第34讲克隆技术突破突破1 1 植物细胞工程植物细胞工程突破突破2 2 动物细胞工程动物细胞工程总纲目录总纲目录一、细胞工程1.应用的原理和方法:细胞生物学和分子生物学的原理和方法。2.操作水平:细胞水平或细胞器水平。3.目的:按照人的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品。4.分类:根据操作对象的不同,分为植物细胞工程和动物细胞工程。1.原理:细胞的全能性。(1)原因:生物的任何一个细胞都包含本物种的全部遗传信息。(2)全能性表达的条件:处于离体状态,提供一定的营养、激素和其他适宜的外界条件。二、植物细胞工程2.植物组织培养技术离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织根、芽植物体3.植物体细胞杂交技术(1)去壁:酶解法,所用酶为纤维素酶和果胶酶。(2)诱导原生质体融合:物理法离心、振动、电激等;化学法常用聚乙二醇(PEG)做诱导剂。(3)植物体细胞杂交成功的标志:杂种细胞再生出细胞壁。(4)优点:克服远缘杂交不亲和的障碍。(5)变异类型:染色体变异。4.植物细胞工程的实际应用(1)植物繁殖新途径(2)作物新品种的培育:单倍体育种、突变体的利用。(3)细胞产物的工厂化生产:利用植物组织培养技术生产蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料和生物碱等物质。1.动物细胞培养(1)过程(2)条件a.无菌、无毒的环境无菌处理、加抗生素杀菌、定期更换培养液。三、动物细胞工程b.营养糖、氨基酸、促生长因子、无机盐和微量元素+血清或血浆等天然成分。c.适宜的温度(36.50.5)和pH(7.27.4)。d.气体环境95%空气+5%CO2(维持培养液的pH)。(3)应用:生产细胞产品,如干扰素、疫苗、单克隆抗体;检测并判断某物质毒性的大小;临床医学研究。2.动物体细胞核移植(1)原理:动物细胞核具有全能性。(2)过程3.动物细胞融合与单克隆抗体制备(1)诱导动物细胞融合的方法:物理法离心、振动、电激等;化学法聚乙二醇;生物法灭活的病毒。(2)单克隆抗体制备过程(3)单克隆抗体的优点:特异性强、灵敏度高、可大量制备。(4)单克隆抗体的应用:作为诊断试剂;用于治疗疾病和运载药物。四、生物技术中的伦理问题1.克隆人(1)分类a.生殖性克隆是指以繁殖个体为目的的克隆,即用于产生人类个体。b.治疗性克隆是指利用核移植技术获得克隆人胚胎,然后从胚胎中提取干细胞进行医学研究,是利用克隆技术产生特定细胞和组织(皮肤、神经或肌肉等)用于治疗性移植的克隆。(2)中国态度:禁止生殖性克隆人,不反对治疗性克隆。2.试管婴儿与设计试管婴儿(1)试管婴儿:运用体外受精和胚胎移植技术繁殖个体,目的是解决不孕夫妇的生育问题。(2)设计试管婴儿:体外受精获得的胚胎在移植前进行遗传学诊断,以便筛选出符合特定要求的胚胎。1.乳腺细胞比乳腺癌细胞更容易进行离体培养。( )2.在愈伤组织培养中加入细胞融合的诱导剂,可获得染色体加倍的细胞。( )3.棉花根尖细胞经诱导形成幼苗能体现细胞的全能性。()4.二倍体植株的花粉经脱分化与再分化后能得到稳定遗传的植株。 ( )5.植物的每个细胞在植物体内和体外都能表现出细胞的全能性。 ( )6.用人工薄膜将胚状体、愈伤组织等分别包装可制成人工种子。( )8.未经克隆化培养的细胞系细胞具有相同的性状。( )7.由多个祖细胞培养形成的细胞群为一个克隆。( )9.由动物组织细胞培养到连续细胞系的过程,得到的细胞大多具有二倍体核型。( )10.培养哺乳动物胚胎的培养液,其成分较简单,一般只需一些无机盐和有机盐类即可。( )11.动物细胞培养技术可用于转基因动物的培育。()1.细胞全能性(1)原理:细胞含有本物种全部的遗传信息。(2)体内细胞全能性不表达的原因:基因在特定的时间和空间条件下选择性表达。(3)细胞全能性表达的条件:具完整细胞核;离体;无菌;一定的营养、激素和适宜的外界条件。突破突破1 1植物细胞工程植物细胞工程 (4)一般地,细胞全能性大小与细胞分化程度成反比。(5)全能性大小:植物细胞:受精卵生殖细胞体细胞。动物细胞:受精卵生殖细胞体细胞核。(动物细胞全能性受限制,但细胞核具有全能性)2.植物组织培养与体细胞杂交知能拓展知能拓展影响植物组织培养的几种主要因素(1)植物激素:影响脱分化、再分化的重要因素为植物激素。当细胞分裂素与生长素共同使用时,能强烈地促进愈伤组织的形成,两者不同浓度的配比在再分化过程中,分别对诱导根或芽的产生起关键作用。当细胞分裂素与生长素的浓度比高时,有利于芽的产生;浓度比低时,有利于根的产生。(2)光照:对于植物组织培养,光照条件非常重要,包括光照强度、时间和波长。但在愈伤组织的诱导阶段往往要暗培养,而在愈伤组织分化出芽和叶的过程中一定要有光照。愈伤组织诱导阶段的暗培养有利于细胞的脱分化产生愈伤组织,如果在光照条件下则容易分化产生维管等组织,不利于产生大量的愈伤组织。(3)无菌:培养基上的细菌等微生物比植物细胞具有更强的新陈代谢能力,比植物细胞生长繁殖得更快,而且它们往往会产生毒素,使培养基上的植物细胞死亡。因此,在培养过程中要求一系列的消毒、灭菌处理,并且要求无菌操作。3.单倍体育种和突变体利用的比较项目原理优点成果单倍体育种染色体变异明显缩短育种年限单育1号烟草品种,中花8号、11号水稻和京花1号小麦品种等突变体利用基因突变产生新基因,大幅度改良某些性状抗花叶病毒的甘蔗、抗盐碱的野生烟草等1.(2018北京西城期末)通过植物组织培养可获得完整幼苗。下列对此过程的叙述,正确的是()A.花粉不含完整的基因组,不能培养成单倍体植株B.选择植物幼嫩的部分作外植体,更易诱导脱分化C.植物组织培养过程中可发生基因突变和基因重组D.植物组织培养过程不需添加有机碳源但需要光照考向考向1以基础判断或实例分析的形式以基础判断或实例分析的形式,考查植物的组织培养考查植物的组织培养B答案答案B花粉含有该植物的全套遗传信息,可以经花药离体培养而培养成单倍体植株,A错误;幼嫩部位的新陈代谢旺盛,分化程度低,更易诱导脱分化过程发生,B正确;植物组织培养是无性生殖过程,不产生配子,故在有丝分裂间期可发生基因突变,但无法发生基因重组,C错误;植物组织培养过程中需要有机碳源,脱分化过程要严格避光,D错误。2.(2017北京师大附中期中)下列有关植物组织培养的叙述,正确的是()A.愈伤组织是一团有特定结构和功能的薄壁细胞B.二倍体植株的花粉经脱分化与再分化后得到稳定遗传的植株C.用人工薄膜将胚状体、愈伤组织等分别包装可制成人工种子D.植物耐盐突变体可通过添加适量NaCl的培养基培养筛选而获得D答案答案D愈伤组织是一团排列疏松而无规则、高度液泡化的、呈无定形状态的、具有分生能力的薄壁细胞,不具有特定的结构和功能,A错误;二倍体植株的花粉中只含一个染色体组,培养得到的个体为单倍体,高度不育,B错误;人工种子中包裹的是再分化形成的胚状体或不定芽、顶芽和腋芽等,但不能是愈伤组织,C错误;用特定的选择培养基可筛选出所需的突变体类型,如可利用加适量NaCl的培养基对植物耐盐突变体进行筛选,D正确。考向考向2以实例分析的形式以实例分析的形式,考查植物体细胞杂交考查植物体细胞杂交3.“白菜甘蓝”是用细胞工程的方法培育出来的蔬菜新品种,它具有生长期短、耐热性强和易于储藏等优点。如图是“白菜甘蓝”的杂交过程示意图。以下说法正确的是()A.除去细胞壁形成原生质体,可运用的酶是纤维素酶、淀粉酶和果胶酶B.通常可诱导上述原生质体相互融合的方法是PEG和灭活的病毒诱导C.杂种细胞形成的标志是产生了新的细胞壁D.愈伤组织形成“白菜甘蓝”植物体必须经过脱分化和再分化两个过程答案答案C用于除去植物细胞壁的酶有纤维素酶和果胶酶;植物体细胞杂交过程中诱导原生质体融合不能用灭活的病毒;杂种细胞形成的标志是产生了新的细胞壁;愈伤组织形成“白菜甘蓝”植物体属于再分化过程。4.下面为“番茄马铃薯”的培育过程示意图,请据图回答下列问题:(1)若运用传统有性杂交(即用番茄、马铃薯杂交)能否得到可育的杂种植株?为什么?。(2)在利用杂种细胞培育杂种植株的过程中,运用的技术手段是,依据的原理是,其中过程称为技术,与过程密切相关的具有单层膜结构的细胞器为,过程相当于,过程涉及的细胞分裂方式为。(3)已知番茄、马铃薯分别为四倍体、二倍体,则“番茄马铃薯”属于倍体植株。(4)柴油树种子含有的柴油是植物细胞的代谢产物,可用植物组织培养来实现柴油的工业化生产。若利用此技术,将柴油树细胞培养进行到(填字母编号)阶段即可。答案答案(1)不能。不同种的植物存在生殖隔离(2)植物组织培养植物细胞的全能性原生质体融合高尔基体脱分化有丝分裂(3)六(4)e解析解析(1)番茄和马铃薯属于两种植物,存在生殖隔离,不能通过有性杂交产生后代。(2)过程是把a、b两个原生质体融合在一起,所以称为原生质体融合。过程是在融合的原生质体外再生一层细胞壁,而植物细胞壁的形成与高尔基体有关。过程的结果是形成了愈伤组织,所以为脱分化。(3)“番茄马铃薯”属于异源多倍体中的异源六倍体。(4)柴油是植物细胞的代谢产物,要实现其工业化生产需将柴油树细胞培养到愈伤组织阶段,然后进行提取。突破突破2 2动物细胞工程动物细胞工程 1.动物细胞培养与动物体细胞核移植2.细胞融合的过程分析细胞融合的过程包括细胞膜融合、细胞质融合和细胞核融合,其中细胞膜融合是细胞融合的先导,在细胞膜融合中体现出细胞膜具有一定的流动性。3.单克隆抗体的制备(1)血清抗体与单克隆抗体名称产生特点血清抗体由浆细胞分泌一般从血清中分离,产量低、纯度低、特异性差单克隆抗体由杂交瘤细胞分泌特异性强,灵敏度高,能大量制备项目第一次筛选第二次筛选筛选原因诱导融合后得到多种杂交细胞,另外还有未融合的细胞由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激,所以经选择性培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞筛选方法用特定的选择培养基筛选:未融合的细胞和同种细胞融合后形成的细胞都会死亡,只有融合的杂交瘤细胞才能生长用多孔培养皿培养,在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化培养和抗体检测,经多次筛选得到能产生特异性抗体的细胞群筛选目的得到杂交瘤细胞得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞(2)制备单克隆抗体过程中的两次筛选(3)获取单克隆抗体的场所若在培养基中进行杂交瘤细胞培养,则从培养液中提取。若在小鼠或其他动物腹腔中培养,则从腹水中提取。1.下列关于动物细胞培养、植物组织培养和微生物培养的叙述,正确的是()A.培养基都需要加入琼脂B.所用的培养温度都相同C.都要经历脱分化和再分化过程D.都需要无菌培养条件考向考向1以基础判断或实例分析的形式以基础判断或实例分析的形式,考查动物细胞培养的特点及应用考查动物细胞培养的特点及应用D答案答案D动物细胞培养所用培养基为液体培养基,不用添加琼脂,A错误;动物细胞培养、植物组织培养和微生物培养所需培养温度不一定相同,B错误;只有植物组织培养才要经历脱分化和再分化过程,C错误;动物细胞培养、植物组织培养和微生物培养都需要无菌培养条件,D正确。2.(2016课标全国)下图表示通过核移植等技术获得某种克隆哺乳动物(二倍体)的流程。回答下列问题:(1)图中A表示正常细胞核,染色体数为2n,则其性染色体的组成可为。过程表示去除细胞核,该过程一般要在卵母细胞培养至适当时期再进行,去核时常采用的方法。代表的过程是。(2)经过多次传代后,供体细胞中的稳定性会降低。因此,选材时必须关注传代次数。(3)若获得的克隆动物与供体动物性状不完全相同,从遗传物质的角度分析其原因是。(4)与克隆羊“多莉(利)”培育成功一样,其他克隆动物的成功获得也证明了。答案答案(1)XX或XY显微操作胚胎移植(2)遗传物质(3)卵母细胞的细胞质中的遗传物质会对克隆动物的性状产生影响(4)动物已分化体细胞的细胞核具有全能性解析解析(1)因供体的性别不确定,故其细胞核内的性染色体组成为XX或XY;一般将卵母细胞培养到M中期,用显微操作法将其细胞核去除;代表的过程是胚胎移植。(2)传代培养10代以内的细胞可以保持正常的二倍体核型,超过10代以后,供体细胞中遗传物质的稳定性会降低。(3)克隆动物细胞质中的遗传物质来自卵母细胞的细胞质,细胞质中的遗传物质对克隆动物的性状会产生影响。(4)克隆动物的成功获得可以证明动物已分化的体细胞的细胞核具有全能性。3.将特定药物与单克隆抗体相结合制成的“生物导弹”,能够用于杀死人类某些癌细胞。其过程如图所示。下列相关叙述不正确的是()抗癌药物考向考向2以实例分析的形式以实例分析的形式,考查动物细胞融合与单克隆抗体的制备考查动物细胞融合与单克隆抗体的制备A.过程的原理和植物原生质体融合的原理基本相同B.经形成的杂交瘤细胞能无限增殖并产生单一抗体C.过程需要筛选并克隆单个杂交瘤细胞D.抗体的靶向作用使过程具有高度特异性答案答案B细胞融合后,需经过筛选才能获得既能无限增殖,又能产生单一抗体的杂交瘤细胞。4.(2018北京东城期末)中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)能够高效表达外源基因。科学研究中常使用重组CHO细胞(导入了重组载体的CHO细胞)大量生产外源蛋白,一般步骤为:.长期传代培养,获得大量重组细胞;.批式培养,获得大量外源蛋白。(1)体外培养动物细胞的基本培养液(BM)中除抗生素和一般营养物质外,还应含有。为了获得能生产抗体A的重组CHO细胞,需要将含有抗体A基因的重组载体通过法导入CHO细胞,经筛选获得重组CHO细胞。(2)研究发现,酵母抽提物(YE)在动物细胞培养和促进蛋白质表达中具有重要作用。为确定YE在不同培养阶段的使用策略,研究人员进行了下列实验。图1所示实验探究了在长期传代培养阶段对重组CHO细胞增殖以及抗体A表达量的影响。通过细胞计数和计算得出实验结果如图2所示,结果说明。此处理对后续批式培养中的细胞增殖及单个细胞的抗体产量基本无影响。图1图2进一步探究YE对批式培养阶段的影响,应在阶段、分别使用和进行培养。结果表明,抗体A的总产量随着YE浓度的提高而增加。综上所述,为提高抗体A的总产量,整个培养过程中对YE的使用策略是。答案答案(1)动物血清显微注射(2)不同浓度的YE较低浓度YE促进细胞增殖,较高浓度YE抑制细胞增殖BM添加不同浓度YE的BM传代培养过程中添加低浓度YE,批式培养过程中添加高浓度YE解析解析(1)体外培养动物细胞,培养基中除了添加抗生素和一般营养物质外,还应含有动物血清。因为要将重组载体导入动物细胞(仓鼠卵巢细胞),所以应采用显微注射法。(2)图1实验中后四组分别加入了1、2、5、10g/L的YE,因此是探究了长期传代培养阶段不同浓度YE对重组CHO细胞增殖以及抗体A表达量的影响。从图2中可看出YE浓度为0g/L时细胞数相对值(对照组)接近0.8,而YE浓度为1g/L时细胞数相对值高于对照组,YE浓度为2、5、10g/L时,细胞数相对值低于对照组,因此可得出结论:较低浓度YE促进细胞增殖,较高浓度YE抑制细胞增殖。为了研究YE对批式培养阶段的影响,应在阶段加入BM,阶段加入含不同浓度YE的BM。在整个培养过程中,长期传代培养应加入低浓度的YE,而批式培养应加入高浓度的YE,保证各时期均能产生较多抗体。