HIVHIV抗体检测原理和方法抗体检测原理和方法石嘴山市疾控中心石嘴山市疾控中心艾滋病初筛中心实验室艾滋病初筛中心实验室1 1HIV感染的实验室检测常用常用HIV病原学检测方法病原学检测方法: 病毒分离病毒分离 抗原检测抗原检测 核酸检测（核酸检测（ cDNA测定-PCR、 RNA测定-病毒载量） 其他方法：其他方法：逆转录酶测定、原位杂交常用常用HIV抗体检测方法抗体检测方法: ELISA 快速快速HIV检测检测 免疫印记法免疫印记法 （ Western Blot） 其他方法：其他方法：免疫荧光法（IFA）、放射免疫沉淀实验2 2抗原检测的目的（一）检测早期感染，缩短窗 口期 （可提前1-2周） HIV-P24抗原阳性仅作为HIV感染窗口期的辅助诊断依据，不能据此确诊3 3（二）新生儿的感染婴幼儿HIV抗体阳性不能用于诊断感染HIV婴幼儿体内从母亲得到的HIV抗体持续存在时间最长不超过18个月。在18月龄以前可以用多种不同的非抗体依赖性的检验方法对新生儿HIV感染进行辅助诊断，包括：HIV P24抗原检测、病毒分离培养、RNA或DNA测定。 18月龄以前婴幼儿感染HIV诊断要结合临床表现和实验室综合诊断。4 4抗体检测的目的输血输血和移植安全（为了接受者的安全）和移植安全（为了接受者的安全）监测监测(为了知晓为了知晓人群流行状况人群流行状况)临床临床HIV疾病的疾病的诊断诊断 (为了知晓为了知晓个体感染状况个体感染状况） 为了达到以上的某个目的的为了达到以上的某个目的的HIV 检测可能不适检测可能不适合其他目的，比如输血服务的检测不适合临床诊合其他目的，比如输血服务的检测不适合临床诊断断HIV感染感染5 5HIVHIV抗体检测抗体检测 HIV抗体检测分为筛查试验（包括初筛和复 检）和确认试验（WB)。（一）检测试剂 筛查试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、批检合格、临床评估质量优良、在有效期内的试剂。目前常用的筛查试剂有酶联免疫、颗粒凝集和其它快速诊断试剂。采供血机构进行血液筛查应采用HIV-1/2混合型酶联免疫试剂。自采自供血的单位必须进行HIV抗体检测。6 6（二）筛查方法1. 常用的筛查方法是酶联免疫试验（ELISA）目前国内外主要使用第三代（双抗原夹心法）试剂，少数使用第二代试剂。血源筛查仍以第三代ELISA为主，国际上有些国家和地区已将线性免疫酶测定（第四代ELISA试剂）用于血源筛查。第四代ELISA试剂是最近发展起来的HIV抗原抗体联合测定试剂，可同时检测P24抗原和抗HIV-1/2抗体。与第三代抗HIV-1/2试剂相比，检出时间提前了4-9.1d。其优点在于能同时检测抗原抗体，降低血源筛查的残余危险度。7 7酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验 Enzyme linked immunosorbent assayELISA的原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗体或抗原的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性 。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。 8 8ELISA的原理 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。9 9ELISA的原理加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。1010ELISA的类型的类型 双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体 双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原 间接法测抗体间接法测抗体 竞争法、捕获包被法等竞争法、捕获包被法等1111双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。加受检标本，保温反应。标本中的抗体与固相加受检标本，保温反应。标本中的抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。去其他未结合物质。加酶标抗原，保温反应。固相免疫复合物上的加酶标抗原，保温反应。固相免疫复合物上的抗体与酶标抗原结合，彻底洗涤未结合的酶标抗体与酶标抗原结合，彻底洗涤未结合的酶标抗原。抗原。加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗体的量。物。通过比色，测知标本中抗体的量。1212包被了包被了HIV 抗原的检测抗原的检测板板患者的抗体患者的抗体酶酶显色剂显色剂+ ve- ve酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验HIV 检测的介绍检测的介绍ELISA1313ELISA 板板质控质控阳性阳性阴性? 结果结果Introduction to HIV TestingModule 1 Sub Module 3 PPT021414 2 2、快速检测（、快速检测（RTRT）及其它检测）及其它检测 随着对HIV感染者和AIDS病人抗逆转录病毒治疗的进展，及对无症状HIV感染者提供自愿咨询检测（VCT）的迫切需求，简便、快速的HIV检测方法被广泛应用。常用的主要有以下几种：（1）明胶颗粒凝集试验（PA）：PA是HIV血清抗体检测的一种简便方法，是将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样品作用，混匀后保温（一般为室温）。当待检样品含有HIV抗体时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原-抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。PA试剂有两种，HIV-1和HIV-2抗原共同致敏的PA试剂（AFD HIV-1/2 PA），已经我国食品药品监督管理局（SFDA）注册批准；HIV-1、HIV-2抗原分别致敏的PA试剂（SERODIA-HIV-1/2）可初步区分HIV-1型和HIV-2型，目前我国尚未引进。1515 PA原理示意图1616（PA）检测结果的判定1717（2）斑点EIA或称斑点ELISA（dot-EIA）：以硝酸纤维膜为载体，将HIV抗原滴在膜上成点状，即为固相抗原。加血清样品作用，以后步骤同ELISA。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在10 min以内，使用抗原量少。1818（3）斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验金标纸条采用双抗原夹心法免疫测定原理，选择经纯化的基因工程制备的gp36、gp41、p24抗原作为包被抗原和gp41、gp36基因工程抗原和p24合成肽作为胶体金结合抗原。当待检标本中含有HIV抗体时，先和金标记抗原结合，由于层析作用反应复合物沿硝酸纤维膜向前移动，当遇到包被抗原时，形成Ag-Ab-Ag-Au复合物而富集在包被线上，形成红色沉淀线。同时在包被膜上还有一条质控线对照，故当有两条红线时判为阳性，只有一条红线时，判为阴性。 1919金标法试剂 试剂稳定，可室温长期保存。试验时不需任何设备，迅速、简便、特异性较好，敏感性约相当于中度敏感的ELISA，适用于应急检测、门诊急诊个体检测。目前已有在国内被SFDA批准注册的国外进口试剂和国内产品。一般可在1030min内判读结果。2020无反应无反应2121反应反应2222无意义无意义2323无意义无意义2424无意义无意义2525无意义无意义2626金标法（胶体硒法）结果判定2727（4）艾滋病唾液检测卡：在硝酸纤维膜上包被人工合成的HIVgp41/gp36蛋白抗原，可同时检测含在唾液中的HIV-1/HIV-2抗体，原理为酶免疫间接法。主要检测唾液中的HIV IgA与IgG抗体，敏感性特异性与ELISA相近，可避免静脉穿刺。但样品预处理时间长且售价较高。以唾液为样品测定HIV抗体的ELISA、免疫印迹法（WB）试剂已经美国FDA批准 。（5）其它快速筛查试验方法： 家庭HIV检测（Home Access System）等。2828快速HIV检测与常规HIV检测快速*平均45分钟（10分钟2.5小时）常规平均3.5小时（94分钟16小时）* 一般不要特殊设备，试剂可不用冰箱存放2929快速试剂的局限性一般不用于血液筛查（除5年行动计划）有一定的假阳性反应，如作为临床诊断，要复检和确认有一定的假阴性反应（尤其暴露时间3个月）随访检测（解释检测前后咨询必要性）3030（三）筛查试验步骤根据检测目的选用符合要求的筛查试剂对样品进行初筛和重复检测（复检）初筛试验：以第三代ELISA（双抗原夹心法）梅里埃试剂为例。 （1）实验准备：试验开始前将试剂和样品放置在室温(1823), 按实验室SOP做好试剂准备。 磷酸盐缓冲液：若液体内有结晶,应放置在37直至溶解，用蒸馏水1：25稀释浓缩液，4保存2周。 TMB底物液：使用前配制，TMB液和过氧化脲液等量混匀。 1M硫酸终止液：85 ml蒸馏水中加入5 ml浓硫酸。 备好试剂盒、待检样品和外部对照质控血清后，按试剂盒说明书以及质控和安全防护要求进行筛查检测。3131（2）实验操作装好所需使用数目的孔条,每孔均加入100l样品稀释液。设3个阴性对照孔，1个HIV-1阳性对照孔，若需要可再设1个HIV-2阳性对照孔。每孔加入50l待检样品及对照（对照要后加），未用孔用样品稀释液加满以溶解结合物球，以免堵塞洗板机孔。可震摇15S，372孵育605min。置洗板机上洗涤6遍（用洗液将反应孔完全加满,静置3060S,共洗涤6遍，洗完后孔上方及底部不应残存液体.）。每孔加入100l底物液，勿搅动，室温避光孵育302min。每孔加入100l 1M硫酸终止反应，充分混匀。在2h内置于酶标仪读数，单波长450nm，或双波长450/630nm测OD值。3232（3）实验结果阴性对照（NC），HIV-1阳性对照（PC1），HIV-2阳性对照（PC2） NC 必须0.25方可用，排除NC0.25的值，计算NC平均值。 NC界限范围：0.6倍NC均值NC1.4倍NC均值。符合以下条件的实验成立： 两个以上的NC可用。 PC1-NC均值 0.4，PC2-NC均值 0.4Cut off值 = 阴性对照均值 + 0.100 小于Cut off为阴性，大于或等于Cut off为阳性（4）报告：对呈阴性反应的样品，可由实施检测的实验室出具HIV抗体阴性报告；对呈阳性反应的样品，须进行复检，不能出阳性报告。3333（四）检测要点1、筛查试验阳性不能出阳性报告2、严格按照试剂说明书操作，不得擅自更改。3、注意防止交叉污染。4、严格遵守实验室标准操作规程（SOP）。 （五）检测程序及流程图1、筛查试验 标本验收合格后，用筛查试剂进行检测，如呈阴性反应，报告HIV抗体阴性；对呈阳性反应的标本，须进行重复检测。34342 2、重复检测、重复检测 对筛查呈阳性反应的标本用原有试剂和另外一对筛查呈阳性反应的标本用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的试剂重复检测。如两种种不同原理或不同厂家的试剂重复检测。如两种试剂复测均呈阴性反应，则报告试剂复测均呈阴性反应，则报告HIVHIV抗体阴性；如抗体阴性；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病确认实均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病确认实验室进行确认。应尽可能将重新采集的受检者血验室进行确认。应尽可能将重新采集的受检者血液标本和原有标本一并送检。液标本和原有标本一并送检。（六）初筛试验结果的报告 对HIV抗体筛查试验，呈阴性反应者可出具“HIV抗体阴性”报告（可用附表1）；对初筛试验呈阳性反应者不能出阳性报告，可出具“HIV抗体待复查”报告（附表1）。3535筛查试验的流程图筛查试验的流程图 样品样品筛查检测筛查试剂阳性反应阴性反应原有试剂加另外一种筛查试剂重复检测一阴一阳均阴性反应均阳性反应阴性报告送确认实验室进行确认3636谢谢 谢谢3737