微工微工-2第二章第二章决定工业生产水平的三个要素：决定工业生产水平的三个要素： 生产菌种的性能； 发酵及提纯工艺条件； 生产设备；分离与筛选的设计要求分离与筛选的设计要求在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：1 1、菌的营养特征、菌的营养特征一般要求采用廉价的培养基或使用来源丰一般要求采用廉价的培养基或使用来源丰富的原料富的原料2 2、菌的生长温度、菌的生长温度3 3、菌的稳定性、菌的稳定性4 4、菌的产物得率和产物在培养液中的浓度、菌的产物得率和产物在培养液中的浓度5 5、菌对所采用的设备和生产过程的适应性、菌对所采用的设备和生产过程的适应性6 6、容易从培养液中回收产物、容易从培养液中回收产物3-63-6是用来衡量菌种的生产性能，如能满足这几条，是用来衡量菌种的生产性能，如能满足这几条，便有希望成为效益高的生产菌株便有希望成为效益高的生产菌株二、含微生物样品的采集二、含微生物样品的采集较复杂；应根据分离目的灵活掌握较复杂；应根据分离目的灵活掌握土壤（土壤（丰富、丰富、5-25cm、土质、酸碱度、植被状况、地理条件、季节）、土质、酸碱度、植被状况、地理条件、季节）食品食品、海水、动物、植物、极端环境、海水、动物、植物、极端环境根据微生物的营养类型采样根据微生物的营养类型采样森林土中有相当多枯枝落叶森林土中有相当多枯枝落叶和腐烂的木头，富含纤维素，和腐烂的木头，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源的纤适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长。维素酶产生菌生长。肉类加工厂附近、饭店排污沟，易分离到蛋白酶和脂肪酶产生肉类加工厂附近、饭店排污沟，易分离到蛋白酶和脂肪酶产生菌。面粉加工厂等场所易分离到产淀粉酶、糖化酶的菌菌。面粉加工厂等场所易分离到产淀粉酶、糖化酶的菌极端环境极端环境：高等动植物不能生长，大多数微生物高等动植物不能生长，大多数微生物不能生活的高温、低温、强碱、强酸不能生活的高温、低温、强碱、强酸、高盐、高压、高辐射、等特殊环境。、高盐、高压、高辐射、等特殊环境。极端嗜热菌极端嗜热菌，最适生长温度最适生长温度90105，高达，高达110极端嗜冷菌极端嗜冷菌，可在零下，可在零下7080摄氏度度生长。摄氏度度生长。极端嗜盐菌极端嗜盐菌，新疆盐湖中的可耐受，新疆盐湖中的可耐受2030的的NaCl极端嗜碱菌，极端嗜碱菌，pH910极端嗜压菌极端嗜压菌，在深海底，生活压力，在深海底，生活压力7.18.1107Pa根据微生物的生理特性采样根据微生物的生理特性采样筛选高温酶产生菌通常从温泉、火山爆发处、堆肥等采样；筛选高温酶产生菌通常从温泉、火山爆发处、堆肥等采样；筛选产低温酶的微生物，可从冰筛选产低温酶的微生物，可从冰窖、南极、深海等采样窖、南极、深海等采样分离耐高渗透压酵母菌，可到甜分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样2.1.3 标本的预处理 预处理目的： 提高菌种分离效率方法方法方法方法 处理方式处理方式处理方式处理方式 材料材料材料材料 分离出的菌株分离出的菌株分离出的菌株分离出的菌株 物理方法物理方法物理方法物理方法 加热：加热：加热：加热：5555，6 6分钟分钟分钟分钟100100， 1 1小小小小 时时时时 4040，2626小时小时小时小时膜过滤法膜过滤法膜过滤法膜过滤法离心法离心法离心法离心法在沉淀池中搅拌在沉淀池中搅拌在沉淀池中搅拌在沉淀池中搅拌水、土壤、粪肥水、土壤、粪肥水、土壤、粪肥水、土壤、粪肥土壤、根土土壤、根土土壤、根土土壤、根土水水水水海水海水海水海水 污泥污泥污泥污泥发霉的稻草发霉的稻草发霉的稻草发霉的稻草 嗜嗜嗜嗜粪粪粪粪红红红红球球球球菌菌菌菌( (Rhodococcus Rhodococcus coprophilus)coprophilus)小单孢菌属等。小单孢菌属等。小单孢菌属等。小单孢菌属等。链霉菌属、马杜拉菌属，小双孢菌属。链霉菌属、马杜拉菌属，小双孢菌属。链霉菌属、马杜拉菌属，小双孢菌属。链霉菌属、马杜拉菌属，小双孢菌属。链霉菌属链霉菌属链霉菌属链霉菌属嗜热放线菌嗜热放线菌嗜热放线菌嗜热放线菌 化学方法化学方法化学方法化学方法 养养养养料料料料中中中中加加加加1%W/W1%W/W几几几几丁质培养丁质培养丁质培养丁质培养用用用用CaCOCaCO3 3提高提高提高提高pHpH进进进进行培养行培养行培养行培养 土壤土壤土壤土壤土壤土壤土壤土壤 链霉菌属链霉菌属链霉菌属链霉菌属链霉菌属链霉菌属链霉菌属链霉菌属 诱饵法诱饵法诱饵法诱饵法 用用用用涂涂涂涂石石石石蜡蜡蜡蜡的的的的棒棒棒棒置置置置于于于于碳碳碳碳源培养基中源培养基中源培养基中源培养基中花粉花粉花粉花粉蛇皮蛇皮蛇皮蛇皮人的头发人的头发人的头发人的头发 土壤土壤土壤土壤土壤土壤土壤土壤土壤土壤土壤土壤土壤土壤土壤土壤 诺卡氏菌诺卡氏菌诺卡氏菌诺卡氏菌游动放线菌属游动放线菌属游动放线菌属游动放线菌属小瓶菌属小瓶菌属小瓶菌属小瓶菌属角质菌属角质菌属角质菌属角质菌属 表表2-2 含微生物材料的标本预处理方法含微生物材料的标本预处理方法实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）采样（造纸厂）采样（造纸厂）80度度30分钟处理分钟处理文献文献:产生菌为中性芽孢杆菌，产生菌为中性芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌嗜碱芽孢杆菌、放线菌及霉菌、放线菌及霉菌1%CMC（羧羧甲甲基基纤纤维维素素），pH10.5培培养养34天天，选选择有凹陷圈的菌落择有凹陷圈的菌落从从285个土样中获得个土样中获得62株株稀释倒平板法示意图稀释倒平板法示意图第二节菌种的分离一、常规法：平板稀释法和平板划线法一、常规法：平板稀释法和平板划线法1.dilute sample1 ml9 ml10 100 1000 104 105 106 1072. plate out 0.1 ml 平板稀释法平板稀释法稀释涂布法示意图稀释涂布法示意图Inoculating an agar plate to obtain single colonies平板划线方法示意图平板划线方法示意图 其要领是提供一些有利于所需菌株生长或不利于其其要领是提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件他菌型生长的条件，例如，供给特殊的基质或加入某些例如，供给特殊的基质或加入某些抑制剂。抑制剂。控制氧可将好氧微生物和厌氧微生物分开；控制氧可将好氧微生物和厌氧微生物分开；高温下培养可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；高温下培养可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制控制pHpH可分离嗜酸或嗜碱微生物；可分离嗜酸或嗜碱微生物；高糖或高盐培养基可分离耐高渗透压微生物；高糖或高盐培养基可分离耐高渗透压微生物；在分离培养中加入抗生素或某试剂可增加选择性在分离培养中加入抗生素或某试剂可增加选择性 如分离真菌可在培养基中加入链霉素；如分离真菌可在培养基中加入链霉素； 分离细菌或放线菌可加入制霉菌素等分离细菌或放线菌可加入制霉菌素等二、施加选择性压力分离法：二、施加选择性压力分离法：选择性培养基分离法选择性培养基分离法加入抗生素或试剂来增加选择性加入抗生素或试剂来增加选择性施加选择性压力分离法：施加选择性压力分离法：1、选择培养基分离法、选择培养基分离法1.dilute sample1 ml9 ml10 100 1000 104 105 106 107牛肉膏培养基牛肉膏培养基土豆培养基土豆培养基高氏培养基高氏培养基实例：实例：实例：实例：-葡聚糖酶高产菌株选育葡聚糖酶高产菌株选育 已知：刚果红与已知：刚果红与-葡聚糖偶联成红色化合物葡聚糖偶联成红色化合物由菌落产生的由菌落产生的-葡聚糖酶分解后颜色变浅，平板上葡聚糖酶分解后颜色变浅，平板上呈现透明水解圈呈现透明水解圈2、加入抗生素或试剂来增加选择性、加入抗生素或试剂来增加选择性三、随机分离方法三、随机分离方法：有些微生物的产物对产生菌的筛选没有任何选有些微生物的产物对产生菌的筛选没有任何选择性好处，因此常随机地分离所需菌种，为此择性好处，因此常随机地分离所需菌种，为此发展了一些快速筛选方法：发展了一些快速筛选方法：1 1、抗生素产生菌的分离、抗生素产生菌的分离抑菌圈法、扩散法、生物自显影法等抑菌圈法、扩散法、生物自显影法等例：青霉素产生菌筛选方法例：青霉素产生菌筛选方法培养基培养基( (含青霉素含青霉素) ) 接入敏感菌液接入敏感菌液 （含抗性突变株）（含抗性突变株）涂布涂布抗青霉素菌落抗青霉素菌落培养培养放线菌（链霉素四环素；红霉素等） 真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源目前发现的抗生素的生物来源如下：2 2、抗肿瘤药物产生菌的分离、抗肿瘤药物产生菌的分离筛选原理：筛选原理：临床上有效的抗肿瘤药物，大部分是直临床上有效的抗肿瘤药物，大部分是直接作用于核酸或抑制核酸生物合成的物质，由于从接作用于核酸或抑制核酸生物合成的物质，由于从微生物到人类的核酸结构和生物合成方式有许多共微生物到人类的核酸结构和生物合成方式有许多共同之处，因此具有抗菌活性。同之处，因此具有抗菌活性。筛选方法：筛选方法：生化诱导分析法生化诱导分析法SOS生色检测法生色检测法DNA修复能力突变株法修复能力突变株法生化诱导分析法（生化诱导分析法（Biologicalinductionanalysis;BIA）将将E.coli lacZ 连接在连接在 噬菌体的噬菌体的PL启动子下启动子下当当DNA损伤时，诱发损伤时，诱发 阻遏蛋白分解，阻遏蛋白分解，PL启动子启动启动子启动lacZ 基因转录，表达出基因转录，表达出 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶测定测定 -半乳糖苷酶活性，可检测能损伤半乳糖苷酶活性，可检测能损伤DNA的抗肿瘤药物的的抗肿瘤药物的存在存在 X-Gal （5-Bromo-4-chloro-3-indolyl -D-galactopyranoside; 5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚- - -D-D-半乳糖苷半乳糖苷） 作显色底物；作显色底物； 反应后呈蓝色反应后呈蓝色互补显色反应3 3、酶抑制剂产生菌的分离、酶抑制剂产生菌的分离 如果某种化合物能在体外抑制某关键的人如果某种化合物能在体外抑制某关键的人体酶，它就可能在体内有药理作用体酶，它就可能在体内有药理作用 选择与生理和病理关系明确的酶作为靶酶选择与生理和病理关系明确的酶作为靶酶表表2-5基于酶靶方法的生理活性物质筛选的例子基于酶靶方法的生理活性物质筛选的例子靶区靶区靶区靶区 靶酶靶酶靶酶靶酶 邻苯二酚胺合成邻苯二酚胺合成邻苯二酚胺合成邻苯二酚胺合成抗组胺抗组胺抗组胺抗组胺抗血脂症抗血脂症抗血脂症抗血脂症5-5-羟色胺合成羟色胺合成羟色胺合成羟色胺合成 抗高血压抗高血压抗高血压抗高血压前列腺素的合成前列腺素的合成前列腺素的合成前列腺素的合成糖水解酶糖水解酶糖水解酶糖水解酶（抗糖尿病等）（抗糖尿病等）（抗糖尿病等）（抗糖尿病等） 酪氨酸羟化酶，多巴胺酪氨酸羟化酶，多巴胺酪氨酸羟化酶，多巴胺酪氨酸羟化酶，多巴胺- -羟化酶，儿茶酚羟化酶，儿茶酚羟化酶，儿茶酚羟化酶，儿茶酚oo- -甲基转移酶甲基转移酶甲基转移酶甲基转移酶组氨酸脱羟酶，组胺组氨酸脱羟酶，组胺组氨酸脱羟酶，组胺组氨酸脱羟酶，组胺N-N-甲基转移酶甲基转移酶甲基转移酶甲基转移酶3-HMG-CoA3-HMG-CoA还原酶，缩合酶还原酶，缩合酶还原酶，缩合酶还原酶，缩合酶色色色色氨氨氨氨酸酸酸酸羟羟羟羟化化化化酶酶酶酶，胰胰胰胰酶酶酶酶、血血血血纤纤纤纤维维维维蛋蛋蛋蛋白白白白溶溶溶溶酶酶酶酶，木木木木瓜瓜瓜瓜蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶、组组组组织蛋白酶织蛋白酶织蛋白酶织蛋白酶A A、B B和和和和D D，弹性蛋白酶，胃蛋白酶，弹性蛋白酶，胃蛋白酶，弹性蛋白酶，胃蛋白酶，弹性蛋白酶，胃蛋白酶血管紧张素转化酶血管紧张素转化酶血管紧张素转化酶血管紧张素转化酶前列腺紧张素转化酶前列腺紧张素转化酶前列腺紧张素转化酶前列腺紧张素转化酶- -淀粉酶、蔗糖酶淀粉酶、蔗糖酶淀粉酶、蔗糖酶淀粉酶、蔗糖酶- -半乳糖苷、神经氨酸苷酶半乳糖苷、神经氨酸苷酶半乳糖苷、神经氨酸苷酶半乳糖苷、神经氨酸苷酶 4 4、生长因子产生菌的分离、生长因子产生菌的分离通过观察分离菌能否促进营养缺陷型菌株的生长，通过观察分离菌能否促进营养缺陷型菌株的生长，来检测生长因子产生菌。来检测生长因子产生菌。分离培养基上培养被杀死的菌落周围有被杀死的菌落周围有无检测菌的生长圈无检测菌的生长圈影印到能支持生长因子产生菌生长的培养基上Uv照射杀死菌落铺上一层含相应生长因子缺陷型菌株 检测病毒复制中特有的DNA复制酶和核酸合成酶的抑制剂，是选择性高的筛选方法。 5 5、抗病毒药物产生菌的分离、抗病毒药物产生菌的分离n n细胞表面靶性酶： 氨基肽酶B、白氨酸氨基肽酶、氨基肽酶A、碱性磷酸脂酶n n筛子：靶性酶抑制剂6 6、免疫激活剂生产菌的分离、免疫激活剂生产菌的分离 从菌落的粘性状外观识别这类产生菌。 7 7、多糖产生菌的分离、多糖产生菌的分离其他方法其他方法1 1、透明圈法、透明圈法 分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核酸酶等；酶、脂肪酶、核酸酶等； 能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。例如用此法分离产生碱例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌性蛋白酶的芽孢杆菌2 2、变色圈法、变色圈法 对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入物平板中加入指示剂或显色剂指示剂或显色剂，使目的微生物菌落周，使目的微生物菌落周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；豆油作底物豆油作底物中性红指示剂中性红指示剂菌落周围呈红色圈菌落周围呈红色圈如如分离解脂微生物：分离解脂微生物：结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！43