第十章第十章外源基因表达与外源基因表达与基因工程药物基因工程药物20052005年全世界约有糖尿病患者年全世界约有糖尿病患者1.81.8亿亿, ,我国约我国约60006000万。万。治疗糖尿病特效药治疗糖尿病特效药胰岛素。胰岛素。每每100kg 100kg 猪或牛的胰腺中仅可提取猪或牛的胰腺中仅可提取4 45g5g。19791979年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌内，年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。基因工程方法生基因工程方法生产蛋白蛋白质药物的物的优势是非常明是非常明显的的23 万美元万美元 / 病人病人 200300 美元美元 / 病人病人l胰岛素胰岛素l人生长激素人生长激素l干扰素干扰素l白细胞介素白细胞介素2l粒细胞集落刺激因子粒细胞集落刺激因子l粒细胞巨噬细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子l红细胞生成素红细胞生成素 EPOl组织纤溶酶原激活剂组织纤溶酶原激活剂l生长激素生长激素l促生长素促生长素l抗血友病因子抗血友病因子l脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶l葡糖脑苷脂酶葡糖脑苷脂酶l鼠单克隆抗体鼠单克隆抗体基因工程的产物：多彩小鱼多彩小鱼转基因小鼠转基因小鼠转基因小猪转基因小猪辣椒香蕉辣椒香蕉蓝色玫瑰蓝色玫瑰黑籽番茄黑籽番茄DNA(DNA(基因基因基因基因) )mRNA mRNA 蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质( (性状性状性状性状) )转录转录转录转录翻译翻译翻译翻译思考：基因的表达与基因的什么过程有关？思考：基因的表达与基因的什么过程有关？密码子在生物界是的！密码子在生物界是的！密码子在生物界是的！密码子在生物界是的！通用通用基因表达基因表达l指基因通过指基因通过转录转录和和翻译翻译而产生其而产生其蛋白产物蛋白产物，或，或转录后直接产生其转录后直接产生其RNA产物产物的过程。的过程。外源外源基因表达基因表达l利用利用细胞内相关酶系细胞内相关酶系及其及其调控系统调控系统，将，将外源外源基基因因转录转录成成mRNA，进而，进而翻译翻译成肽链或成肽链或加工加工成活成活性蛋白质的过程。性蛋白质的过程。学习要求学习要求l掌握：掌握：基因表达的基本原理，外源基基因表达的基本原理，外源基因表达的基本过程。因表达的基本过程。l熟悉：熟悉：外源基因表达的基本类型，外外源基因表达的基本类型，外源基因表达源基因表达载体载体的基本组成与功能。的基本组成与功能。l了解：了解：外源基因表达在生产基因工程外源基因表达在生产基因工程药物中的应用。药物中的应用。指在指在生物体外，通过对生物体外，通过对DNADNA分子进行人工分子进行人工“剪剪切切”和和“拼接拼接”，对生物的基因进行，对生物的基因进行改造改造和和重重新组合新组合，然后，然后导导入受体（宿主）细胞入受体（宿主）细胞内使之持内使之持续稳定续稳定繁殖繁殖，目的基因扩增、表达，获得人类目的基因扩增、表达，获得人类所需的所需的产品产品的工程的工程。（一（一）外源基因表达（基因工程）的）外源基因表达（基因工程）的概念概念基因工程又叫基因工程又叫基因拼接技术基因拼接技术或或DNADNA重组技术重组技术。又称为又称为基因克隆（基因克隆（gene cloning）或或分子克隆（分子克隆（molecular cloning）。）。克隆（克隆（ cloning ）：）：指指无性繁殖系无性繁殖系，即由一个细胞经过无，即由一个细胞经过无性繁殖后所形成的子代群体。性繁殖后所形成的子代群体。外源基因表达基本类型外源基因表达基本类型l根据根据宿主细胞宿主细胞不同：不同：原核细胞表达系统；真核原核细胞表达系统；真核细胞表达系统。细胞表达系统。l根据根据表达产物表达产物在宿主细胞在宿主细胞生成的部位生成的部位不同：不同：胞胞内表达、定位表达、分泌表达。内表达、定位表达、分泌表达。l根据根据表达产物表达产物的的溶解溶解状况不同：状况不同：可溶性表达、可溶性表达、包涵体表达。包涵体表达。l根据根据表达产物表达产物的的结构状况结构状况不同：不同：非融合表达；非融合表达；融合表达。融合表达。 目的基因目的基因目的基因目的基因基因载体基因载体基因载体基因载体重组体重组体重组体重组体分切接转筛表总总体体技技术术路路线线外源基因表达（基因工程）的基本过程外源基因表达（基因工程）的基本过程：（1 1）分分离离：提取和提取和获得目的基因获得目的基因和和载体载体DNADNA；（2 2）切切割割：分别对：分别对目的基因目的基因和载体和载体DNADNA酶切酶切；（3 3）连连接接：用：用DNADNA连接酶连接酶连接连接目的基因与载体，形成目的基因与载体，形成 新的新的重组重组DNADNA分子分子；（4 4）转转化化：用重组用重组DNADNA分子转化分子转化受体（宿主）细胞受体（宿主）细胞；（5 5）筛筛选选：重组体在受体细胞中复制和遗传；对转化重组体在受体细胞中复制和遗传；对转化 子子筛选筛选和和鉴定鉴定；（6 6）表表达：达：对获得外源基因的细胞或生物体通过培对获得外源基因的细胞或生物体通过培 养，养，获得获得所需的遗传所需的遗传性状性状或或表达出表达出所需要所需要 的的产物产物。 基因工程的重大意义基因工程的重大意义1)1) 重组重组DNADNA技术填平了生物种属间不可逾越技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟。的鸿沟。 跨越天然物种屏障，将原核和真核生物、跨越天然物种屏障，将原核和真核生物、植物和动物，造福人类，在过去人们难以置植物和动物，造福人类，在过去人们难以置信的事情，现在已成为现实。信的事情，现在已成为现实。（2）利用重组）利用重组DNA技术可以在体外大技术可以在体外大量扩增、纯化人们感兴趣的基因，研究量扩增、纯化人们感兴趣的基因，研究其结构、功能及调控机制，从而拓宽了其结构、功能及调控机制，从而拓宽了分子生物学的研究领域。分子生物学的研究领域。 （3 3）医学上应用更为广泛，涉及各领域）医学上应用更为广泛，涉及各领域正常人类生命活动的分子机制；正常人类生命活动的分子机制；人类各种疾病发生的分子机理；人类各种疾病发生的分子机理；人类各种疾病如遗传性疾病、肿瘤、肥胖、人类各种疾病如遗传性疾病、肿瘤、肥胖、心血管疾病、传染病等病因的心血管疾病、传染病等病因的 查明、诊断、查明、诊断、治疗和预防。治疗和预防。药物的研发和生产药物的研发和生产；疾病模型的建立；疾病模型的建立；人类的营养、健康、长寿和保健（亚健康）人类的营养、健康、长寿和保健（亚健康） 本章节的地位：现代科技革命现代科技革命高新技术高新技术生物技术生物技术（生物工程）（生物工程）基因工程基因工程基因克隆基因克隆 分子遗传学理论上的六大进展解决了分子遗传学理论上的六大进展解决了l生命现象的遗传物质基础（均是核酸）生命现象的遗传物质基础（均是核酸）l结构模型（同类构件、双螺旋）结构模型（同类构件、双螺旋）l复制方式（相似的机制）复制方式（相似的机制）l遗传信息流动方向（共同的中心法则）遗传信息流动方向（共同的中心法则）l遗传密码（共用一套相同的密码）遗传密码（共用一套相同的密码）l表达和调控的机理（类同的方法）表达和调控的机理（类同的方法）l基因突变机理、意义（变异与进化）基因突变机理、意义（变异与进化） 为基因工程技术的诞生典定了理论基础。为基因工程技术的诞生典定了理论基础。 理论上的可行性。理论上的可行性。 科技探索之路：基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程早早期期基基础础理理论论孟德尔孟德尔孟德尔孟德尔提出基因的提出基因的提出基因的提出基因的分离定律分离定律分离定律分离定律和和和和自由组合定律自由组合定律自由组合定律自由组合定律科技探索之路：基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程早早期期基基础础理理论论摩尔根摩尔根摩尔根摩尔根证明证明证明证明基因在染色体上基因在染色体上基因在染色体上基因在染色体上， 并提出基因的并提出基因的并提出基因的并提出基因的连锁互换定律连锁互换定律连锁互换定律连锁互换定律。科技探索之路：基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程早早期期基基础础理理论论艾弗里艾弗里艾弗里艾弗里证明证明证明证明DNADNADNADNA是主要遗传物质是主要遗传物质是主要遗传物质是主要遗传物质，DNADNADNADNA可可可可从一种生物个体从一种生物个体从一种生物个体从一种生物个体转移转移转移转移到另一种生物个体。到另一种生物个体。到另一种生物个体。到另一种生物个体。科技探索之路：基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程早早期期基基础础理理论论 沃森沃森沃森沃森、克里克克里克克里克克里克提出提出提出提出DNADNADNADNA的的的的双螺旋结构双螺旋结构双螺旋结构双螺旋结构模型。模型。模型。模型。科技探索之路：基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程早早期期基基础础理理论论梅塞尔松梅塞尔松梅塞尔松梅塞尔松、斯塔尔斯塔尔斯塔尔斯塔尔证明证明证明证明DNADNADNADNA的的的的半保留复制半保留复制半保留复制半保留复制科技探索之路：基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程早早期期基基础础理理论论克里克克里克克里克克里克等提出等提出等提出等提出中心法则中心法则中心法则中心法则DNADNADNADNARNARNARNARNA蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质转录转录转录转录翻译翻译翻译翻译逆转录逆转录逆转录逆转录复制复制复制复制科技探索之路：基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程早早期期基基础础理理论论1963196319631963年年年年尼伦伯格尼伦伯格尼伦伯格尼伦伯格和和和和马太马太马太马太破译编码氨基酸的破译编码氨基酸的破译编码氨基酸的破译编码氨基酸的遗传密码遗传密码遗传密码遗传密码，1966196619661966年年年年霍拉纳霍拉纳霍拉纳霍拉纳用实验加以证明。用实验加以证明。用实验加以证明。用实验加以证明。二、分子遗传学新方法是二、分子遗传学新方法是基因工程的技术基础基因工程的技术基础l首当其冲的是要解决：首当其冲的是要解决： 如何自如地得到目的基因；如何自如地得到目的基因； 如何在体外改造基因，得到重如何在体外改造基因，得到重 组体；组体； 在体外转移重组基因；在体外转移重组基因；l直到直到2020世纪世纪7070年代中期，相继出现了年代中期，相继出现了 几项关键性技术，梦想成真。几项关键性技术，梦想成真。 基因操作的工具基因操作的工具基因操作的工具基因操作的工具基因的基因的剪刀剪刀限制性核酸内切限制性核酸内切酶酶基因的基因的针线针线DNA DNA 连接酶连接酶运载体运载体 （如质粒、（如质粒、噬菌体和动噬菌体和动植物病毒等）植物病毒等） 基因的运基因的运输工具输工具一把特殊的剪刀一把特殊的剪刀限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现阿尔伯阿尔伯(Arber)(Arber)、史密斯史密斯(Smith)(Smith)和内森斯和内森斯(Nathans)(Nathans)，获获19781978年诺贝尔生理学和医学奖年诺贝尔生理学和医学奖限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE) 是一类由细菌产生的能是一类由细菌产生的能专一识别专一识别双链双链DNA中的中的特特定碱基序列定碱基序列、并由此切割、并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切双链结构的核苷酸内切酶，简称酶，简称限制酶限制酶或或切割酶切割酶。 根据酶的功能、大小和反应条件，及切割根据酶的功能、大小和反应条件，及切割的特点，可以将限制性内切酶分为三类：的特点，可以将限制性内切酶分为三类： 型酶、型酶、型酶、型酶、 型酶型酶限制酶（限制酶（型）型）l特异识别及切割特异识别及切割4 8个个bp长度且具有长度且具有回文序列回文序列的的DNA片断片断l回文序列回文序列：是指该部位的核苷酸序列呈：是指该部位的核苷酸序列呈180O旋旋转对称转对称;限限制制性性内内切切酶酶能能识识别别特特定定的的碱碱基基序序列列限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶l命名：命名：l大肠杆菌：大肠杆菌：Escherichia coli；EcoR(E：属属名；名；co：种名；种名；R：株；株；：发现次序：发现次序)；流感嗜血菌：流感嗜血菌：Haemophilus influenzae; HindIII2.同同裂裂酶酶(异异源源同同工工酶酶)：凡凡来来源源不不同同但但识识别别和切割同样的核苷酸序列的限制性酶。和切割同样的核苷酸序列的限制性酶。3.同同尾尾酶酶：来来源源、识识别别顺顺序序、切切割割方方式式不不同同，但但所所生生成成的的限限制制性性片片段段是是相相同同的的粘粘性性末末端端限制酶切出的末端限制酶切出的末端l粘性末端（粘性末端（sticky end）:两条链上的断裂位置是两条链上的断裂位置是交错的、但又是围绕着一个轴线对称排列，其结交错的、但又是围绕着一个轴线对称排列，其结果产生果产生两个互补的单链末端两个互补的单链末端，这种单链末端由于，这种单链末端由于可以互补成双链结构可以互补成双链结构，所以称为粘性末端。，所以称为粘性末端。l平末端（平末端（blunt end）: 在识别序列内同一位置上在识别序列内同一位置上的核苷酸处进行切割，产生的的核苷酸处进行切割，产生的DNA片段不带粘性片段不带粘性末端而是没有单链突出的平齐末端。末端而是没有单链突出的平齐末端。作用特点断开磷酸二酯键断开磷酸二酯键EcoR黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端作用特点断开磷酸二酯键断开磷酸二酯键Sma平末端平末端 平末端平末端限制性内切酶造成限制性内切酶造成粘性末端粘性末端有利于重组有利于重组DNA 分子的构建分子的构建“分子缝合针”DNA连接酶1种类种类 ： E Ecolicoli DNA DNA连接酶连接酶 T4 DNAT4 DNA连接酶连接酶2作用：作用：恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间 的磷酸二酯键。的磷酸二酯键。3作用原理：作用原理：催化磷酸二酯键形成催化磷酸二酯键形成1.EcoliDNA连接酶或T4DNA连接酶恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键2.T4DNA连接酶T T4 4 DNA DNA连接酶连接酶连接酶连接酶还可把还可把还可把还可把平末端之间的缝隙平末端之间的缝隙平末端之间的缝隙平末端之间的缝隙“ “缝合缝合缝合缝合” ”起来，起来，起来，起来，但效率较低但效率较低但效率较低但效率较低T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶3.连接酶类型总结类型EcoliEcoliDNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶来源来源来源来源功能功能功能功能大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌T T4 4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体恢复恢复恢复恢复磷酸磷酸磷酸磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键只能连接只能连接只能连接只能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端能连接能连接能连接能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端和和和和平末端平末端平末端平末端( (效率较低效率较低效率较低效率较低) )相同点相同点相同点相同点差别差别差别差别比较：DNA连接酶与DNA聚合酶DNA聚合酶DNA连接酶区别区别1 1区别区别2 2相同点相同点1)1)只能将只能将单个核苷酸单个核苷酸连连接到已有的核酸片段上，接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键形成形成磷酸二酯键磷酸二酯键1)1)在在两个两个DNADNA片段之片段之间间形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键2)2)以以一条一条DNADNA链为模板链为模板，将将将将单个核苷酸单个核苷酸单个核苷酸单个核苷酸通过磷酸通过磷酸通过磷酸通过磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键连接成一条互补连接成一条互补的的DNADNA链链2)2)将将DNADNA双链上的双链上的两个两个缺口同时连接缺口同时连接起来，起来，不需要模板不需要模板DNA限制酶限制酶和和连接酶连接酶的发现使的发现使基因工程从理论走向了实验室基因工程从理论走向了实验室载载 体（体（Vector） 载体载体(vector)(vector)是将外源是将外源DNA(DNA(目的目的DNA)DNA)片断片断引入宿主细胞进行扩增或表达的引入宿主细胞进行扩增或表达的运载工具运载工具，其其化学本质为化学本质为DNADNA 。常用的载体分为常用的载体分为3 3类：类：质粒、噬菌体和病毒质粒、噬菌体和病毒作为载体的条件作为载体的条件 l能独立复制能独立复制l具备多个限制酶的识别位点具备多个限制酶的识别位点( (多克隆位点多克隆位点) )l具有遗传表型或筛选标记具有遗传表型或筛选标记l有足够的容量以容纳外源有足够的容量以容纳外源DNADNA片段。片段。l表达型载体表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的启动还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、增强子等调控元件。子、前导序列、增强子等调控元件。l载体载体DNADNA中均有一段非必需区，将外源基因插入中均有一段非必需区，将外源基因插入 该非必需区，而载体本身不受影响。该非必需区，而载体本身不受影响。 常用的载体有：常用的载体有：1. 质粒（质粒（plasmidplasmid ）是存在于细菌染色体外是存在于细菌染色体外的、能自主复制的的、能自主复制的环状双链环状双链小分子小分子DNA，适，适于做小片断基因的载体。于做小片断基因的载体。2. 噬菌体噬菌体DNA线状双链线状双链DNA，适于做大片适于做大片断基因的载体断基因的载体。大肠杆菌的质粒载体大肠杆菌的质粒载体氨苄青霉素抗性基因：氨苄青霉素抗性基因：ampr；四环素抗性基因：四环素抗性基因：tetr；DNA复制起点：复制起点：ori 用用质质粒粒构构建建重重组组DNA分分子子克隆载体克隆载体以以扩增扩增DNA片断为目的，片断为目的，并不需要得到目并不需要得到目的基因所编码蛋白质的载体，的基因所编码蛋白质的载体，适用于外源基因的重组、克隆、复制与保存；适用于外源基因的重组、克隆、复制与保存；克隆载体常带有克隆载体常带有一个松弛型复制子一个松弛型复制子，一个，一个多多克隆位点、筛选标记克隆位点、筛选标记J分分类类：质质粒粒、噬噬菌菌体体、黏黏性性质质粒粒、M13噬噬菌体、酵母载体、真核细胞病毒载体菌体、酵母载体、真核细胞病毒载体1.常用的克隆常用的克隆载体载体l质粒和噬菌体质粒和噬菌体常用于常用于原核细胞原核细胞为宿为宿主的分子克隆，主的分子克隆，l病毒病毒则使用于则使用于真核细胞真核细胞为宿主的克为宿主的克隆隆（二）表达载体（二）表达载体|能使外源基因在宿主细胞能使外源基因在宿主细胞 中中转录和表达转录和表达的功能性载体。的功能性载体。itemClick to edit textClick to edit text1.很强启动子，能被宿主很强启动子，能被宿主RNA聚合酶识别聚合酶识别2.很强终止子很强终止子3.启动子只有在诱导状态时才能启动转录启动子只有在诱导状态时才能启动转录4.起始密码和起始密码和SD序列处在合适距离序列处在合适距离5.需复制原点，在载体内插入人工组成的多克隆位点需复制原点，在载体内插入人工组成的多克隆位点具备条件具备条件宿主（宿主（host）l能接纳重组子并实现重组子的外源基因转录、能接纳重组子并实现重组子的外源基因转录、扩增或表达的受体细胞。扩增或表达的受体细胞。l原核细胞：原核细胞：大肠埃希菌、芽胞杆菌等。属于原大肠埃希菌、芽胞杆菌等。属于原核细胞表达系统。核细胞表达系统。l真核细胞：真核细胞：酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞。属于真核细胞表达系统。胞。属于真核细胞表达系统。 1972年，美国斯坦福大年，美国斯坦福大学学Berg博士领导的一个研博士领导的一个研究小组，率先完成了世界究小组，率先完成了世界上第一次成功的上第一次成功的DNA体外体外重组实验，基因工程从此重组实验，基因工程从此诞生。诞生。 目的基因目的基因目的基因目的基因基因载体基因载体基因载体基因载体重组体重组体重组体重组体分切接转筛表总总体体技技术术路路线线基因工程的主要步骤基因工程的主要步骤1. 1. 从生物有机体的基因组中，从生物有机体的基因组中，分离分离出带出带目的基因目的基因的的DNADNA片段片段- -目的基因的获得目的基因的获得。2. 2. 将带目的基因的外源将带目的基因的外源DNADNA片段，片段，连接连接到能自我复制的载体分子到能自我复制的载体分子上，形成上，形成重组重组DNADNA分子分子- - DNADNA分子重组分子重组。3. 3. 将重组将重组DNADNA分子分子转移转移到适当的受体细胞内到适当的受体细胞内-导入导入。4.4. 筛选筛选获得了重组获得了重组DNADNA分子的受体细胞进行克隆分子的受体细胞进行克隆-分子克隆分子克隆。5. 5. 克隆基因的克隆基因的表达表达，产生出人类所需要的物质，产生出人类所需要的物质-基因表达基因表达。1.1.目的基因制备和常用分离方法目的基因制备和常用分离方法目的基因：目的基因：指已被或者准备要被分离、改造、指已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或扩增或表达的特定基因或DNA片段。通常是片段。通常是人们需要的生物活性物质的人们需要的生物活性物质的编码基因编码基因。目的基因的获得目的基因的获得1. 人工化学合成人工化学合成概述：概述：1979年采用化学方法合成基因；年采用化学方法合成基因；只要合成出具有特定序列的寡核苷酸片只要合成出具有特定序列的寡核苷酸片断，通过断，通过DNA连接酶的作用，可使其连接酶的作用，可使其 按照一定的顺序进行共价连接而成按照一定的顺序进行共价连接而成PCR扩增技术扩增技术聚合酶链式反应，体外扩增特定聚合酶链式反应，体外扩增特定基基因因序列的方法。是有引物介导的特序列的方法。是有引物介导的特定定DNA序列的酶扩增，能将序列的酶扩增，能将pg水平水平的的DNA特异扩增特异扩增100万倍万倍(ug)。据碱基配对原理，在据碱基配对原理，在DNA聚合酶催聚合酶催化和化和dNTP的参与下，引物依赖于的参与下，引物依赖于DNA模板特异性引导模板特异性引导DNA合成；包合成；包括变性、退火、延伸三步组成的循环。括变性、退火、延伸三步组成的循环。PCR基基 本本原原 理理“I do my best thinking while driving”1993 Nobel prize 聚合酶链式反应聚合酶链式反应: :利用酶促反应在体外大量、利用酶促反应在体外大量、特异性扩增特异性扩增DNA片段。片段。把把寻找目的基因寻找目的基因和和扩增目的基因扩增目的基因两步操作并成一步。两步操作并成一步。three steps:How PCR worksDenaturation ( (变性变性): 90): 909797Annealing ( (退火退火): 45): 455555Extension ( (延伸延伸): ): around 72725 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍万倍以上。以上。Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 3. 3. 外源外源DNADNA片断导入受体（宿主）细胞片断导入受体（宿主）细胞 构建好的重组构建好的重组 DNA DNA 分子进入宿主细胞的分子进入宿主细胞的过程，称为过程，称为转化转化。如果接受异源。如果接受异源 DNA DNA 的的细胞不是细菌，而是动物细胞或植物细细胞不是细菌，而是动物细胞或植物细胞，常常称为胞，常常称为转染转染。 重组重组DNA导入大肠杆菌细胞导入大肠杆菌细胞 氯化钙转化法氯化钙转化法 转染法转染法 重组重组DNA导入哺乳动物细胞导入哺乳动物细胞 显微注射法显微注射法 DNA磷酸钙转染法磷酸钙转染法感受态细胞：感受态细胞：经处理能经处理能吸收重组吸收重组DNA分子的敏感分子的敏感状态宿主细胞状态宿主细胞4. 4. 筛选目的基因筛选目的基因1.目的基因导入受体细胞后，还需要经过筛目的基因导入受体细胞后，还需要经过筛 选，选， 才能确定真正所需要的目的基因。才能确定真正所需要的目的基因。2.根据载体的根据载体的选择性标记基因选择性标记基因的生物活性表现状的生物活性表现状况进行初步的甄别和筛选。况进行初步的甄别和筛选。3.用用PCR技术扩增进一步检测。技术扩增进一步检测。4.通过通过基因测序基因测序分析确证。分析确证。标记的DNA探针5. 5. 基因的表达基因的表达 克隆基因表达的三个条件：克隆基因表达的三个条件：l 基因的编码区不能被插入序列所中断基因的编码区不能被插入序列所中断;l 基因转录要有基因转录要有启动子启动子，而启动子必须能，而启动子必须能被宿被宿主细胞的主细胞的RNA多聚酶有效地识别多聚酶有效地识别;l mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外源蛋白质必须不被宿主细胞的蛋白酶所生的外源蛋白质必须不被宿主细胞的蛋白酶所降解降解.小结 基因工程主要包括基因工程主要包括几个过程几个过程：1 1、目的基因目的基因的制备；的制备；2 2、选择合适的载体，将目的基因与载体相连、选择合适的载体，将目的基因与载体相连 接生成接生成重组重组DNADNA分子分子；3 3、将重组、将重组DNADNA片段片段导入导入宿主细胞；宿主细胞；4 4、筛选筛选目的基因；目的基因；5 5、目的基因的、目的基因的表达表达基因工程的应用基因工程的应用l基因工程药物基因工程药物l制备疫苗制备疫苗l基因治疗基因治疗l转基因动物转基因动物l转基因植物转基因植物l工程菌工程菌1、 基因工程药物基因工程药物 生产基因工程药物的基本方法是，将生产基因工程药物的基本方法是，将目的基因目的基因用用DNADNA重组重组的方法的方法连接在载体连接在载体上，上，然后将载体然后将载体导入导入靶细胞（微生物，哺乳动靶细胞（微生物，哺乳动物细胞或人体组织靶细胞），使目的基因物细胞或人体组织靶细胞），使目的基因在靶细胞中得到在靶细胞中得到表达表达，最后将表达的目的，最后将表达的目的蛋白质蛋白质提纯提纯及作成制剂，从而成为及作成制剂，从而成为蛋白类蛋白类药或疫苗药或疫苗。2、制备基因工程疫苗制备基因工程疫苗 基因工程疫苗可以帮助解决传统技术难以解决的基因工程疫苗可以帮助解决传统技术难以解决的 一些特殊的病原体疫苗。一些特殊的病原体疫苗。如如，（1 1） 乙型肝炎病毒疫苗（乙型肝炎病毒疫苗（HBVHBV）、丙型肝炎病毒疫）、丙型肝炎病毒疫 苗（苗（HCVHCV）等；）等；（2 2） 有诱发致癌或产生免疫病理作用的疫苗，如人有诱发致癌或产生免疫病理作用的疫苗，如人 T T细胞免疫缺陷病毒（细胞免疫缺陷病毒（HITV-1HITV-1）等；）等；（3 3） 常规效果较差的疫苗，如霍乱和痢疾疫苗等常规效果较差的疫苗，如霍乱和痢疾疫苗等（4 4） 制备一些多价疫苗等。制备一些多价疫苗等。常见的基因工程药物1.干扰素系列，肝炎病毒复制抑制、肿瘤治疗干扰素系列，肝炎病毒复制抑制、肿瘤治疗2. 白细胞介素系列白细胞介素系列 肿瘤、免疫增强肿瘤、免疫增强3. EPO（促红细胞生成素）促红细胞生成素） 促进红血球增生、治疗促进红血球增生、治疗贫血贫血4. G-CSF 促进粒细胞增生促进粒细胞增生5. TPO 促进血小板生长促进血小板生长6. EGF 促进表皮细胞生长促进表皮细胞生长7. NGF 促进神经细胞生长促进神经细胞生长8. 单克隆抗体系列单克隆抗体系列9. 基因工程疫苗基因工程疫苗基因工程的安全性和社会伦理问题基因工程的安全性和社会伦理问题 科学技术科学技术 是一把双刃剑，带来巨大利益，同是一把双刃剑，带来巨大利益，同时也带来了潜在威胁和社会伦理问题。时也带来了潜在威胁和社会伦理问题。 基因工程的发展离不开社会伦理道德的制约。基因工程的发展离不开社会伦理道德的制约。思思 考考 题题 1.名词解释：基因工程、克隆载体名词解释：基因工程、克隆载体 、表达载体、表达载体 2.基因工程的内容和步骤是什么？基因工程的内容和步骤是什么？ 3.基因工程的载体具有哪些特点？基因工程的载体具有哪些特点？ Thats AllThank you!哈哈， 下 课 了 ! 基因工程生产胰岛素的原理（示意图）基因工程生产胰岛素的原理（示意图） DNA连接酶连接酶连接的部位：连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手）磷酸二酯键（梯子的扶手） 不是氢键（梯子的踏板）不是氢键（梯子的踏板）原核生物的限制原核生物的限制-修饰现象修饰现象1.2 未知基因的获得未知基因的获得基因组文库（基因组文库（genomic library），），也称为基因也称为基因文库（文库（gene library）。包含某种生物整个基因）。包含某种生物整个基因组序列（外显子和内含子）的重组组序列（外显子和内含子）的重组DNA克隆群克隆群体。体。基因组文库构建基因组文库构建基因文库构建流程图基因文库构建流程图基因组文库的制备步骤：基因组文库的制备步骤：1.1.纯化全细胞纯化全细胞DNADNA；2.2.部分限制性酶切得到部分限制性酶切得到适当大小的片段；适当大小的片段；3.3.插入到合适的载体上；插入到合适的载体上；4.4.转化受体菌，获得含转化受体菌，获得含不同不同DNADNA片段的克隆群。片段的克隆群。5.5.重组重组DNADNA的筛选和鉴的筛选和鉴定。定。cDNA文库（文库（cDNA library）：利用纯化的）：利用纯化的细胞和组织总细胞和组织总RNA，在逆转录酶作用下合，在逆转录酶作用下合成互补的成互补的DNA及及cDNA（complementary DNA），构建），构建cDNA序列的重组序列的重组DNA克隆克隆群体，是具有表达功能外显子序列的总和。群体，是具有表达功能外显子序列的总和。cDNA文库构建文库构建cDNAcDNA文库的构建过程：文库的构建过程：dmRNAmRNA的提取及其完整性的确定；的提取及其完整性的确定；dcDNAcDNA的合成和克隆；的合成和克隆；d目的目的cDNAcDNA的鉴定等步骤。的鉴定等步骤。方法：方法：合成合成cDNA第一链第一链 5AAAAAA 3 mRNA TTTTTTT 5 cDNA 1 Oligo(dT)，反转录酶反转录酶 d NTP, 合成合成cDNA第二链第二链 AAAAAA 3 cDNA 2 TTTTTTT 5 RNase H，DNA聚合酶聚合酶, dNTP 5 AAAAAA 3 双链双链 cDNA 3 TTTTTTT 5（1 1）获得目的基因，）获得目的基因，DNADNA的提的提 取、纯化和取、纯化和DNADNA分子的克分子的克 隆，隆，建立文库建立文库。（2 2）制备活性多肽产品：激素、）制备活性多肽产品：激素、 细胞因子、多肽药物疫苗细胞因子、多肽药物疫苗 等，等，诊断和防治疾病诊断和防治疾病。（3 3）研究）研究基因结构、功能基因结构、功能等等基因工程的目的基因工程的目的