生物技术生物技术-免疫学技术免疫学技术n基本概念基本概念抗原（抗原（antigen） 进入动物体内能刺激动物的免疫系统发生免疫应答，进入动物体内能刺激动物的免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质 分完全抗原和半抗原分完全抗原和半抗原抗体抗体(antibody)： 抗原刺激动物免疫系统，由免疫系统产生分泌的能抗原刺激动物免疫系统，由免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白第三章第三章免疫学技术免疫学技术-抗原抗体反应抗原抗体反应n可对抗原或抗体进行可对抗原或抗体进行定性、定量、定位的定性、定量、定位的检测检测n抗体抗原以非共价键抗体抗原以非共价键结合结合n不可见反应：几秒不可见反应：几秒-几几分钟分钟 可见反应：数分钟（小可见反应：数分钟（小时、日）时、日）n影响因素影响因素 电解质电解质 温度温度 酸碱度酸碱度第三章第三章免疫学技术免疫学技术n酶联免疫法酶联免疫法n放射免疫法放射免疫法 将同位素分析的灵敏性和抗体抗原反应的特异性这两大特点结合起来的免疫标记测定技术将同位素分析的灵敏性和抗体抗原反应的特异性这两大特点结合起来的免疫标记测定技术 缺点：需特殊仪器设备缺点：需特殊仪器设备; 一定的防护条件一定的防护条件; 半衰期短及试验废物难以处理半衰期短及试验废物难以处理n荧光免疫法荧光免疫法 以荧光素和罗丹明作为标记物，可在荧光显微镜下检查显示荧光的复合物和所在部位以荧光素和罗丹明作为标记物，可在荧光显微镜下检查显示荧光的复合物和所在部位 主要用于医学实践中各类病原微生物的快速诊断以及组织切片中特异抗体的检测主要用于医学实践中各类病原微生物的快速诊断以及组织切片中特异抗体的检测n其他其他 胶体金标记胶体金标记第三章第三章酶联免疫法（酶联免疫法（enzyme immunoassay)n以酶标记抗体或抗原进行的抗体抗原反应以酶标记抗体或抗原进行的抗体抗原反应n酶结合物应具有双功能：酶结合物应具有双功能： 高度特异的免疫反应、生物催化放大作用高度特异的免疫反应、生物催化放大作用n基本方法基本方法 间接法间接法 双抗体夹心法双抗体夹心法 竞争法竞争法n生物素生物素-亲和素系统（亲和素系统（biotin-avidin system，BAS）n某些新进展某些新进展酶联免疫吸附（酶联免疫吸附（enzyme linked enzyme linked immunosorbentimmunosorbent assay assay）n间接法间接法1、将已知可溶性抗原吸附于载体、将已知可溶性抗原吸附于载体2、温育后清洗、温育后清洗3、加入可能含特异性抗体的待检液、加入可能含特异性抗体的待检液4、温育后清洗、温育后清洗5、加入酶标记的二抗、加入酶标记的二抗6、温育后清洗、温育后清洗7、加入酶作用底物、加入酶作用底物8、测定反应颜色深浅、测定反应颜色深浅n双抗体夹心法双抗体夹心法1、将已知抗体吸附于载体上、将已知抗体吸附于载体上2、温育后清洗、温育后清洗3、加入可能含特异性抗原的待检液、加入可能含特异性抗原的待检液4、温育后清洗、温育后清洗5、加入酶标记特异性抗体、加入酶标记特异性抗体6、温育后清洗、温育后清洗7、加入酶作用底物、加入酶作用底物8、测定颜色反应深浅、测定颜色反应深浅酶联免疫吸附（酶联免疫吸附（enzyme linked enzyme linked immunosorbentimmunosorbent assay assay）n竞争法竞争法1、将已知抗体吸附于载体上、将已知抗体吸附于载体上2、温育后清洗、温育后清洗3、加入可能含特异性抗原的待、加入可能含特异性抗原的待检液和酶标记的已知抗原液检液和酶标记的已知抗原液4、温育后清洗、温育后清洗5、加入酶作用底物、加入酶作用底物6、测定颜色反应深浅、测定颜色反应深浅酶联免疫吸附（酶联免疫吸附（enzyme linked enzyme linked immunosorbentimmunosorbent assay assay）n生物素生物素-亲和素系统（亲和素系统（biotin-avidin system）n基本概念基本概念 生物素：是一种维生素生物素：是一种维生素H，经活化后，可与抗体、抗原、酶以，经活化后，可与抗体、抗原、酶以多多 配一的方式共价结合，且不影响它们的活性配一的方式共价结合，且不影响它们的活性 亲和素：从卵蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，可与酶偶合，亲和素：从卵蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，可与酶偶合，以以1配多的方式对生物素有很强的亲和力配多的方式对生物素有很强的亲和力nBAS用于检测的基本方法：用于检测的基本方法： BAB法或法或BRAB法法 BA法法 ABC法法酶联免疫吸附（酶联免疫吸附（enzyme linked enzyme linked immunosorbentimmunosorbent assay assay）酶联免疫吸附（酶联免疫吸附（enzyme linked enzyme linked immunosorbentimmunosorbent assay assay）n均相酶免疫测定法均相酶免疫测定法 无需无需“固定在载体上固定在载体上”；无需；无需“温育后清洗温育后清洗”n斑点免疫结合试验斑点免疫结合试验 以微孔薄膜为载体，酶以微孔薄膜为载体，酶免疫反应阳性结果在膜上免疫反应阳性结果在膜上出现色斑点出现色斑点 胶体金标记较酶标记更胶体金标记较酶标记更为简便为简便酶联免疫吸附（酶联免疫吸附（enzyme linked enzyme linked immunosorbentimmunosorbent assay assay）猪肉和尿液盐酸克伦特罗的猪肉和尿液盐酸克伦特罗的免疫胶体金法快速检测免疫胶体金法快速检测l “ “瘦肉精瘦肉精”学名为盐酸克伦特罗，医学上又称克喘素，常用于治疗哮学名为盐酸克伦特罗，医学上又称克喘素，常用于治疗哮喘。喘。l 由于盐酸克伦特罗添加于饲料饲喂动物后可明显促进动物生长由于盐酸克伦特罗添加于饲料饲喂动物后可明显促进动物生长, ,提高提高 瘦肉率瘦肉率, , 所以养殖户称其为所以养殖户称其为“瘦肉精瘦肉精”，曾在国内外广泛用于动物饲，曾在国内外广泛用于动物饲养养l 生猪食用瘦肉精后皮毛光亮，呼吸急促，个别会出现腿抽搐，站不生猪食用瘦肉精后皮毛光亮，呼吸急促，个别会出现腿抽搐，站不 稳，爬坡困难；宰后猪的肌肉特别鲜红，后臀肌肉饱满，肥肉非常薄稳，爬坡困难；宰后猪的肌肉特别鲜红，后臀肌肉饱满，肥肉非常薄瘦肉精介绍瘦肉精介绍瘦肉精介绍瘦肉精介绍l“瘦肉精瘦肉精”化学性质特别稳定，加热到化学性质特别稳定，加热到170时才能被分解，故一时才能被分解，故一般家庭厨房加热不能将其分解破坏般家庭厨房加热不能将其分解破坏l食用后在胃肠道吸收快，作用维持时间持久。中毒后主要症状表食用后在胃肠道吸收快，作用维持时间持久。中毒后主要症状表现为头疼、头晕、心悸、心慌、面色潮红、四肢发抖等症状现为头疼、头晕、心悸、心慌、面色潮红、四肢发抖等症状l 违法者使用该物质以提高猪的瘦肉率和颜色鲜艳程度，不知情的违法者使用该物质以提高猪的瘦肉率和颜色鲜艳程度，不知情的市民市民 错误地认为这样的肉才是错误地认为这样的肉才是“好肉好肉”而特别喜欢选购而特别喜欢选购l 食品卫生法食品卫生法l食品添加剂卫生管理办法食品添加剂卫生管理办法（GB2760）l动物性食品中兽药残留最高限量动物性食品中兽药残留最高限量（农业部公告第（农业部公告第235号，号， 2002年年12月月24日）规定：禁用药物，动物性食品中不得检出：日）规定：禁用药物，动物性食品中不得检出： 瘦肉精、沙丁胺醇、西马特罗等瘦肉精、沙丁胺醇、西马特罗等31种种l 违法者的法律责任：民事赔偿、行政处罚、刑事处罚违法者的法律责任：民事赔偿、行政处罚、刑事处罚法律规定法律规定盐酸克伦特罗残留检测方法盐酸克伦特罗残留检测方法 l动物性食品中克伦特罗残留量的测定动物性食品中克伦特罗残留量的测定 （GB5009.192-2003） 第一法：气相色谱第一法：气相色谱质谱法，检出限：质谱法，检出限：0.5ppb 第二法：高效液相色谱法，检出限：第二法：高效液相色谱法，检出限：0.5ppb 第三法：酶联免疫法（第三法：酶联免疫法（ELISA筛选法）筛选法） ，检出限：，检出限：0.5ppb l动物组织中盐酸克伦特罗的测定动物组织中盐酸克伦特罗的测定气相色谱气相色谱/质谱法质谱法 （NY/T 4682006），检出限：），检出限：2.0ppbl 动物尿液中盐酸克伦特罗的测定动物尿液中盐酸克伦特罗的测定气相色谱气相色谱/质谱法质谱法 （NY/XQ 4212003），检出限：），检出限：1.0ppbl尿液中盐酸克仑特罗的测定胶体金免疫层析法尿液中盐酸克仑特罗的测定胶体金免疫层析法 （NY/T933-2005），检出限：），检出限：3.0ppb 猪肉全程监控中瘦肉精检测方法的选择猪肉全程监控中瘦肉精检测方法的选择生猪饲养生猪饲养屠宰场屠宰场大型批发市场大型批发市场零售市场零售市场饲料检测饲料检测猪尿检测猪尿检测猪尿检测猪尿检测猪肉检测猪肉检测猪肉猪肉检测检测猪肉猪肉检测检测酶联免疫法酶联免疫法免疫胶体金免疫胶体金免疫胶体金免疫胶体金酶联免疫法酶联免疫法免疫胶体金免疫胶体金筛检阳性筛检阳性GC-MSGC-MS确认确认大型仪器确认大型仪器确认政府部门政府部门监督抽检监督抽检GC-MS餐饮业餐饮业猪肉猪肉检测检测免疫胶体金免疫胶体金销毁和溯源销毁和溯源阳性阳性GC-MSGC-MS确认确认大型仪器确认大型仪器确认阳性阳性免疫胶体金快速检测板的外观图免疫胶体金快速检测板的外观图 免疫胶体金快速检测板免疫胶体金快速检测板(试剂试剂)的结构图的结构图检测原理检测原理l盐酸克伦特罗快速检测试剂板的中央膜面上固定有两条隐形线，克伦盐酸克伦特罗快速检测试剂板的中央膜面上固定有两条隐形线，克伦特罗抗原固定在测试区作为检测线（特罗抗原固定在测试区作为检测线（T T线），二抗固定在质控区作为对线），二抗固定在质控区作为对照线（照线（C C线）。线）。l当待检样品溶液滴入试剂板加样孔后，样品溶液因层析作用往上扩散。当待检样品溶液滴入试剂板加样孔后，样品溶液因层析作用往上扩散。如果样品溶液含有相应药物的残留，药物将和胶体金颗粒上的抗体先如果样品溶液含有相应药物的残留，药物将和胶体金颗粒上的抗体先行反应，因此当胶体金颗粒随样品溶液扩散至行反应，因此当胶体金颗粒随样品溶液扩散至T T线时，胶体金颗粒上抗线时，胶体金颗粒上抗体活性位点将因被样品溶液中的药物占据而无法与体活性位点将因被样品溶液中的药物占据而无法与T T线上药物抗原结合；线上药物抗原结合；所以当样品中盐酸克伦特罗含量所以当样品中盐酸克伦特罗含量1ppb(1ppb(检测限检测限) )以上时，试剂板上的以上时，试剂板上的T T线线将较将较C C线显色淡或甚至无显色，判定为阳性。反之，当样品中盐酸克伦线显色淡或甚至无显色，判定为阳性。反之，当样品中盐酸克伦特罗含量在特罗含量在1ppb1ppb以下或无残留时，试剂板上的以下或无残留时，试剂板上的T T线显色与线显色与C C线相近或偏线相近或偏深，判定为阴性深，判定为阴性l灵敏度灵敏度 肉样或组织样：肉样或组织样：1ppb(1ppb(标准前处理标准前处理) )或或5ppb5ppb（简单前处理）（简单前处理） 尿样：尿样： 1ppb(1ppb(标准前处理标准前处理) )l特异性：与沙丁胺醇等苯乙胺类药物没有交叉反应；特异性：与沙丁胺醇等苯乙胺类药物没有交叉反应；l准确性：与瘦肉精准确性：与瘦肉精ELISAELISA试剂盒的检测结果试剂盒的检测结果符合率符合率9090l有效期：半年（冷藏闭光保存）有效期：半年（冷藏闭光保存）胶体金免疫层析法检测瘦肉精的技术指标胶体金免疫层析法检测瘦肉精的技术指标操作步骤操作步骤 于于5ml5ml离心管中加入离心管中加入5g5g左右剪碎或是高速匀左右剪碎或是高速匀浆过的猪肉组织样，盖紧管盖浆过的猪肉组织样，盖紧管盖 1 将将装有样品的离心管在装有样品的离心管在90以上水浴锅中以上水浴锅中加热加热10 分钟分钟 加热完成后取出冷却至室温；可以明显看加热完成后取出冷却至室温；可以明显看到底部有溶液渗出到底部有溶液渗出32 吸取吸取3滴（约滴（约100ul）煮出的样品渗出液到）煮出的样品渗出液到1.5ml的离心管中的离心管中4操作步骤操作步骤 吸取吸取3滴（约滴（约100ul）盐酸克伦特罗组织样）盐酸克伦特罗组织样专用稀释液到专用稀释液到1.5ml离心管中。充分混合均匀离心管中。充分混合均匀 从包装铝箔袋中取出检测卡平放。吸取从包装铝箔袋中取出检测卡平放。吸取3滴滴（约（约100ul）混匀溶液加入到试剂板加样孔中）混匀溶液加入到试剂板加样孔中567样液滴入加样孔后开始计时，样液滴入加样孔后开始计时，5 51010分钟左右判定结果分钟左右判定结果