第一节第一节 发酵过程中的相关概念发酵过程中的相关概念发酵机制的主题内容？发酵机制的主题内容？研究发酵机制的目的？研究发酵机制的目的？研究发酵机制的方法？研究发酵机制的方法？1一、发酵过程中的代谢问题一、发酵过程中的代谢问题-代谢代谢代谢代谢(metabolism)是细胞内发生的各种化学反应的总称，是细胞内发生的各种化学反应的总称，它主要由分解代谢它主要由分解代谢(catabolism)和合成代谢和合成代谢(anabolism)两个两个过程组成。过程组成。2代谢（代谢（metabolism）：）：细胞内发生的各种化学反应的总称细胞内发生的各种化学反应的总称代谢代谢分解代谢分解代谢(catabolism)合成代谢合成代谢(anabolism)复杂分子复杂分子（有机物）（有机物）分解代谢分解代谢合成代谢合成代谢简单小分子简单小分子ATPH34发酵本身是一种代谢过程，发酵本身是一种代谢过程，(fermentation)是指微生物是指微生物细胞将有机物氧化释放的电子直接交给底物本身未完全氧化的细胞将有机物氧化释放的电子直接交给底物本身未完全氧化的某种中间产物，同时释放能量并产生各种不同的代谢产物。因某种中间产物，同时释放能量并产生各种不同的代谢产物。因此发酵过程总是和分解代谢偶联的。此发酵过程总是和分解代谢偶联的。但在发酵条件下但在发酵条件下,有机化合物常常只是部分地被氧化，因此，有机化合物常常只是部分地被氧化，因此，在释放出一小部分能量的同时伴随大量发酵终端产物的生成。在释放出一小部分能量的同时伴随大量发酵终端产物的生成。5二、发酵过程中的生物氧化问题二、发酵过程中的生物氧化问题-生物氧化生物氧化生物氧化是一个逐步分解并释放能量的过程，是生物氧化是一个逐步分解并释放能量的过程，是一个产能代谢过程。一个产能代谢过程。6在生物氧化过程中释放的能量可被微生物直接利用，也可在生物氧化过程中释放的能量可被微生物直接利用，也可通过能量转换储存在高能化合物通过能量转换储存在高能化合物(如如ATP)中，以便逐步被利用，中，以便逐步被利用，还有部分能量以热的形式被释放到环境中。不同类型微生物进行还有部分能量以热的形式被释放到环境中。不同类型微生物进行生物氧化所利用的物质是不同的，异养微生物利用有机物，自养生物氧化所利用的物质是不同的，异养微生物利用有机物，自养微生物则利用无机物，通过生物氧化来进行产能代谢。微生物则利用无机物，通过生物氧化来进行产能代谢。78 葡萄糖降解代谢途径生物氧化： 发酵作用 产能过程 呼吸作用（有氧或无氧呼吸）微生物的生物氧化与产能过程：脱氢（或电子）递氢（或电子）受氢（或电子）功能：产能（ATP）、还原力、小分子代谢产物等。9生物氧化的生物氧化的形式形式：某物质与氧结合、脱氢或脱电子三种：某物质与氧结合、脱氢或脱电子三种生物氧化的生物氧化的功能功能为：为：产能（产能（ATP）、产还原力）、产还原力HH和产小分子中间代谢物和产小分子中间代谢物自养微生物利用自养微生物利用无机物无机物异养微生物利用异养微生物利用有机物有机物生物生物氧化氧化能量能量微生物直接利用微生物直接利用储存在高能化合物（如储存在高能化合物（如ATP）中）中以热的形式被释放到环境中以热的形式被释放到环境中10第二节第二节 微生物代谢（发酵）主要途径微生物代谢（发酵）主要途径一、一、 EMP 途径途径11P3PPOOHOHCH2CH2OO12546P磷酸二羟丙酮磷酸二羟丙酮123+P异构6-磷酸果糖磷酸果糖P564磷酸甘油醛磷酸甘油醛PP1，3-二磷酸二磷酸甘油酸甘油酸PCOHCOHH2COOH3-磷酸甘油酸磷酸甘油酸P2-磷酸甘油酸磷酸甘油酸P磷酸烯醇磷酸烯醇式丙酮酸式丙酮酸丙酮酸丙酮酸6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖PG葡萄糖葡萄糖活化裂解脱氢异构PP1，6-二磷二磷酸果糖酸果糖活化产能脱水异构产能HHOH12E1:己糖激酶己糖激酶 E2: 6-磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶-1 E3: 丙酮酸激酶丙酮酸激酶 NAD+ 乳乳 酸酸 代谢途径GluG-6-PF-6-PF-1, 6-2PATP ADP ATPADP1,3-二磷酸甘油酸二磷酸甘油酸 3-磷酸甘油酸磷酸甘油酸 2-磷酸甘油酸磷酸甘油酸 丙丙 酮酮 酸酸 磷酸二羟丙酮磷酸二羟丙酮 3-磷酸甘油醛磷酸甘油醛 NAD+ NADH+H+ ADP ATP ADP ATP磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸 E2E1E3NADH+H+ 13过程中ATP的消耗和产生2 1葡葡 萄萄 糖糖 6- 6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖 6 - 6 - 磷酸果糖磷酸果糖 1,6- 1,6-二磷酸果糖二磷酸果糖1,3-1,3-二磷酸甘油酸二磷酸甘油酸 3- 3-磷酸甘油酸磷酸甘油酸磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸 丙丙 酮酮 酸酸 -1 反反 应应 ATP -1-12 1 葡萄糖葡萄糖+2Pi+2ADP+2NAD+ 2丙酮酸丙酮酸+2ATP+2NADH+2H+ +2H2O产生的能量产生的能量14 有氧时，有氧时，2NADH进入线粒体经呼吸链氧化进入线粒体经呼吸链氧化,原核生物又可产生原核生物又可产生6分子分子ATP,真核生物又可真核生物又可产生产生4分子的分子的ATP再加上由底物水平的磷酸再加上由底物水平的磷酸化形成的化形成的2个个ATP，故共可产生原核故共可产生原核2+6=8分子分子ATP；真核真核2+4=6分子分子ATP原核原核生物中生物中,其电子传递链存在于其电子传递链存在于质膜上质膜上,无无需穿棱过程，而需穿棱过程，而真核真核生物线粒体内膜是不生物线粒体内膜是不能穿过能穿过NADH需要一个需要一个磷酸甘油穿棱系统磷酸甘油穿棱系统。 无氧时，无氧时，2NADH还原丙酮酸，生成还原丙酮酸，生成2分子分子乳酸或乙醇，故净产生乳酸或乙醇，故净产生2分子分子ATP 15 细胞对酵解速度的调控是为了满足细胞细胞对酵解速度的调控是为了满足细胞对能量及碳骨架的需求。对能量及碳骨架的需求。在代谢途径中，催化在代谢途径中，催化不可逆反应的酶不可逆反应的酶所所处的部位是控制代谢反应的有力部位。处的部位是控制代谢反应的有力部位。糖酵解中有三步反应不可逆，分别由糖酵解中有三步反应不可逆，分别由己己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶催化，催化，因此这三种酶对酵解速度起调节作用。因此这三种酶对酵解速度起调节作用。EMP 的调控的调控16二、二、HMPHMP 途径途径171.概念：以6-磷酸葡萄糖开始，在6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化下形成6-磷酸葡萄糖酸，进而代谢生成以磷酸戊糖为中间代谢物的过程，称为磷酸戊糖途径，简称PPP途径。又称磷酸已糖旁路一、磷酸戊糖途径的概念36-磷酸葡萄糖+6NADP+26-磷酸果糖+3-磷酸甘油醛+6(NADPH+H+)+3CO22.反应部位：胞浆18第一阶段： 氧化反应 生成NADPH和CO2第二阶段： 非氧化反应 一系列基团转移反应 (生成3-磷酸甘油醛和6-磷酸果糖)二、磷酸戊糖途径的过程19磷酸戊糖途径二个阶段的反应式6-6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖 + 2 NADPNADP+ + 5-5-磷酸核糖磷酸核糖 + 2(+ 2(NADPH+HNADPH+H+ +) + CO) + CO2 2 35-磷酸核糖 26-磷酸果糖 + 3-磷酸甘油醛36-磷酸葡萄糖 +6NADP+26-磷酸果糖+3-磷酸甘油醛+6(NADPH+H+)+ 3CO220磷酸戊糖途径总反应图糖酵解途径糖酵解途径3 36-6-磷磷酸葡萄糖酸葡萄糖5-5-磷酸磷酸木酮糖木酮糖5-5-磷酸磷酸核糖核糖5-5-磷酸磷酸木酮糖木酮糖7-7-磷酸磷酸景天糖景天糖3-3-磷酸磷酸甘油醛甘油醛4-4-磷酸磷酸赤藓糖赤藓糖6-6-磷酸磷酸果糖果糖3-3-磷酸磷酸甘油醛甘油醛6-6-磷酸磷酸果糖果糖3 36-6-磷酸葡磷酸葡萄糖酸内酯萄糖酸内酯3NADPH3NADPH3 36-6-磷酸磷酸葡萄糖酸葡萄糖酸3H3H2 2O O3 35-5-磷磷酸核酮糖酸核酮糖3NADPH3NADPH3CO3CO2 221磷酸戊糖途径第一阶段第一阶段 第第二二阶阶段段 5-磷酸木酮糖磷酸木酮糖 C55-磷酸木酮糖磷酸木酮糖 C57-磷酸景天糖磷酸景天糖 C73-磷酸甘油醛磷酸甘油醛 C34-磷酸赤藓糖磷酸赤藓糖 C46-磷酸果糖磷酸果糖 C66-磷酸果糖磷酸果糖 C63-磷酸磷酸甘油醛甘油醛 C36-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖(C6)3 6-磷酸葡萄糖酸内酯磷酸葡萄糖酸内酯(C6)3 6-磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖酸(C6)3 5-磷酸核酮糖磷酸核酮糖(C5) 3 5-磷酸核糖磷酸核糖 C53NADP+ 3NADP+3H+ 6-磷酸葡萄糖脱氢酶磷酸葡萄糖脱氢酶 3NADP+ 3NADP+3H+ 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶磷酸葡萄糖酸脱氢酶 3CO222C原子数目变化示意图C5C5C7C3C4C6C3C7C5C6C3C4糖糖的的分分解解代代谢谢C6COCO2 2C6COCO2 2C6COCO2 223磷酸戊糖途径小结 反应部位： 胞浆 反应底物： 6-磷酸葡萄糖 重要反应产物： NADPH、5-磷酸核糖 限速酶： 6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PD)24磷酸戊糖途径的生物学意义1、磷酸戊糖途径也是普遍存在的糖代谢的一种方式2、产生大量的NADPH，为细胞的各种合成反应提供还原力3、该途径的反应起始物为6-磷酸葡萄糖，不需要ATP参与起始反应，因此磷酸戊糖循环可在低ATP浓度下进行。4、此途径中产生的5-磷酸核酮糖是辅酶及核苷酸生物合成的必需原料。5、磷酸戊糖途径是机体内核糖产生的唯一场所。25磷酸戊糖途径的速度主要受生物合成时NADPH的需要所调节。NADPH反馈抑制6-P-葡萄糖脱氢酶的活性。磷酸戊糖途径的调节26三、三、EDED 途径途径27ED途径途径(Entner-Doudoroff pathway)是是1952年年Entner和和Doudoroff两人在研究嗜糖假单胞菌两人在研究嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharvphila)时发现的。时发现的。在在ED途径中，途径中，6-磷酸葡萄糖首先脱氢产生磷酸葡萄糖首先脱氢产生6-磷酸葡萄糖酸，磷酸葡萄糖酸，接着在脱水酶和醛缩酶的作用下，产生接着在脱水酶和醛缩酶的作用下，产生1分子分子3-磷酸甘油醛和磷酸甘油醛和1分子丙酮酸。然后分子丙酮酸。然后3-磷酸甘油醛进人磷酸甘油醛进人EMP途径转变成丙酮酸。途径转变成丙酮酸。1分子葡萄糖经分子葡萄糖经ED途径最后生成途径最后生成2分子丙酮酸、分子丙酮酸、1分子分子ATP、1分子分子NADPH和和1分子分子NADH(图图4-5)。所以，所以，ED途径中途径中2个丙酮酸的来历不同，这个丙酮酸的来历不同，这2个丙酮酸的羧个丙酮酸的羧基分别来自葡萄糖的第基分别来自葡萄糖的第1位和第位和第4位碳原子。位碳原子。28ED途径中的特征性酶是途径中的特征性酶是2-酮酮-3-脱氧脱氧-6-磷酸葡萄磷酸葡萄糖酸醛缩酶，它催化糖酸醛缩酶，它催化2-酮酮-3-脱氧脱氧-6-磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖酸(KDPG)裂解生成一个丙酮酸和一个裂解生成一个丙酮酸和一个3-磷酸甘油醛。磷酸甘油醛。ED途径可不依赖于途径可不依赖于EMP途径和途径和HMP途径而单独途径而单独存在，但对于靠底物水平磷酸化获得存在，但对于靠底物水平磷酸化获得ATP的厌氧菌而的厌氧菌而言，言，ED途径不如途径不如EMP途径经济。但其特点是葡萄糖只途径经济。但其特点是葡萄糖只经过经过4步反应即可快速获得步反应即可快速获得EMP途径须经途径须经10步反应才步反应才能获得的丙酮酸。能获得的丙酮酸。2930四、四、 WDWD途径途径31WD途径以发现者名字途径以发现者名字Warburg、Dickens、Horecker命名的。该途径的特征性酶是磷酸解酮酶，命名的。该途径的特征性酶是磷酸解酮酶，所以又称磷酸解酮酶途径所以又称磷酸解酮酶途径(phosphoketolase pathway)。根据解酮酶的不同，把具有磷酸戊糖解。根据解酮酶的不同，把具有磷酸戊糖解酮酶的途径称为酮酶的途径称为PK途径，把具有磷酸己糖解酮酶的途途径，把具有磷酸己糖解酮酶的途径叫径叫HK途径。途径。32PK途径是肠膜明串珠菌在进行异型乳酸发酵过程途径是肠膜明串珠菌在进行异型乳酸发酵过程中分解己糖和戊糖的途径。首先将葡萄糖磷酸化，再将中分解己糖和戊糖的途径。首先将葡萄糖磷酸化，再将它氧化成它氧化成6-磷酸葡萄糖酸，接着磷酸葡萄糖酸，接着6-磷酸葡萄糖酸进一磷酸葡萄糖酸进一步氧化脱羧生成磷酸戊糖。步氧化脱羧生成磷酸戊糖。PK途径关键性的反应是磷途径关键性的反应是磷酸戊糖解酮酶催化的反应，使酸戊糖解酮酶催化的反应，使5-磷酸木酮糖裂解为乙磷酸木酮糖裂解为乙酰磷酸和酰磷酸和3-磷酸甘油醛，最终产物是乳酸、乙醇和磷酸甘油醛，最终产物是乳酸、乙醇和CO2，并产生，并产生1分子的分子的ATP。借助。借助PK途径，微生物在途径，微生物在厌氧条件下不仅可以利用葡萄糖，而且可以利用厌氧条件下不仅可以利用葡萄糖，而且可以利用D-核核糖、糖、D-木糖和木糖和L-阿拉伯糖。阿拉伯糖。33双歧杆菌分解葡萄糖的途径是双歧杆菌分解葡萄糖的途径是HK途径，特征酶是途径，特征酶是磷酸己糖解酮酶。该酶催化的反应是磷酸己糖解酮酶。该酶催化的反应是6-磷酸果糖裂解磷酸果糖裂解为为4-磷酸赤藓糖和乙酰磷酸。磷酸赤藓糖和乙酰磷酸。1分子葡萄糖经分子葡萄糖经HK途径途径最终产生最终产生1分子乳酸、分子乳酸、15分子乙酸和分子乙酸和25分子的分子的ATP。由于肠膜明串珠菌和两歧双歧杆菌细胞内分别。由于肠膜明串珠菌和两歧双歧杆菌细胞内分别不存在或仅具有微量的不存在或仅具有微量的1，6-二磷酸果糖醛缩酶和二磷酸果糖醛缩酶和6一一磷酸葡萄糖脱氢酶，说明这两种细菌基本上不具有磷酸葡萄糖脱氢酶，说明这两种细菌基本上不具有EMP、HMP和和ED三条途径。三条途径。343536以上四种途径以上四种途径(EMP途径、途径、HMP途径、途径、ED途径和途径和WD途径途径)都是葡萄糖先经磷酸化然后逐都是葡萄糖先经磷酸化然后逐步被降解的。而有些微生物，如假单胞菌属、气步被降解的。而有些微生物，如假单胞菌属、气杆菌属和醋杆菌属等某些菌没有己糖激酶，不能杆菌属和醋杆菌属等某些菌没有己糖激酶，不能将葡萄糖磷酸化，但具有葡萄糖氧化酶，这样就将葡萄糖磷酸化，但具有葡萄糖氧化酶，这样就采用葡萄糖直接氧化途径。采用葡萄糖直接氧化途径。3738丙酮酸的代谢-常见初级发酵产物乳酸、乙酸、乙醇、TCA中间体、甲酸等等39第三节第三节 主要初级发酵产物主要初级发酵产物40一、乙醇发酵和甘油发酵一、乙醇发酵和甘油发酵1酵母菌发酵酵母菌发酵酵母菌属的一些菌种利用葡萄糖进行发酵，根据在不同酵母菌属的一些菌种利用葡萄糖进行发酵，根据在不同条件下代谢产物的不同，可将酵母菌发酵分为以下三条件下代谢产物的不同，可将酵母菌发酵分为以下三种类型。种类型。41(1)酵母菌的第一型发酵酵母菌的第一型发酵(乙醇发酵乙醇发酵)酵母菌的乙醇发酵是一种研究最早、发酵机制最清楚的酵母菌的乙醇发酵是一种研究最早、发酵机制最清楚的发酵类型。在厌氧条件下，酵母菌可将葡萄糖经发酵类型。在厌氧条件下，酵母菌可将葡萄糖经EMP途径降解为途径降解为2个丙酮酸，然后在乙醇发酵的关个丙酮酸，然后在乙醇发酵的关键酶键酶-丙酮酸脱羧酶的催化下，丙酮酸脱羧生丙酮酸脱羧酶的催化下，丙酮酸脱羧生成乙醛，接着在醇脱氢酶的作用下，成乙醛，接着在醇脱氢酶的作用下，EMP途径中生途径中生成的成的NADH将乙醛还原成乙醇。每分子葡萄糖发酵将乙醛还原成乙醇。每分子葡萄糖发酵生成生成2个乙醇和个乙醇和2个个C02，并净得，并净得2个个ATP，即，即42这是酵母的正常乙醇发酵，又称酵母的第一型发酵这是酵母的正常乙醇发酵，又称酵母的第一型发酵43(2)酵母菌的第二型发酵酵母菌的第二型发酵(甘油发酵甘油发酵)在进行乙醇发酵的酵母代谢时，若在培养基中加入亚硫在进行乙醇发酵的酵母代谢时，若在培养基中加入亚硫酸氢钠，则发酵就会从乙醇发酵转向甘油发酵。这是酸氢钠，则发酵就会从乙醇发酵转向甘油发酵。这是因为亚硫酸氢钠可与乙醛发生加成反应生成难溶的磺因为亚硫酸氢钠可与乙醛发生加成反应生成难溶的磺化羟基乙醛，致使乙醛不能作为化羟基乙醛，致使乙醛不能作为NADH2的受氢体，的受氢体，所以不能形成乙醇，而迫使用磷酸二羟丙酮代替乙醛所以不能形成乙醇，而迫使用磷酸二羟丙酮代替乙醛作为受氢体，生成作为受氢体，生成a-磷酸甘油。磷酸甘油。a-磷酸甘油进一步磷酸甘油进一步在在a-磷酸甘油酯酶作用下水解脱磷酸而生成甘油，磷酸甘油酯酶作用下水解脱磷酸而生成甘油，这称为酵母的第二型发酵。这称为酵母的第二型发酵。44由上述反应式可以看出，利用亚硫酸盐发酵生产甘由上述反应式可以看出，利用亚硫酸盐发酵生产甘油时，每分子葡萄糖只产生油时，每分子葡萄糖只产生1分子甘油，不产生分子甘油，不产生ATP，为了提供维持菌体生长所需要的能量，必须控制亚硫酸为了提供维持菌体生长所需要的能量，必须控制亚硫酸氢钠的加入量氢钠的加入量(亚适量水平亚适量水平)，以保证一部分的糖可进，以保证一部分的糖可进行乙醇发酵，否则酵母菌将因为得不到能量而停止生长。行乙醇发酵，否则酵母菌将因为得不到能量而停止生长。45(3)酵母菌的第三型发酵酵母菌的第三型发酵(甘油发酵甘油发酵)在弱碱性条件下在弱碱性条件下(pH 76)，酵母菌的乙醇发酵也会，酵母菌的乙醇发酵也会转向甘油发酵，这就是酵母菌的第三型发酵。转向甘油发酵，这就是酵母菌的第三型发酵。此时，乙醛因得不到足够的氢而积累，此时，乙醛因得不到足够的氢而积累，2个乙醛分子间个乙醛分子间会发生歧化反应，会发生歧化反应，1分子乙醛作为氧化剂被还原成乙分子乙醛作为氧化剂被还原成乙醇，另一个则作为还原剂被氧化为乙酸。醇，另一个则作为还原剂被氧化为乙酸。因此，第三型发酵除了有第二型发酵的甘油外，还有乙因此，第三型发酵除了有第二型发酵的甘油外，还有乙醇和乙酸。醇和乙酸。46472细菌的乙醇发酵细菌的乙醇发酵不同的细菌进行乙醇发酵时，其发酵途径也各不相同。不同的细菌进行乙醇发酵时，其发酵途径也各不相同。如运动发酵单胞菌如运动发酵单胞菌(zymomonas mobilis)和厌和厌氧发酵单胞菌氧发酵单胞菌(Zymomonas anaerobia)是利用是利用ED途径分解葡萄糖为丙酮酸，丙酮酸脱羧生成乙醛，途径分解葡萄糖为丙酮酸，丙酮酸脱羧生成乙醛，乙醛又被还原生成乙醇。由于发酵是经乙醛又被还原生成乙醇。由于发酵是经ED途径，所途径，所以每分子葡萄糖只能产生以每分子葡萄糖只能产生1分子分子ATP，产能是酵母乙，产能是酵母乙醇发酵的一半，产生的乙醇仍是醇发酵的一半，产生的乙醇仍是2分子。分子。对于某些生长在极端酸性条件下的严格厌氧菌，如胃八对于某些生长在极端酸性条件下的严格厌氧菌，如胃八叠球菌和兼性厌氧的肠杆菌则是利用叠球菌和兼性厌氧的肠杆菌则是利用EMP途径进行途径进行乙醇发酵。乙醇发酵。48二、乳酸发酵（结合实例）二、乳酸发酵（结合实例）许多细菌能利用葡萄糖产生乳酸，这类细菌称为乳酸细许多细菌能利用葡萄糖产生乳酸，这类细菌称为乳酸细菌。它们的营养要求较复杂，培养时一般要补充一些菌。它们的营养要求较复杂，培养时一般要补充一些动植物的组织液或酵母浸出液。由于乳酸分子中含有动植物的组织液或酵母浸出液。由于乳酸分子中含有一个不对称碳原子，因此发酵产物就有一个不对称碳原子，因此发酵产物就有D-乳酸、乳酸、L-乳酸和乳酸和DL-乳酸。它们是由具有不同立体专一性的乳乳酸。它们是由具有不同立体专一性的乳酸脱氢酶作用的结果。根据产物的不同，乳酸发酵有酸脱氢酶作用的结果。根据产物的不同，乳酸发酵有三种类型，即同型乳酸发酵、异型乳酸发酵和双歧发三种类型，即同型乳酸发酵、异型乳酸发酵和双歧发酵。酵。491同型乳酸发酵同型乳酸发酵乳酸杆菌属、链球菌属的多数细菌都以这种方式产生乳乳酸杆菌属、链球菌属的多数细菌都以这种方式产生乳酸。葡萄糖经酸。葡萄糖经EMP途径降解为丙酮酸，丙酮酸在乳途径降解为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的作用下被酸脱氢酶的作用下被NADH还原为乳酸，由于终产还原为乳酸，由于终产物只有乳酸一种，故称为同型乳酸发酵。每分子葡萄物只有乳酸一种，故称为同型乳酸发酵。每分子葡萄糖生成糖生成2分子乳酸和分子乳酸和2分子分子ATP，产生，产生ATP的量与酵的量与酵母的乙醇发酵相等，不产生母的乙醇发酵相等，不产生C02。总反应式为。总反应式为502异型乳酸发酵异型乳酸发酵肠膜明串珠菌肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)和葡聚糖明和葡聚糖明串珠菌串珠菌(Leuconostoc dextranicum)等通过等通过PK途径进途径进行异型乳酸发酵。发酵终产物除乳酸以外还有一部分乙醇，行异型乳酸发酵。发酵终产物除乳酸以外还有一部分乙醇，所以叫做异型乳酸发酵所以叫做异型乳酸发酵(参见图参见图4-7)。葡萄糖经。葡萄糖经6-磷酸葡萄磷酸葡萄糖酸进一步氧化脱羧生成糖酸进一步氧化脱羧生成5-磷酸核酮糖，再经差向异构作用磷酸核酮糖，再经差向异构作用生成生成5-磷酸木酮糖。磷酸木酮糖。5-磷酸木酮糖经磷酸戊糖解酮酶催化，磷酸木酮糖经磷酸戊糖解酮酶催化，裂解为裂解为3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸，其中磷酸甘油醛和乙酰磷酸，其中3-磷酸甘油醛进一步磷酸甘油醛进一步转化为乳酸，乙酰磷酸经两次还原变为乙醇。每分子葡萄糖转化为乳酸，乙酰磷酸经两次还原变为乙醇。每分子葡萄糖产生乳酸、乙醇和产生乳酸、乙醇和CO2各各1分子，并产生分子，并产生1分子的分子的ATP，因，因此，这条途径产能只有同型乳酸发酵的一半。此，这条途径产能只有同型乳酸发酵的一半。总反应式是总反应式是513双歧发酵双歧发酵双歧发酵是两歧双歧杆菌发酵葡萄糖产生乳酸的一条途径。此反双歧发酵是两歧双歧杆菌发酵葡萄糖产生乳酸的一条途径。此反应有两种磷酸酮糖酶参加，即应有两种磷酸酮糖酶参加，即6-磷酸果糖解酮酶和磷酸果糖解酮酶和5-磷酸木磷酸木酮糖解酮酶，分别催化酮糖解酮酶，分别催化6-磷酸果糖和磷酸果糖和5-磷酸木酮糖裂解产生磷酸木酮糖裂解产生乙酰磷酸和乙酰磷酸和3-磷酸甘油醛及乙酰磷酸。磷酸甘油醛及乙酰磷酸。每分子葡萄糖经双歧途径可以净得每分子葡萄糖经双歧途径可以净得2.5分子分子ATP，因此它的产能，因此它的产能水平高于同型乳酸发酵途径和异型乳酸发酵途径。水平高于同型乳酸发酵途径和异型乳酸发酵途径。52三、丙酸发酵三、丙酸发酵许多厌氧菌可进行丙酸发酵，产物除丙酸外，还有乙酸许多厌氧菌可进行丙酸发酵，产物除丙酸外，还有乙酸和和CO2。丙酸杆菌的丙酸发酵为琥珀酸。丙酸杆菌的丙酸发酵为琥珀酸-丙酸途丙酸途径，其过程是：葡萄糖经径，其过程是：葡萄糖经EMP途径分解为两个丙酮途径分解为两个丙酮酸，其中一分子丙酮酸氧化生成乙酸和酸，其中一分子丙酮酸氧化生成乙酸和CO2；另一；另一分子丙酮酸经羧化生成草酰乙酸，再转化为琥珀酸，分子丙酮酸经羧化生成草酰乙酸，再转化为琥珀酸，琥珀酸经甲基丙二酰琥珀酸经甲基丙二酰CoA，最后经脱羧和转辅酶，最后经脱羧和转辅酶A反反应生成丙酸应生成丙酸(图图4-11)。由图。由图4-11可知，从丙酮酸可知，从丙酮酸生成丙酸是一个循环反应，其中关键性中间产物是甲生成丙酸是一个循环反应，其中关键性中间产物是甲基丙二酰基丙二酰CoA。5354四、丁酸发酵与丙酮四、丁酸发酵与丙酮-丁醇发酵丁醇发酵某些专性厌氧菌，如梭菌属、丁酸弧菌属、真杆菌属和某些专性厌氧菌，如梭菌属、丁酸弧菌属、真杆菌属和梭杆菌属，能进行丁酸发酵与丙酮梭杆菌属，能进行丁酸发酵与丙酮-丁醇发酵。丁酸丁醇发酵。丁酸发酵的代表菌是丁酸梭菌，发酵产物有丁酸、乙酸、发酵的代表菌是丁酸梭菌，发酵产物有丁酸、乙酸、C02和和H2。梭菌利用。梭菌利用PEP-磷酸转移酶系统吸收葡磷酸转移酶系统吸收葡萄糖，葡萄糖经萄糖，葡萄糖经EMP途径降解为丙酮酸，接着在丙途径降解为丙酮酸，接着在丙酮酸酮酸-铁氧还蛋白氧化铁氧还蛋白氧化-还原酶的参与下，将丙酮酸转还原酶的参与下，将丙酮酸转化为乙酰辅酶化为乙酰辅酶A。乙酰辅酶。乙酰辅酶A再经一系列反应生成丁再经一系列反应生成丁酸。在丁酸发酵过程中，每发酵酸。在丁酸发酵过程中，每发酵1分子葡萄糖生成分子葡萄糖生成1分子的丁酸时，可产生分子的丁酸时，可产生3个个ATP。总反应式为。总反应式为55在丁酸发酵中，丁酸不是由丁酰在丁酸发酵中，丁酸不是由丁酰CoA直接水解生成，直接水解生成，因为这样会浪费能量，而是由乙酰因为这样会浪费能量，而是由乙酰CoA与乙酸发生转与乙酸发生转CoA反应，生成丁酸和乙酰反应，生成丁酸和乙酰CoA，把能量储存在乙酰，把能量储存在乙酰CoA中。中。5657在丁酸发酵过程中，由于丁酸的生成，会导致环境在丁酸发酵过程中，由于丁酸的生成，会导致环境的的pH下降，当下降，当pH值降至值降至45时，时，CoA转移酶被活化，转移酶被活化，这时有部分乙酰乙酰这时有部分乙酰乙酰CoA转变成乙酰乙酸，再脱羧生转变成乙酰乙酸，再脱羧生成丙酮；另一部分乙酰乙酰成丙酮；另一部分乙酰乙酰CoA经还原生成丁酰经还原生成丁酰CoA，然后进一步还原生成丁醇，然后进一步还原生成丁醇(图图413)。在丙酮在丙酮-丁醇发酵中，每丁醇发酵中，每2分子葡萄糖可生成分子葡萄糖可生成1分子分子丙酮和丙酮和1分子丁醇及分子丁醇及4分子分子ATP，并放出，并放出4分子分子H2和和5分子分子C02，即，即5859五、混合酸发酵与丁二醇发酵五、混合酸发酵与丁二醇发酵某些肠细菌，如埃希氏菌属、沙门氏菌属和志贺氏菌属某些肠细菌，如埃希氏菌属、沙门氏菌属和志贺氏菌属(Shigella)中的一些细菌，能够利用葡萄糖进行混中的一些细菌，能够利用葡萄糖进行混合酸发酵。先通过：合酸发酵。先通过：EMP途径将葡萄糖分解为丙酮途径将葡萄糖分解为丙酮酸，然后由不同的酶系将丙酮酸转化成不同的产物，酸，然后由不同的酶系将丙酮酸转化成不同的产物，如乳酸、乙酸、甲酸、乙醇、如乳酸、乙酸、甲酸、乙醇、CO2和和H2，还有一部，还有一部分磷酸烯醇式丙酮酸用于生成琥珀酸；而肠杆菌、欧分磷酸烯醇式丙酮酸用于生成琥珀酸；而肠杆菌、欧文氏菌属中的一些细菌，能将丙酮酸转变成乙酰乳酸，文氏菌属中的一些细菌，能将丙酮酸转变成乙酰乳酸，乙酰乳酸经一系列反应生成丁二醇与更多的气体乙酰乳酸经一系列反应生成丁二醇与更多的气体。6061在这两种类型发酵中，除琥珀酸是由磷酸烯醇式丙酮酸衍在这两种类型发酵中，除琥珀酸是由磷酸烯醇式丙酮酸衍生而来以外，其余的发酵产物均来自丙酮酸。作用于丙酮酸的酶生而来以外，其余的发酵产物均来自丙酮酸。作用于丙酮酸的酶有三种，即丙酮酸甲酸裂解酶、乳酸脱氢酶和乙酰乳酸合成酶。有三种，即丙酮酸甲酸裂解酶、乳酸脱氢酶和乙酰乳酸合成酶。丙酮酸甲酸裂解酶存在于兼性厌氧的肠细菌中，它催化丙酮酸分丙酮酸甲酸裂解酶存在于兼性厌氧的肠细菌中，它催化丙酮酸分解生成乙酰解生成乙酰CoA和甲酸。丙酮酸甲酸裂解酶是在厌氧条件下合和甲酸。丙酮酸甲酸裂解酶是在厌氧条件下合成的，它在有氧时很容易失活，因此它只在发酵过程中起催化作成的，它在有氧时很容易失活，因此它只在发酵过程中起催化作用。即使在厌氧时，该酶的活性也不稳定，随丙酮酸浓度变化而用。即使在厌氧时，该酶的活性也不稳定，随丙酮酸浓度变化而变化，即丙酮酸浓度高则有酶活性，丙酮酸浓度低，酶活性丧失变化，即丙酮酸浓度高则有酶活性，丙酮酸浓度低，酶活性丧失。无活性的丙酮酸甲酸裂解酶可被活化，但活化需要有还原型黄。无活性的丙酮酸甲酸裂解酶可被活化，但活化需要有还原型黄素蛋白、素蛋白、S-腺苷甲硫氨酸、活化酶和丙酮酸参与，其中丙酮酸腺苷甲硫氨酸、活化酶和丙酮酸参与，其中丙酮酸在活化过程中起效应物的作用，本身并不被消耗。在活化过程中起效应物的作用，本身并不被消耗。62乙酰乳酸合成酶是一种含硫胺素焦磷酸乙酰乳酸合成酶是一种含硫胺素焦磷酸(TPP)的酶的酶，它催化，它催化2分子丙酮酸反应生成分子丙酮酸反应生成a-乙酰乳酸。该酶在酸乙酰乳酸。该酶在酸性条件下有活性，并且在性条件下有活性，并且在pH 6时活性最高，故有时活性最高，故有pH 6酶之称。酶之称。在这两条发酵途径中催化甲酸裂解生成在这两条发酵途径中催化甲酸裂解生成CO2和和H2的酶是甲酸氢裂解酶，它也是大肠杆菌和产气肠杆菌在的酶是甲酸氢裂解酶，它也是大肠杆菌和产气肠杆菌在厌氧条件下合成的一种酶。甲酸氢裂解酶实际上是一种厌氧条件下合成的一种酶。甲酸氢裂解酶实际上是一种复合物，它的活性需要有硒和钼两种元素作为活性因子复合物，它的活性需要有硒和钼两种元素作为活性因子，并且这两种元素也参与酶的组成。，并且这两种元素也参与酶的组成。63丙酮酸在不同的机体内以及在不丙酮酸在不同的机体内以及在不同酶作用下转变为不同的代谢产物和同酶作用下转变为不同的代谢产物和能量的过程总结于图中能量的过程总结于图中6465第四节第四节 发酵与呼吸发酵与呼吸 呼吸作用与发酵作用的根本区别在于呼吸作用与发酵作用的根本区别在于：底物在氧化过程：底物在氧化过程中放出的电子不是直接交给底物降解的中间产物中放出的电子不是直接交给底物降解的中间产物(有机物有机物)，而是通过一系列电子载体最终交给外源电子受体而是通过一系列电子载体最终交给外源电子受体。66微生物通过氧化作用放出电子，并将释放出的电子经电子传递链微生物通过氧化作用放出电子，并将释放出的电子经电子传递链(electron transport chain)传给外源电子受体，从而生传给外源电子受体，从而生成水或其他还原型产物并释放出能量的过程，称呼吸作用成水或其他还原型产物并释放出能量的过程，称呼吸作用(respiration)。根据外源电子受体的性质不同，可将呼吸分为根据外源电子受体的性质不同，可将呼吸分为有氧呼吸和无氧呼吸两种类型。其中，以分子氧作为最终电有氧呼吸和无氧呼吸两种类型。其中，以分子氧作为最终电子受体的称为有氧呼吸子受体的称为有氧呼吸(aerobic respiration)，以氧化型，以氧化型化合物作为最终电子受体的称为无氧呼吸化合物作为最终电子受体的称为无氧呼吸(anaerobic respiration)。67一、有氧呼吸一、有氧呼吸在有氧呼吸中，外源的电子受体是分子氧，而电子供体是微生物在有氧呼吸中，外源的电子受体是分子氧，而电子供体是微生物进行生物氧化的能源化合物进行生物氧化的能源化合物(氧化底物氧化底物)。68葡萄糖的有氧分解途径葡萄糖的有氧分解途径丙酮酸生成乙酰丙酮酸生成乙酰coA丙酮酸不能直接进入三羧酸循环，丙酮酸不能直接进入三羧酸循环，而是先要被氧化脱羧生成乙酰而是先要被氧化脱羧生成乙酰CoA，即，即69呼吸链呼吸链电子传递系统电子传递系统(又称呼吸链又称呼吸链)是由一系列氢和电子传递体组成的是由一系列氢和电子传递体组成的多酶氧化多酶氧化-还原体系，还原体系，NADH、FADH2以及其他还原型载体以及其他还原型载体上的氢原子以质子和电子的形式在其上进行定向传递；其组上的氢原子以质子和电子的形式在其上进行定向传递；其组成酶系是定向有序的，按照氧化成酶系是定向有序的，按照氧化-还原电位升高的次序依次排还原电位升高的次序依次排列，但排列又是不对称的。列，但排列又是不对称的。电子传递链在原核微生物中存在于细胞质膜上，在真核微生物中电子传递链在原核微生物中存在于细胞质膜上，在真核微生物中存在于线粒体内膜上。大多数细菌呼吸链与真核微生物的不存在于线粒体内膜上。大多数细菌呼吸链与真核微生物的不同，不同细菌的呼吸链也会有所不同，但是细菌和真核微生同，不同细菌的呼吸链也会有所不同，但是细菌和真核微生物的呼吸链相比有大致相似的组成成分，这些载体除醌及其物的呼吸链相比有大致相似的组成成分，这些载体除醌及其衍生物以外，其余的都是一些带有辅基的蛋白质，电子传递衍生物以外，其余的都是一些带有辅基的蛋白质，电子传递通过这些辅基来完成。这些带有辅基的蛋白质的氧化通过这些辅基来完成。这些带有辅基的蛋白质的氧化-还原电还原电位在位在NAD+和氧之间。电子传递系统中的氧化和氧之间。电子传递系统中的氧化-还原酶主要包还原酶主要包括括NADH脱氢酶、黄素蛋白、铁硫蛋白、细胞色素、醌及其脱氢酶、黄素蛋白、铁硫蛋白、细胞色素、醌及其衍生物。衍生物。70无氧呼吸无氧呼吸某些厌氧和兼性厌氧微生物在无氧条件下进行无氧呼吸。无氧呼某些厌氧和兼性厌氧微生物在无氧条件下进行无氧呼吸。无氧呼吸的最终电子受体不是氧，而是像吸的最终电子受体不是氧，而是像NO3-、NO2-、SO42-、S2O32-、C02等一类外源受体等一类外源受体(图图4-19)。无氧呼吸也需要细胞色素等电子传递体，并在能量分级释放过程无氧呼吸也需要细胞色素等电子传递体，并在能量分级释放过程中伴随有磷酸化作用，也能产生能量用于生命活动。但由于中伴随有磷酸化作用，也能产生能量用于生命活动。但由于部分能量随电子转移传给最终电子受体，电子传递链比有氧部分能量随电子转移传给最终电子受体，电子传递链比有氧呼吸时短，所以生成的能量不如有氧呼吸产生得多。无氧呼呼吸时短，所以生成的能量不如有氧呼吸产生得多。无氧呼吸是一类在无氧条件下进行的产能效率较低的呼吸作用。吸是一类在无氧条件下进行的产能效率较低的呼吸作用。7172第五节第五节 产品实例分析产品实例分析一、味精发酵机理一、味精发酵机理-谷氨酸的发酵谷氨酸的发酵 73合成谷氨酸的生化途径生化途径葡萄糖丙酮酸草酰乙酸柠檬酸琥珀酸透过细胞膜异柠檬酸- 酮戊二酸谷氨酸谷氨酸74C6H12O6HMP3-磷酸甘油醛丙酮酸乙酰辅酶ACO2草酰乙酸柠檬酸苹果酸异柠檬酸延胡索酸琥珀酸NADPH-KGANADPHNH4+谷氨酸乳酸GA GA 的生物合成途径的生物合成途径乙酰辅酶A乙醛酸循环乙醛酸循环乙醛酸EMPTCA谷氨酸谷氨酸CO2固定固定透透过过细细胞胞膜膜-KGA的还原氨基化的还原氨基化75谷氨酸生产菌的生化特征谷氨酸生产菌的生化特征1 生物素缺陷型生物素缺陷型谷氨酸产生菌大多数为生物素缺陷型,谷氨酸发酵时,通过控制生物素亚适量(贫乏量) ,引起菌种代谢失调, 使谷氨酸得到大量积累。2 具有具有CO2 固定反应的酶系固定反应的酶系菌种能利用CO2 产生大量草酰乙酸, 有利于谷氨酸的大量积累。763.-KGA脱氢酶酶活性微弱或丧失脱氢酶酶活性微弱或丧失这是菌体生成并积累-KGA的关键，从上图可以看出，-KGA是菌体进行TCA循环的中间性产物，很快在-KGA脱氢酶的作用下氧化脱羧生成琥珀酸辅酶A，在正常的微生物体内他的浓度很低，也就是说，由-KGA进行还原氨基化生成GA的可能性很少。只有当体内体内-KGA-KGA脱氢酶活性很低时，脱氢酶活性很低时，TCATCA循环才循环才能够停止，能够停止，-KGA-KGA才得以积累，为谷氨酸的才得以积累，为谷氨酸的生成奠定物质基础生成奠定物质基础。774. GA产生菌体内的产生菌体内的NADPH氧化能力氧化能力欠缺或丧失欠缺或丧失（1）如上图所示，NADPH是-KGA-KGA还原氨基还原氨基化化生成GA必须物质，而且该还原氨基化所需要的NADPH是与柠檬酸氧化脱羧相偶联相偶联 的。（2）由于NADPH的在氧化能力欠缺或丧失，使得体内的NADPH有一定的积累，NADPH对于抑制-KGA的脱羧氧化有一定的意义。785. 产生菌体内乙醛酸循环产生菌体内乙醛酸循环（DCA）的关键酶）的关键酶异柠檬酸裂异柠檬酸裂解酶解酶该酶是一种调节酶，或称为别构酶别构酶，其活性可以通过某种方式进行调节，通过该酶酶活性的调节来实现DCA循环的封闭，DCA 循环的封闭是实现GA发酵的首要条件。糖的代谢才能沿着 - 酮戊二酸的方向进行, 从而有利于谷氨酸的积累。796.菌体有强烈的菌体有强烈的L-谷氨酸脱氢酶活性谷氨酸脱氢酶活性-KGA + NH4+ +NADPH = GA + NADP L-谷氨酸脱氢酶，实质上GA产生菌体内该酶的酶活性都很强， - 酮戊二酸易生成谷氨酸。该反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联，反应机制如下：偶联反应偶联反应 -KGA NADPH -KGA GA NADP 异柠檬酸L-谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶异柠檬酸脱羧氧化异柠檬酸脱羧氧化80GA 生物合成的生物合成的最理想途径最理想途径1. 在前述GA 合成所必需的条件的基础上（，封闭乙醛酸循环）体系不存在CO2固定反应，则有：3/2 C6H12O6 + NH4+ C5H9NO4 + 4 CO2 产率：147 /（180*3/2） = 54.4% 813/2GlucoseEMP丙酮酸丙酮酸 + 丙酮酸丙酮酸 + 丙酮酸丙酮酸CO2乙酰辅酶乙酰辅酶A + 乙酰辅酶乙酰辅酶A + 乙酰辅酶乙酰辅酶A柠檬酸（柠檬酸（DCA循环封闭）循环封闭）谷氨酸谷氨酸不存在CO2固定反应草酰乙酸草酰乙酸822.在前述GA 合成所必需的条件的基础上（，封闭乙醛酸循环）存在CO2固定反应，则有： C6H12O6 + NH4+ C5H9NO4 + CO2 产率：147 / 180 = 81.7%83GlucoseEMP丙酮酸丙酮酸 + 丙酮酸丙酮酸CO2CO2草酰乙酸草酰乙酸（草酰乙酸羧化酶）（草酰乙酸羧化酶）乙酰辅酶乙酰辅酶A + C4二羧酸二羧酸苹果酸苹果酸（苹果酸合成酶）（苹果酸合成酶）柠檬酸（柠檬酸（DCA循环封闭）循环封闭）谷氨酸谷氨酸存在CO2固定反应可见，在GA的生物合成过程中，CO2固定反应对于产率的提高有着多么重要的作用。84CO2固定反应 (1)磷酸丙酮酸羧化酶的作用下 磷酸丙酮酸 + CO2 + GTP = 草酰乙酸 + GDP(2)苹果酸酶的作用下 丙酮酸 + CO2 +NADH = 苹果酸 + NAD 需要Mn+做催化剂，所以，在GA发酵过程中需要向培养基中补充Mn+85提高GA的潜力（1）强化强化COCO2 2固定反应固定反应，具体措施：Mn+ ，生物素？（2）控制溶氧浓度控制溶氧浓度是非常重要的低的溶氧浓度，则丙酮酸向乳酸方向转化高的溶氧浓度，则NADPH 有被氧化的可能，86生物素对GA发酵的影响GA 产生菌大都是生物素的营养缺陷型，即：VH-生物素生物素对发酵的影响是全面的，在发酵对发酵的影响是全面的，在发酵过程中要严格控制其浓度。过程中要严格控制其浓度。 871. 生物素对糖代谢的影响1.VH对于糖酵解有促进作用; 2.对丙酮酸的有氧氧化乙酰辅酶乙酰辅酶A A的生成也有促进作用，但两者的促进作用不一样，对前者大一些这样培养基中如果有较丰富的VH，就会打破糖酵解与丙酮酸氧化之间的平衡，导致丙酮酸的积累，丙酮酸积累则可能导致乳酸的形成，乳酸生成，则使得碳源利用率降低，而且带来的是发酵液的pH值下降。88谷氨酸产生菌的发酵调控控制因子发酵产品转换氧气乳酸或琥珀酸（通气不足）谷氨酸（通气充足）NH4+-酮戊二酸（缺乏）谷氨酸（适量）谷氨酰胺（过量）pHN-乙酰谷氨酰胺（酸性）谷氨酸（中性或微碱性）磷酸缬氨酸（高浓度）谷氨酸生物素乳酸或琥珀酸（丰富）谷氨酸（缺乏）89二、乳制品发酵机理二、乳制品发酵机理-乳酸发酵乳酸发酵 90同型乳酸发酵：通过EMP途径仅产生乳酸的发酵异型乳酸发酵：通过HMP和双歧途径（Bifidus途径）产生乳酸、乙醇、乙酸等有机化合物的发酵91异型乳酸发酵途径2葡萄糖 2ATP 2ADP果糖-6-磷酸 果糖-6-磷酸 ADPATP转醛酶磷酸解酮酶转酮酶赤藓糖-4-磷酸乙酰磷酸木酮糖-5-磷酸乙酸92异型乳酸(乙醇)发酵途径5-磷酸-木酮糖 磷酸(戊糖)解酮酶 乙酰磷酸 3-磷酸甘油醛 ADP Pi+2ADP 2ATP 乙酰CoA 磷酸激酶 NADH2 ATP 乙醛 乙酸 NADH2 NADH2 乙醇 乳酸双歧途径（双歧途径（Bifidus途径）途径）93同型乳酸发酵与异型乳酸发酵的比较类型途径产物产能/葡萄糖菌种代表同型EMP2乳酸2ATPLactobacillus debruckii异型HMP(WD)1乳酸1乙醇1CO21ATPLeuconostoc mesenteroides异型HMP(WD)1乳酸1乙酸1CO22ATPLactobacillus brevis94三、柠檬酸发酵机理关于柠檬酸发酵的机制有多种理论，目前大多数学者认为它与三羧酸循环有密切的关系。糖经糖酵解途径(EMP途径)，形成丙酮酸，丙酮酸羧化形成C4化合物，丙酮酸脱羧形成C2化合物，两者缩合形成柠檬酸。 95柠檬酸的溢出代谢：柠檬酸的溢出代谢： 多种微生物均能因受刺激而过量合成柠檬酸。研究柠檬酸溢出代谢的最好的例子无疑是黑曲霉。黑曲霉之所以能在特定环境条件下累积柠檬酸，是因为在这种环境条件下代谢途径前段的运转速率大于后段的运转速率。 柠檬酸的溢出代谢是黑曲霉特有的遗传和生化机制与培养条件共同起作用的结果。 引起溢出代谢的原因原因包括以下三个方面三个方面：96高水平的柠檬酸合成能力。这个能力由3个因素构成。第一:是在有高浓度草酰乙酸（OAA ）的情况下对 AcCoA 具有高度亲和力的组成型的柠檬酸合成酶（ CS ）的存在；第二:是催化丙酮酸（ PYR ）固定CO2生成草酰乙酸反应的高水平的组成型的丙酮酸羧化酶（ PC ）的存在；97第三:是在缺少锰的条件下，蛋白质分解或蛋白质合成受阻造成的铵的高浓度能解除柠檬酸（CTA）对磷酸果糖激酶（PFK）的抑制。此外，柠檬酸的分泌，降低其胞内浓度。98较低的降解柠檬酸的能力。这能力由两个因素构成。第一是低水平的-酮戊二酸脱氢酶（KD）影响TCA环运行的畅通程度，使TCA环前半部的中间产物积压； 第二，在锰缺乏的条件下，顺乌头酸酶（AE）和 异柠檬酸脱氢酶（ID）的活性降低，从而使柠檬酸的累积比其它几种酸（顺乌头酸、异柠檬酸和-酮戊二酸）更明显。99 在柠檬酸过量合成阶段，培养基的 pH 值显然会影响细胞膜对目的产物柠檬酸的跨膜输送；柠檬酸的分泌也会影响培养基的 pH值。锰与铁的缺乏有利于柠檬酸的排出。100黑黑曲曲霉霉中中柠柠檬檬酸酸的的代代谢谢溢溢出出GG-6-P(磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶)柠檬酸柠檬酸 ,NH4I+A1.6二磷酸果糖丙酮酸草酰乙酸草酰乙酸乙酰CoA柠檬酸柠檬酸顺乌头酸顺乌头酸异柠檬酸异柠檬酸-酮戊二酸酮戊二酸(丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶)(柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶)-酮戊二酸脱氢酶酮戊二酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶顺乌头酸酶顺乌头酸酶顺乌头酸酶顺乌头酸酶101TCA循环在柠檬酸积累中的调节1)大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键；2)丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代谢调节的控制或极微弱;3)TCA循环的阻断或微弱(即顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶和酮戊二酸脱氢酶活力降低)，导致柠檬酸积累。而且，当柠檬酸浓度超过一定水平，就抑制异柠檬酸脱氢酶活力来提高自身的积累。102回补途径回补途径TCA循环重要功能除产能外，为一些氨基酸循环重要功能除产能外，为一些氨基酸和其它化合物的合成提供了中间产物；和其它化合物的合成提供了中间产物；生物合成中所消耗的中间产物若得不到补充，生物合成中所消耗的中间产物若得不到补充，循环就会中断；循环就会中断；回补方式：回补方式：通过某些化合物通过某些化合物CO2固定作用，固定作用， 一些转氨基酶所催化的反应也一些转氨基酶所催化的反应也能合成草酰乙酸和能合成草酰乙酸和 -酮戊二酸，酮戊二酸， 通过乙醛酸循环通过乙醛酸循环103通过某些化合物的通过某些化合物的CO2固定作用使三羧酸循环的中固定作用使三羧酸循环的中间产物得到回补：间产物得到回补：丙酮酸羧化酶：丙酮酸羧化酶： CO2+丙酮酸丙酮酸+ATP+H2O Mg+ 草酰乙酸草酰乙酸+ADP+Pi磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶: CO2 +PEP+ H2O 草酰乙酸草酰乙酸+H3PO4苹果酸酶苹果酸酶: CO2 +丙酮酸丙酮酸+NADPH+H+ 苹果酸苹果酸+ NADP+ 为了能够在己糖或戊糖的中间代谢物上进行好氧生长，异为了能够在己糖或戊糖的中间代谢物上进行好氧生长，异养微生物至少要具备上述几种酶之种的一个酶。养微生物至少要具备上述几种酶之种的一个酶。 CO2固定作用补充TCA环的中间产物104105转氨基作用转氨基作用定义：定义： -氨基酸的氨基通过酶的催化,转移到-酮酸 的酮基上,生成相应的氨基酸;原来的-氨基酸则转变成相应的-酮酸 。R1 CHNH2 + COOHR2 C=O COOHR1C=O +COOHR2CHNH2 COOH 转氨酶转氨酶106转氨基作用几点说明：转氨基作用几点说明：（1 1）可逆反应，）可逆反应，（2 2）转氨酶的辅酶是磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺）转氨酶的辅酶是磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺（3 3）重要的转氨酶：）重要的转氨酶： 丙氨酸转移酶（丙氨酸转移酶（ALTALT）/ /谷丙转氨酶（谷丙转氨酶（GPTGPT） 天冬氨酸转移酶（天冬氨酸转移酶（ASTAST）/ /谷草转氨酶谷草转氨酶 (GOT)(GOT) ALTALT常用于肝疾患（肝炎等）辅助诊断、常用于肝疾患（肝炎等）辅助诊断、 AST AST 用于心肌疾患（心肌梗塞等的辅助诊断）用于心肌疾患（心肌梗塞等的辅助诊断）107 CH3 H-C-NH2 + COOH COOH （CH2）2 C=O COOH 丙氨酸丙氨酸 -酮戊二酸酮戊二酸 丙酮酸丙酮酸 谷氨酸谷氨酸ALT：谷丙转氨酶，急性肝炎时血清谷丙转氨酶，急性肝炎时血清ALT 活性显著增高。活性显著增高。ALT CH3 C=O + COOH COOH （CH2）2 H- C-NH2 COOH108 COOH CH2 +H-C-NH2 COOH COOH （CH2）2 C=O COOHAST 天冬氨酸天冬氨酸 -酮戊二酸酮戊二酸 草酰乙酸草酰乙酸 谷氨酸谷氨酸AST：谷草转氨酶，心肌梗塞时血清含量明显增高：谷草转氨酶，心肌梗塞时血清含量明显增高. COOH CH2 + C=O COOH COOH （CH2）2 H-C-NH2 COOH109乙醛酸循环乙醛酸循环草酰乙酸草酰乙酸柠檬酸柠檬酸琥珀酸琥珀酸异柠檬酸异柠檬酸苹果酸苹果酸延胡索酸延胡索酸乙醛酸乙醛酸乙酰乙酰CoA乙酰乙酰CoA乙酸乙酸乙酸乙酸110乙醛酸循环乙醛酸循环能够利用乙酸的微生物具有乙酰CoA合成酶，它使乙酸转变为乙酰CoA；然后在异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶的作用下进入乙醛酸循环。乙醛酸循环的主要反应：乙醛酸循环的主要反应： 异柠檬酸异柠檬酸 琥珀酸琥珀酸 +乙醛酸乙醛酸 乙醛酸乙醛酸 + 乙酸乙酸 苹果酸苹果酸 琥珀酸琥珀酸 + 乙酸乙酸 异柠檬酸异柠檬酸 净反应：净反应：2乙酸乙酸 苹果酸苹果酸111柠檬酸发酵机理柠檬酸的发酵机理可概括为：大量的胞内NH4+和呼吸活性提高，使通过糖酵解途径的代谢得到加强葡萄糖经EMP通路分解成为丙酮酸，进入三羧酸循环，在丙酮酸脱氢酶复合物作用下氧化成为乙酰CoA及CO2，然后在柠檬酸合成酶作用下与草酰乙酸缩合而形成柠檬酸，而异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶因受到抑制，而使柠檬酸得以积累。112葡萄糖葡萄糖 丙酮酸丙酮酸 + 丙酮酸丙酮酸 乙酰辅酶乙酰辅酶A(CH3CO-CoA)CO2固定反应固定反应 + 草酰乙酸草酰乙酸顺乌头酸酶顺乌头酸酶柠檬酸柠檬酸异柠檬酸异柠檬酸异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶琥珀酸琥珀酸KGA（柠檬酸合成酶）（柠檬酸合成酶）柠檬酸发酵机理柠檬酸发酵机理按照正常的微生物菌体的代谢规律，上按照正常的微生物菌体的代谢规律，上述途径并不能够积累柠檬酸，而是进入述途径并不能够积累柠檬酸，而是进入TCATCA循环，被彻底氧化，柠檬酸产生菌循环，被彻底氧化，柠檬酸产生菌之所以能够大量积累柠檬酸，其产生菌之所以能够大量积累柠檬酸，其产生菌菌种必须具备一定的内在因素，也就是：菌种必须具备一定的内在因素，也就是：柠檬酸后述的各种酶，主要是，柠檬酸后述的各种酶，主要是，顺乌头顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶酶酸酶、异柠檬酸脱氢酶酶 的活性丧失的活性丧失或非常微弱，否则，合成的柠檬酸迅速或非常微弱，否则，合成的柠檬酸迅速被降解成其他物质。被降解成其他物质。113柠檬酸生物合成中的代谢调节与控制追求柠檬酸的高产率 柠檬酸是微生物生长代谢过程中的一个中间性产物，在正常的微生物体内不能够积累的，如果有积累的话，与柠檬酸合成有关的各种酶的活性，则会受到抑制或阻遏，那么，柠檬酸发酵过程中，这种抑制或阻遏是如何被克服的呢？ 1141.磷酸果糖激酶（PFK）活性的调节？ 在正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶有抑制作用，而AMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是从葡萄糖柠檬酸的合成过程中，PFK 是一种调节酶或者称之为关键酶，其酶活性受到柠檬酸的强烈抑制，这种抑制必须解除，否则，柠檬酸合成的途径就会因为该酶活性的抑制而被阻断，停止柠檬酸的合成，研究表明，微生物体内的NH4+，可以解除柠檬酸对PFK的这种反馈抑制作用，在较高的NH4+的浓度下，细胞可以大量形成柠檬酸，那么NH4+ 浓度是如何升高的呢还能解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用。 铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，正是由于细胞内铵离子浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。115 研究表明，柠檬酸产生菌黑曲霉如果生长在Mn+ 缺乏的培养基中，NH4+浓度异常的高，可达到25mmol/L，显然，由于Mn+的缺乏，使得微生物体内NH4+浓度升高，进而解除了柠檬酸对PFK活性的抑制作用，使得葡萄糖源源不断的合成大量的柠檬酸。116Mn+ 缺乏如何会使缺乏如何会使NH4+浓度升高呢浓度升高呢？当培养基中Mn+ 缺乏时，NH4+浓度升高，同时微生物体内积累几种氨基酸（GA谷氨酸、Arg、Gin谷氨酰胺等），这些氨基酸的积累，意味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受到影响，这样NH4+的消耗下降，NH4+浓度就会升高，微生物体内蛋白质和氨基酸的代谢关系可以使用下图示之：1172.顺乌头酸酶活性的控制随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活(顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2.0时失活)，更有利于柠檬酸的积累及排出该酶的丧失或失活是阻断TCA循环，大量生成柠檬酸的必要条件。通常柠檬酸产生菌体内该酶的活性本身就要求很弱，但在发酵过程中仍需要控制它的活性。由于该酶的活性受到Fe2+ 的影响，控制培养基中的Fe2+ 的浓度，可以使该酶失活。因此，柠檬酸发酵要求采用不锈钢反应器，目的就是控制培养基中的Fe2+的浓度。但是在柠檬酸发酵过程中，培养基中的Fe2+的浓度有要求不能够低于0.1mg/L，原因目前尚没有搞清楚。118顺乌头酸酶的活性：从理论上推测，顺乌头酸酶失活，三羧酸循环阻断是累积柠檬酸的必要条件。 许多实验指出顺乌头酸酶活力变化与柠檬酸累积有密切关系。例如，产酸菌株的顺乌头酸酶活力比非产酸菌株低，产酸期比生长期低，生长在产酸培养基上菌株的顺乌头酸酶活比生长在非产酸培养基上的低。 添加顺乌头酸酶抑制剂可促进柠檬酸积累。 铁为顺乌头酸酶的激活剂，用亚铁氰化钾除铁，可以握高柠檬酸产率。119那么，解决了柠檬酸发酵过程中的上述几个问题：，是不是就意味着可以将葡是不是就意味着可以将葡萄糖源源不断的转化成柠檬酸呢萄糖源源不断的转化成柠檬酸呢？ 提问：根据微生物代谢调节的基本理论，还需要解决什么问题？120菌体要大量合成柠檬酸，从葡萄糖经过EMP到柠檬酸整个代谢途径需要畅通，在这个过程中：丙酮酸氧化脱羧，每分子丙酮酸可产生一分子的NADH，在有氧的条件下，每分子的NADH经过呼吸链彻底氧化成H2O，并氧化磷酸化产生3分子的ATP，造成了微生物体内能荷能荷的增加，能荷增加则抑制PFK等关键酶的酶活性，使得从葡萄糖到柠檬酸的代谢停止，怎么能够大量合成柠檬酸呢？3.能荷能荷调节对柠檬酸发酵的影响121如果NADH（还原型）不能够快速的被氧化转变成NAD（氧化型），则整个反应就会因为缺乏作为推动力的氧化型的NAD而停止，仍然不能够合成柠檬酸。122柠檬酸产生菌可在有氧的条件下大量生成柠檬酸，也就是说，NADH即被氧化了，又没有产生ATP。为了解释这种现象，有人提出了一种假设：该菌体内存在一条侧系呼吸链，NAD(P)H经过该呼吸链，可以正常的传递H+，将其氧化为H2O，但是并没有氧化磷酸化生成ATP，能够正常产生ATP的呼吸链称之为标准呼吸链。123解偶联剂（解偶联剂（uncoupleruncoupler）? ?使氧化和磷酸化脱偶联，氧化仍可以进行，而磷酸化不能使氧化和磷酸化脱偶联，氧化仍可以进行，而磷酸化不能进行，解偶联剂为离子载体或通道，能增大线粒体内膜对进行，解偶联剂为离子载体或通道，能增大线粒体内膜对H H+ +的通透性，消除的通透性，消除H H+ +梯度，因而无梯度，因而无ATPATP生成，使氧化释放出来生成，使氧化释放出来的能量全部以热的形式散发。动物棕色脂肪组织和肌肉线的能量全部以热的形式散发。动物棕色脂肪组织和肌肉线粒体中有独特的解偶联蛋白粒体中有独特的解偶联蛋白(uncoupling proteins(uncoupling proteins， UCPs)UCPs)，与维持体温有关。常用解偶联剂主要有：，与维持体温有关。常用解偶联剂主要有：质子载体：质子载体： 2 2，4-4-二硝基酚二硝基酚(DNP(DNP，图，图) )，羰基，羰基- -氰氰- -对对- -三氟三氟甲氧基苯肼甲氧基苯肼(FCCP)(FCCP)。质子通道：增温素（质子通道：增温素（thermogeninthermogenin）。）。其它离子载体：如缬氨霉素。其它离子载体：如缬氨霉素。某些药物：如过量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶联，某些药物：如过量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶联，从而使体温升高。从而使体温升高。124实验证明，在某些微生物体内确实存在侧系呼吸链，该侧系呼吸链中的酶系强烈需氧，如在柠檬酸的发酵中，发酵液的溶氧浓度在很低水平维持一段时间，或中断供氧一段时间（20分钟），则这一侧系呼吸链不可逆的失不可逆的失活活，其结果是菌体不再产酸，而是产生了大量的菌体。标准呼吸链的存在使得菌体在代谢过程中产生了大量的ATP，用于菌体自身的生长上，这种现象，在生产上通常称之为：只长菌不产酸只长菌不产酸 ，大量的葡萄糖被消耗了，却没有生产出柠檬酸，是一种失败，（大型柠檬酸生产企业需要自己备用的发电系统）。125 理论可以指导实践，反过来，通过实理论可以指导实践，反过来，通过实践可以推动理论研究，丰富理论研究成践可以推动理论研究，丰富理论研究成果。果。 科学研究过程中的许多基本规律科学研究过程中的许多基本规律是相同的，今天，我们在大学的学习，是相同的，今天，我们在大学的学习，更多的是学习一种方法或者说一种思维。更多的是学习一种方法或者说一种思维。通过这个例子，我们可以学习到许多专通过这个例子，我们可以学习到许多专业以外的知识业以外的知识首先为了解释一种客首先为了解释一种客观想象，提出一种假设，然后通过实验观想象，提出一种假设，然后通过实验来证明这种假设来证明这种假设126能量平衡EMP中底物水平磷酸化2ATPEMP途径2NADH丙酮酸氧化脱羧2NADH可以满足生产菌的维持能量消耗，不需要消耗C源经TCA来产能127谷风优质CO2固定反应 通过 CO2固定反应提供C4二羧酸 （1）磷酸烯醇式丙酮酸 + CO2 = 草酰乙酸（C4二羧酸） 酶：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（2）丙酮酸 + CO2 = 草酰乙酸（C4二羧酸） 酶：丙酮酸羧化酶 以上两种CO2固定反应所需要的辅酶都是生物素。128柠檬酸发酵中，三个控制点柠檬酸发酵中，三个控制点 C6H12O6控制Mn+NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的抑制（1）点：EMP畅通无阻控制溶氧，防止侧系呼吸链失活丙酮酸+丙酮酸（2）点：通过CO2固定反应生成C4二羧酸乙酰辅酶A+C4二羧酸柠檬酸（3）点：柠檬酸后述的酶活性丧失或很低，控制培养基中的Fe2+的浓度柠檬酸发酵中，三个控制点柠檬酸发酵中，三个控制点129第一个调节酶是磷酸果糖激酶（PFK） 柠檬酸和ATP对该酶有抑制 生产菌需要解除该抑制作用AMP、无机磷以及NH4+对该酶有活化作用NH4+有效解除柠檬酸和ATP对该酶有抑制 ，故生产上通过添加铵盐来提高柠檬酸产量 Mn2+的影响：Mn2+缺乏菌体的TCA酶活下降Mn2+缺乏可能干扰蛋白质合成，导致蛋白质分解NH4+水平升高减少柠檬酸对该酶的抑制130谷风优质第二个调节点：CO2固定的酶活力高，保证草酰乙酸的供应第三个调节点：TCA环上调节柠檬酸合成酶： 许多细胞中该酶是TCA的调节酶，但在黑曲霉中此酶无调节作用顺乌头酸水合酶：理论上此酶失活TCA环阻断积累柠檬酸顺乌头酸水合酶需要Fe2+故在发酵液中添加黄血盐络合Fe2+阻断TCA环，积累柠檬酸131为什么在A. nigar中异柠檬酸不会进一步分解及柠檬酸的积累机制？黑曲霉乌头酸水合酶存在于线粒体中，它催化的反应存在着柠檬酸：异柠檬酸：顺式乌头酸 = 90：7：3的平衡关系；黑曲霉对辅酶NAD+专一性的异柠檬酸脱氢酶活力很低，却有三种依赖于辅酶NADP+的异柠檬酸脱氢酶，其中的两种与存在于线粒体的酶及TCA循环有关，它们受到生理浓度柠檬酸的抑制。132柠檬酸生物合成途径133柠檬酸的积累机制总结1)由于Mn2缺乏抑制了蛋白质合成，导致细胞内NH4浓度升高和有一条呼吸活力强的不产生ATP的侧系呼吸链，这两方面的原因分别解除了对磷酸果糖激酶（PFK）的抑制，促进了EMP途径的畅通；2)由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制，就源源不断地提供草酰乙酸（CO2固定）。丙酮酸氧化脱酸生成乙酰-CoA和CO2固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸能力。134柠檬酸的积累机制总结3)顺乌头酸水合酶在催化时建立以下平衡：柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸9037；4)控制Fe2+含量，顺乌头酸酶活力低，使柠檬酸积累；5)一旦柠檬酸浓度升高到某一水平就抑制异柠檬酸脱氢酶活力，从而进一步促进了柠檬酸自身积累；6)柠檬酸积累使pH值降低，在低pH值下，顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，就更有利于柠檬酸的积累并排出体外。135