第第六六节节植植物物克克隆隆载载体体一、一、Ti质粒载体质粒载体1.根癌农杆菌根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)与与Ti质粒质粒G-菌，可侵入菌，可侵入90科双子叶植物受伤组织，形成冠瘿科双子叶植物受伤组织，形成冠瘿瘤瘤(crowngalltumor)。冠瘿瘤细胞具有以下特征：。冠瘿瘤细胞具有以下特征：i.不需要补充植物激素便可进行离体培养不需要补充植物激素便可进行离体培养 ii. ii.合成肿瘤特有的化合物合成肿瘤特有的化合物冠瘿碱冠瘿碱(opine)(opine)，能专一，能专一 的为根癌农杆菌所利用的为根癌农杆菌所利用. . 这两个特征由这两个特征由TiTi质粒决定，质粒决定，但该质粒中仅有一部分进入植物细胞。但该质粒中仅有一部分进入植物细胞。1)Ti质粒类型质粒类型（由（由Ti质粒所产生的冠瘿碱种类而定）质粒所产生的冠瘿碱种类而定）i.鱆鱼碱类鱆鱼碱类(octopine)ii.胭脂碱类胭脂碱类(nopaline)iii.农碱类农碱类(agropine)2)Ti质粒的结构质粒的结构i.环状环状ds-DNA,160-250kb，具六个功能区，具六个功能区i)致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素ii)冠瘿碱合成区：参与冠瘿碱合成冠瘿碱合成区：参与冠瘿碱合成iii)冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱分解冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱分解iv)Ti质粒转移区质粒转移区(tra)：参与不同农杆菌中的接合转移：参与不同农杆菌中的接合转移v)毒（性）区：参与毒（性）区：参与T-DNA的转移和插入植物染色体的转移和插入植物染色体vi)DNA复制区：参与复制区：参与Ti质粒质粒DNA复制复制Ti质粒的结构质粒的结构ii.T-DNAT-DNA包括植物激素冠瘿碱合成区基因及两侧相同的包括植物激素冠瘿碱合成区基因及两侧相同的25bp重复序列，重复序列，T-DNA整合不具特异性，右侧整合不具特异性，右侧25bp重重复序列对复序列对T-DNA的转移至关重要。的转移至关重要。不同不同Ti质粒中的质粒中的T-DNA结构是不相同的，其中结构是不相同的，其中i)胭脂碱胭脂碱Ti质粒的质粒的T-DNA长长23bp,结构连续，具结构连续，具13个基因个基因ii)鱆鱼碱鱆鱼碱Ti质粒中的质粒中的T-DNA不连续，分左右两段，分别不连续，分左右两段，分别称之为称之为TL和和TR,TLDNA长长13.2kb,含含8个基因，包括鱆个基因，包括鱆鱼碱合成酶和植物激素合成基因鱼碱合成酶和植物激素合成基因,TRDNA长长7.9kb，含含5个基因，参与甘露碱个基因，参与甘露碱(mannopine)和农碱合成和农碱合成 iii) )两者同源性：主要集中在植物激素合成区。两者同源性：主要集中在植物激素合成区。Ti质粒的质粒的T-DNA的同源性的同源性2.Ti质粒载体质粒载体1)Ti质粒作为载体的问题质粒作为载体的问题i)太大，无适合克隆位点太大，无适合克隆位点ii)T-DNA的存在不能使转化细胞再生为完整植株的存在不能使转化细胞再生为完整植株2)载体类型载体类型i)中间载体中间载体(intermediatevector) 由以下几部分组成：由以下几部分组成： 适合于适合于E.coliE.coli和和A.tumefaciensA.tumefaciens自主复制和选择用标记自主复制和选择用标记基因基因 适合于植物细胞选择用标记基因适合于植物细胞选择用标记基因 一段来自天然一段来自天然TiTi质粒的部分质粒的部分T-DNAT-DNA序列（提供同源重组）序列（提供同源重组） 1-21-2个来自个来自T-DNAT-DNA的的25bp25bp重复序列重复序列 用于表达外源基因的用于表达外源基因的DNADNA序列（如启动子、终止子序列）序列（如启动子、终止子序列）重组重组重组重组DNADNA的转移过程的转移过程的转移过程的转移过程：中间载体或重组子中间载体或重组子E.coli(中宿主中宿主)A.tumefaciens在根癌农杆菌中与天然在根癌农杆菌中与天然Ti质粒或非致瘤质粒发生质粒或非致瘤质粒发生共共整合作用整合作用感染植物受伤组织或与植物细胞共培养感染植物受伤组织或与植物细胞共培养T-DNA进入植物细胞并整合到染色体进入植物细胞并整合到染色体DNA中中外外源基因表达源基因表达转化转化接合接合转移转移根癌农杆菌中根癌农杆菌中Ti质粒的转移质粒的转移Ti载体的共整合作用载体的共整合作用Ti质质粒粒衍衍生生的的植植物物克克隆隆载载体体非非致致瘤瘤载载体体的的重重组组ii)非致瘤非致瘤Ti质粒载体质粒载体(disarmedTiplasmid)该类载体实际上是辅助载体，其特点是用该类载体实际上是辅助载体，其特点是用pBR322DNA取代了取代了Ti质粒中参与植物激素合成基因序列，它可以质粒中参与植物激素合成基因序列，它可以与含有与含有pBR322序列的序列的DNA发生同源重组，构成一个完整发生同源重组，构成一个完整的重组的重组DNA序列，然后转移至植物细胞。序列，然后转移至植物细胞。如果在中间载体中插入一个如果在中间载体中插入一个T-DNA的的25bp重复序列，重复序列，在非致瘤在非致瘤Ti质粒载体中插入另一个质粒载体中插入另一个25bp重复序列，经重组重复序列，经重组后形成一个完整的后形成一个完整的T-DNA，这种系统称之为，这种系统称之为分离末端载体分离末端载体系统系统(SEV,SplitEndVector)。iii)双末端载体双末端载体(binaryvector) 该类载体的显著特点是含有两个该类载体的显著特点是含有两个T-DNAT-DNA末端，所有需要末端，所有需要转移到植物细胞中去的序列都位于其间。转移到植物细胞中去的序列都位于其间。分离末端载体的共整合作用分离末端载体的共整合作用(SEV)例子例子:pBIN19的结构的结构T-DNA的转移必须依赖于辅助质粒，的转移必须依赖于辅助质粒，pAL4404就是一个就是一个T-DNA全部丢失的天然缺失突变体。转移过程：全部丢失的天然缺失突变体。转移过程：pBIN19E.coliA.tumefaciensT-DNA进入植物细胞进入植物细胞该系统的最终转化频率比该系统的最终转化频率比SEV系统高得多系统高得多3）标记基因标记基因生化标记基因生化标记基因：冠瘿碱合成酶基因（：冠瘿碱合成酶基因（NOS，OCS）lacZ,CAT,荧光酶基因，荧光酶基因，GUS药物抗性标记基因药物抗性标记基因：除草剂耐受性基因，：除草剂耐受性基因，CHMT（金（金属巯蛋白基因），属巯蛋白基因），Bleomycin，Hgyr，SPT,DHFR,NPT(Kanr,G418r)标记基因常用的启动子有标记基因常用的启动子有CaMV35S,OCS,NOS等。等。转化转化接合接合转移转移植物的双元载体植物的双元载体pBIN19二、病毒载体二、病毒载体1.DNA病毒载体病毒载体1）CaMV：8kb，环状，环状ds-DNA，8个个ORF，致死，最，致死，最多可容纳多可容纳800bp外源外源DNA，只能用语作短暂表达，只能用语作短暂表达(transientexpression)2)双生病毒：双生病毒：2.5-3kb,环状环状ss-DNA，可感染单子叶植物，可感染单子叶植物，短暂表达。，短暂表达。2.RNA病毒载体病毒载体BMV（雀麦花叶病毒）和（雀麦花叶病毒）和TMV载体优点：载体优点：1）转化频率高）转化频率高;2）宿主范围广）宿主范围广;3）高拷贝，外源基因高效表达。）高拷贝，外源基因高效表达。第第七七节节动物分子克隆载体动物分子克隆载体一一.构建动物克隆载体的病毒种类和特征构建动物克隆载体的病毒种类和特征病毒类型病毒类型例子例子病毒大小病毒大小(nm)基因组结构基因组结构基因组大小基因组大小(kb)细小病毒细小病毒野生型野生型H-1,RV,MVM20ss-DNA缺陷型缺陷型AAV乳多空病毒乳多空病毒乳实瘤乳实瘤兔兔,人人(BPV)30-50环状环状ds-DNA多型瘤多型瘤小鼠肿瘤小鼠肿瘤空泡空泡SV40，BKV腺病毒腺病毒人人(AD)80-90ds-DNA30-40疱疹病毒疱疹病毒HSV,EBV100-150ds-DNA80-140痘病毒痘病毒300200100ds-DNA240-300逆病毒逆病毒MLV,MSV100-120ss-RNA8.5二二.病毒型载体病毒型载体1.特点特点1)可在动物细胞中形成病毒颗粒（形态构成组分来自可在动物细胞中形成病毒颗粒（形态构成组分来自天然病毒或原病毒细胞）天然病毒或原病毒细胞）2)DNA转移效率高，但必须与天然转移效率高，但必须与天然(辅助辅助)病毒共感染病毒共感染动物细胞动物细胞3)大多数被感染动物细胞将是致死的，但有少数病毒大多数被感染动物细胞将是致死的，但有少数病毒（如逆病毒）载体可稳定整合到染色体（如逆病毒）载体可稳定整合到染色体DNA中。中。4)插入病毒载体的外源基因只能在动物细胞中作瞬时插入病毒载体的外源基因只能在动物细胞中作瞬时表达表达2.载体种类载体种类根据构建载体的病毒基因大小可分为两类：根据构建载体的病毒基因大小可分为两类：1）复制型复制型：由小分子病毒：由小分子病毒DNA构建而成，具复制起点，构建而成，具复制起点，其克隆位点可在病毒其克隆位点可在病毒DNA之内，亦可在病毒之内，亦可在病毒DNA之外，这之外，这类载体有的容量十分有限（如类载体有的容量十分有限（如SV40），有的则很大（如），有的则很大（如HSV），其容量大小主要取决于病毒外壳蛋白的包装能力。），其容量大小主要取决于病毒外壳蛋白的包装能力。2）非复制型非复制型：这类载体是在细菌克隆载体中插入一段病：这类载体是在细菌克隆载体中插入一段病毒毒DNA（不含复制起点）。当外源（不含复制起点）。当外源DNA插入该载体后，与插入该载体后，与相应的天然病毒一起感染动物细胞，外源相应的天然病毒一起感染动物细胞，外源DNA可借助两病可借助两病毒毒DNA同源部分的重组插入天然病毒。这类载体特别适合同源部分的重组插入天然病毒。这类载体特别适合于那些较大的病毒于那些较大的病毒DNA分子。分子。实例实例：痘病毒长：痘病毒长180kb,编码编码150多种多肽，整个生存阶段多种多肽，整个生存阶段均在细胞质内，它能合成均在细胞质内，它能合成DNA复制、转录和转录后修饰的复制、转录和转录后修饰的各种酶类，由此病毒构建的非复制型载体就是在细菌载体各种酶类，由此病毒构建的非复制型载体就是在细菌载体中插入一段痘病毒中插入一段痘病毒DNA.三三.质粒型载体质粒型载体1.特点特点：不能形成病毒颗粒，以高拷贝质粒形式存在于动物不能形成病毒颗粒，以高拷贝质粒形式存在于动物细胞内，不导致动物细胞死亡。细胞内，不导致动物细胞死亡。2.组成组成：pMB1和病毒复制起点（如和病毒复制起点（如SV40，BPV，EBV等），等），适合于细菌和动物细胞的选择标记基因。适合于细菌和动物细胞的选择标记基因。3.实例实例1)SV40质粒载体质粒载体SV40具如下物理图谱，具如下物理图谱，5243bp,为两种抗原（为两种抗原（T-和和t-抗原）和抗原）和三种病毒衣壳蛋白编码。其中三种病毒衣壳蛋白编码。其中T-抗原参与抗原参与SV40的有效感染，并能的有效感染，并能特异地结合在病毒特异地结合在病毒DNA复制起点上，这种结合对复制起点上，这种结合对DNA复制是必复制是必须的。因复制起点与该基因的启动子顺序相近，故它本身的表达须的。因复制起点与该基因的启动子顺序相近，故它本身的表达也受到也受到T-抗原的控制。抗原的控制。当含当含SV40复制起点的质粒型载体或重组复制起点的质粒型载体或重组DNA分子转入分子转入COS细胞后细胞后(含有含有SV40的的T-抗原抗原)可大量复制可大量复制,其拷贝数可达其拷贝数可达20-40万。万。SV40质粒载体质粒载体2)BPV-1质粒载体质粒载体BPV-1中中69T是转化动物细胞所必需的是转化动物细胞所必需的,约占该病毒约占该病毒DNA总长总长的的69%,单向转录。由单向转录。由69T和和E.coli质粒载体构成穿梭质粒载体。质粒载体构成穿梭质粒载体。BPV质粒载体质粒载体三三.整合型载体整合型载体这类载体可借助同源重组作用使外源基因插入染色体或病毒这类载体可借助同源重组作用使外源基因插入染色体或病毒基因组中。基因组中。1.逆病毒克隆载体逆病毒克隆载体1)逆病毒用于载体的优点逆病毒用于载体的优点:i.基因组小基因组小,易于操作易于操作ii.高滴度高滴度,易于导入细胞易于导入细胞iii.准确整合入受体细胞染色体中准确整合入受体细胞染色体中,外源基因可稳定表达，外源基因可稳定表达，具有具有强转录增强子强转录增强子,可在多种细胞中高效表达外源基因可在多种细胞中高效表达外源基因2)逆病毒载体的用途逆病毒载体的用途i.基因治疗基因治疗ii.在胚胎组织中研究特定基因的发育功能在胚胎组织中研究特定基因的发育功能iii.可用作家系标记可用作家系标记iv.导入生殖细胞或胚胎干细胞导入生殖细胞或胚胎干细胞,产生转基因动物产生转基因动物v.用作插入突变剂用作插入突变剂vi.用于逆病毒分子生物学研究用于逆病毒分子生物学研究3)逆病毒的生活史和基因组结构逆病毒的生活史和基因组结构生活史生活史:病毒粒子感染病毒粒子感染反转录为线状反转录为线状ds-DNA整合到染色体整合到染色体中转录为中转录为2个个mRNA分子分子翻译成病毒蛋白翻译成病毒蛋白包装成病包装成病毒粒子毒粒子释放到细胞外释放到细胞外结构结构:i.长末端重复长末端重复(longterminalrepeat,LTR)ii.正链和反链引物序列正链和反链引物序列PB(-),PB(+)iii.包装序列包装序列(gag基因编码区基因编码区5-端端420bp序列序列)iv.反式作用基因反式作用基因:gag核心蛋白核心蛋白;pol反转录酶反转录酶/整合酶整合酶;env-外壳糖蛋白外壳糖蛋白v.RNA剪接供体和受体序列剪接供体和受体序列SD,SA4)逆病毒的宿主范围逆病毒的宿主范围i.种特异性种特异性-窄谱窄谱(ecotrophic):如如M-MLV仅限于鼠细胞；仅限于鼠细胞；广谱广谱(amphotropic):如如MLV在鸟和哺乳动物细胞在鸟和哺乳动物细胞,用用M-MLV所构建的载体也可具广谱性所构建的载体也可具广谱性,只要用广谱逆病毒的外只要用广谱逆病毒的外壳蛋白包装即可壳蛋白包装即可ii.组织特异性组织特异性-成纤维细胞成纤维细胞,淋巴细胞淋巴细胞,上皮细胞上皮细胞iii.免疫性免疫性5)逆病毒克隆载体逆病毒克隆载体i.单基因载体单基因载体仅保留逆病毒的仅保留逆病毒的LTR序列序列,无标记基因无标记基因ii.双基因载体双基因载体:剪接载体剪接载体;内启动子载体内启动子载体;双顺反子载体双顺反子载体。在在剪接载体剪接载体中中,逆病毒的逆病毒的LTR序列和剪接位点保留序列和剪接位点保留,两两基因共用一个启动子和翻译起始区基因共用一个启动子和翻译起始区;在在双顺反子载体双顺反子载体中中,两基因共用一个基因启动子两基因共用一个基因启动子,但有各自的翻译起始但有各自的翻译起始区区;在在内启动子载体内启动子载体中中,两基因各有自己的启动子两基因各有自己的启动子iii.自失活载体自失活载体(self-inactivationvector)iv.自主复制载体自主复制载体(replication-competentvector)2.痘病毒克隆载体痘病毒克隆载体将痘病毒的部分将痘病毒的部分DNA插入细菌载体中插入细菌载体中,借助同源序列借助同源序列的重组作用整合到病毒基因组中的重组作用整合到病毒基因组中逆逆病病毒毒的的结结构构和和载载体体结结构构3.昆虫核型多角体病毒载体昆虫核型多角体病毒载体该类病毒载体是病毒整合型表达载体，具有以下优点：该类病毒载体是病毒整合型表达载体，具有以下优点：1）外源基因可获得高表达：）外源基因可获得高表达：1-500mg/L培养物培养物2）表达产物仍具有生物学活性）表达产物仍具有生物学活性3）重组效率高）重组效率高昆昆虫虫杆杆状状病病毒毒表表达达系系统统昆虫杆状病毒的昆虫杆状病毒的转移载体和表达载体转移载体和表达载体三三.标记基因标记基因1.tk基因和基因和dhfr基因基因(胸苷激酶和二氢叶酸还原酶基因胸苷激酶和二氢叶酸还原酶基因)需相应的突变体需相应的突变体2.gpt基因（来自基因（来自E.coli）非转化细胞可生长在加有氨基喋呤和霉酚酸，腺嘌呤的非转化细胞可生长在加有氨基喋呤和霉酚酸，腺嘌呤的培养基中。若培养基中不加入鸟嘌呤而改用黄嘌呤则此细胞培养基中。若培养基中不加入鸟嘌呤而改用黄嘌呤则此细胞不能生长，但转化性细胞则能在此培养基中生长。不能生长，但转化性细胞则能在此培养基中生长。 3.3.药物抗性基因药物抗性基因Tn5的氨基糖的氨基糖3-磷酸转移酶基因可抗磷酸转移酶基因可抗neomycin，Kanamycin，G418（抑制真核细胞的蛋白质合成）（抑制真核细胞的蛋白质合成）,潮霉素抗性基因等。潮霉素抗性基因等。