实实 验验 二二蛋白质的两性反应蛋白质的两性反应与与等电点测定等电点测定1实验二.蛋白质的两性反应与等电点测定n 了解蛋白了解蛋白质的两性解离性的两性解离性质n 掌握掌握测定蛋白定蛋白质等等电点的方法点的方法实验目的实验目的2实验二.蛋白质的两性反应与等电点测定PCOOHNH2PCOO-NH3+PCOO-NH2PCOOHNH3+pH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pHpI兼性离子兼性离子 阳离子阳离子阴离子阴离子实验原理实验原理3实验二.蛋白质的两性反应与等电点测定u 在在等等电点点时蛋蛋白白质颗粒粒上上的的净电荷荷为零零，缺缺乏乏同同电相相斥斥的的因因素素，蛋蛋白白质溶解度最小，最容易析出沉淀溶解度最小，最容易析出沉淀u 维持蛋白持蛋白质胶体胶体稳定的因素：定的因素：表面表面电荷、水化膜荷、水化膜4实验二.蛋白质的两性反应与等电点测定u 本本实验配配制制了了各各种种不不同同pH值的的缓冲冲液液，沉沉淀淀出出现最最多多的的缓冲冲液液pH值即即为酪蛋白的等酪蛋白的等电点点5实验二.蛋白质的两性反应与等电点测定实验器材与试剂实验器材与试剂 大试管、滴管、刻度吸量管大试管、滴管、刻度吸量管 0.5酪蛋白醋酸钠溶液酪蛋白醋酸钠溶液 0.01溴甲酚绿指示剂溴甲酚绿指示剂(指示范围指示范围: pH3.8-5.4) 0.02M HCL溶液溶液、 0.02M NaOH溶液溶液 0.01M醋酸溶液、醋酸溶液、0.10M醋酸溶液、醋酸溶液、 1.00M醋酸溶液醋酸溶液6实验二.蛋白质的两性反应与等电点测定 蛋白蛋白质的两性反的两性反应（1）实验步骤实验步骤取一干净试管取一干净试管酪蛋白液酪蛋白液10滴滴溴甲酚绿指示剂溴甲酚绿指示剂3滴滴观察溶液颜色观察溶液颜色并解释现象并解释现象7实验二.蛋白质的两性反应与等电点测定 蛋白蛋白质的两性反的两性反应（2）滴加滴加0.02M HCL溶液溶液边滴加边混匀边滴加边混匀有最大沉淀产生，观察溶液颜色变化有最大沉淀产生，观察溶液颜色变化至沉淀消失，观察溶液颜色并解释现象至沉淀消失，观察溶液颜色并解释现象继续滴加继续滴加0.02M HCL溶液溶液边滴加边混匀边滴加边混匀8实验二.蛋白质的两性反应与等电点测定 蛋白蛋白质的两性反的两性反应（3）继续滴加继续滴加0.02M NaOH溶液溶液边滴加边混匀边滴加边混匀有最大沉淀产生，观察溶液颜色变化有最大沉淀产生，观察溶液颜色变化至沉淀消失，观察溶液颜色并解释现象至沉淀消失，观察溶液颜色并解释现象继续滴加继续滴加0.02M NaOH溶液溶液边滴加边混匀边滴加边混匀9实验二.蛋白质的两性反应与等电点测定 溶液呈溶液呈蓝色色n 蛋白蛋白质的两性反的两性反应(1)实验结果实验结果 酪蛋白溶液呈碱性酪蛋白溶液呈碱性 (pH5.4)，使溴甲酚，使溴甲酚绿指示指示剂显蓝色色10实验二.蛋白质的两性反应与等电点测定 H+ ，沉淀，沉淀 n 蛋白蛋白质的两性反的两性反应(2) 出出现最大量沉淀最大量沉淀时,说明到达了酪蛋白的等明到达了酪蛋白的等电点点 溶液由溶液由蓝色色变成成浅浅绿色色（3.8pH5.4）11实验二.蛋白质的两性反应与等电点测定 继续加酸，加酸，H+继续增增大，大，pHpI。酪蛋白所。酪蛋白所带正正电荷不断增加，同荷不断增加，同电相相斥，沉淀溶解斥，沉淀溶解 沉淀完全溶解沉淀完全溶解时，溶，溶液液显黄色黄色(pH3.8)12实验二.蛋白质的两性反应与等电点测定 OH- ，沉淀，沉淀 n 蛋白蛋白质的两性反的两性反应(3) 出出现最大量沉淀最大量沉淀时,说明到达了酪蛋白的等明到达了酪蛋白的等电点点 溶液由溶液由黄色黄色变成成浅浅绿色色（3.8pH5.4）13实验二.蛋白质的两性反应与等电点测定 继续加碱，加碱，OH-继续增增大，大，pHpI。酪蛋白所。酪蛋白所带负电荷不断增加，同荷不断增加，同电相相斥，沉淀溶解斥，沉淀溶解 沉淀完全溶解沉淀完全溶解时，溶，溶液液显蓝色色(pH5.4)14实验二.蛋白质的两性反应与等电点测定结论结论 1 1：n 酪蛋白的等电点在酪蛋白的等电点在pH3.8-5.4pH3.8-5.4之间之间n pH= pI pH= pI时，蛋白质溶解度最小时，蛋白质溶解度最小n 蛋白质是两性电解质蛋白质是两性电解质15实验二.蛋白质的两性反应与等电点测定 取取7支支同同样规格格的干燥的干燥试管，精确加入各管，精确加入各试剂试管号码试管号码1234567蒸馏水蒸馏水2.43.23.01.52.75 3.381.00M醋酸醋酸1.60.80.1M醋酸醋酸4.01.00.01M醋酸醋酸2.51.25 0.62pH3.53.84.14.75.35.65.9 酪蛋白等酪蛋白等电点的点的测定定注：单位均为注：单位均为mL16实验二.蛋白质的两性反应与等电点测定 向向每每个个试管管中中各各加加0.5%酪酪蛋蛋白白溶溶液液20滴滴， 加一管，立即混匀一管加一管，立即混匀一管 静置静置30分分钟后，以后，以0、+、+、+、+表示各管的混表示各管的混浊度，并指出哪一种度，并指出哪一种pH是酪蛋白的等是酪蛋白的等电点点17实验二.蛋白质的两性反应与等电点测定1 12 23 34 45 56 67 7沉淀量沉淀量0 0+ +0 00 0n 酪蛋白等酪蛋白等电点的点的测定定1234567实验结果实验结果18实验二.蛋白质的两性反应与等电点测定结论结论 2 2：n 4 4号号试管沉淀量最多试管沉淀量最多n 说明说明4 4号管溶液的号管溶液的pHpH值为酪蛋值为酪蛋白的等电点，即白的等电点，即pI=4.7pI=4.7u 什么是蛋白质的等电点？u 在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀？思考题思考题20实验二.蛋白质的两性反应与等电点测定 实验项目目 实验原理原理 试剂和器材和器材 操作方法（主要步操作方法（主要步骤） 结果分析果分析 思考思考题 实验三实验三 凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高铁氰化钾铁氰化钾预预 习习22实验二.蛋白质的两性反应与等电点测定