率与肿瘤直径阳性率与肿瘤直径5cm组相比差组相比差异显著（异显著（ p0.05） ；淋巴结转移组淋巴结转移组VEGF阳性率与无淋巴结转阳性率与无淋巴结转移组相比有差异统计学意义（移组相比有差异统计学意义（ p0.05） 。这个结果表明：在这个结果表明：在非小细胞肺癌中，非小细胞肺癌中，VEGF的高表达与原发肿瘤的大小、淋巴结转的高表达与原发肿瘤的大小、淋巴结转移状态密切相关移状态密切相关 ,是肺癌病灶生长、远处转移极其重要的因素，是肺癌病灶生长、远处转移极其重要的因素，它的存在使肺癌的预后向不良方向迅速发展。它的存在使肺癌的预后向不良方向迅速发展。n四、四、 VEGF与与MAD的关系：为进一步确定的关系：为进一步确定VEGF与肺癌组织血管与肺癌组织血管新生的关联性，我们分析了不同新生的关联性，我们分析了不同VEGF表达的组织中表达的组织中MAD的表达，的表达，实验表明：实验表明：VEGF阳性高表达组阳性高表达组MAD计数显著增高，而计数显著增高，而VEGF低低表达表达组组MAD则较低，两者差异具有统计学意义（则较低，两者差异具有统计学意义（P=0.012），），说明说明VEGF与与MAD之间确实存在正相关的密切关系，进一步证实之间确实存在正相关的密切关系，进一步证实了了VEGF在促使肺癌新血管生成方面所发挥的重要作用。在促使肺癌新血管生成方面所发挥的重要作用。结论结论n（1） MVD是评估和判断肺癌血管生成状态一个独立的、相关性是评估和判断肺癌血管生成状态一个独立的、相关性良好的指标良好的指标,它与肺癌的进展密切相关；（它与肺癌的进展密切相关；（2） VEGF在肺癌组织在肺癌组织中呈现阳性过表达，中呈现阳性过表达， VEGF表达与表达与MVD具有良好的相关性；具有良好的相关性；（3）VEGF表达与非小细胞肺癌肿瘤病灶大小，淋巴结转移密切表达与非小细胞肺癌肿瘤病灶大小，淋巴结转移密切相关，而与肿瘤的分化程度、病理分型无关。提示：相关，而与肿瘤的分化程度、病理分型无关。提示：VEGF通过促通过促使血管新生成而影响非小细胞肺癌的发展和预后；使血管新生成而影响非小细胞肺癌的发展和预后； VEGF的靶向的靶向治疗将通过阻断肺癌血管的生长，而控制非小细胞肺癌的侵袭和治疗将通过阻断肺癌血管的生长，而控制非小细胞肺癌的侵袭和远处转移。远处转移。 参考文献n1 1 Bun Bun PAPA，et et al. al. New New therapeutic therapeutic strategies strategies for for lung lung cancercancer：biology biology and and molecular molecular biology biology come come age. age. Chest Chest 20002000，117117（4 4 SupplSuppl 1 1）：）：s163-s168s163-s168n2. 2. Yuan Yuan A A，et et al. al. Correlation Correlation of of total total VEGF VEGF mRNA mRNA and and protein protein expression expression with with hitolgichitolgic type type ， tumor tumor angiogenesisangiogenesis，patient patient survival survival and and timing timing of of relapse relapse in in non-small-cell non-small-cell lung lung cancercancer（ j j） . .IntInt J J CancerCancer， 20002000，8989（3 3）475-483.475-483.n7. 7. SalvenPSalvenP，et et al. al. High High pre-treatment pre-treatment serum serum level level of of vscularvscular endothelial endothelial growth growth factorfactor（VEGFVEGF）is is associated associated with with poor poor outcome outcome in in small-cell small-cell lung lung cancercancer（J J）. . IntInt J J CancerCancer，19981998，7979（2 2）111-146.111-146.n.Cox G.Cox G，et al.et al. Angiogenesis and non-small-cell lung cancer. Lung Cancer ，2000，27（2）：）：81-100。