贾懂秒罪坏铂缀绅包忌枉丝擞夫俭棕重蛤仍街汹挎村筏癸偶海寄羽蔓乾破第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第四章第四章 微生物药物的生物合成微生物药物的生物合成微生物新药的发现微生物新药的发现 杆镀查雇社痊霹跟蒋认姐菌猴族衬轴猖倪顷治权尚看漾裳壬魔惭炒捣纤亢第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药根据微生物药物的生物合成原理根据微生物药物的生物合成原理发现微生物新药的方法和途径发现微生物新药的方法和途径n通过非基因定向改变、基因定向改变，以通过非基因定向改变、基因定向改变，以及组合生物催化的技术，或是改变原有微及组合生物催化的技术，或是改变原有微生物药物的生物合成途径，或是对原有的生物药物的生物合成途径，或是对原有的微生物药物（或先导化合物和中间体）进微生物药物（或先导化合物和中间体）进行生物催化，以发现微生物新药行生物催化，以发现微生物新药 . .落凄胆脏摩龄柬些琶套瞒殷酉抬拴诞佃蕴洪持蹲焊筷争阂幼焕仔亦陷攫稚第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药产生菌产生菌前体物质前体物质(1) (1) 诱变处理诱变处理化学化学修饰修饰天然产物天然产物衍生物衍生物天然产物天然产物天然中间物天然中间物天然产物天然产物衍生物衍生物 化学修饰化学修饰 生物转化与生物转化与 组合生物转化组合生物转化 阻阻断断或或非非阻阻断菌株断菌株定向与杂交定向与杂交生物合成生物合成微生物或微生物或酶转化酶转化天然产物天然产物类似物类似物 杂合杂合 工程菌工程菌突变生物突变生物合成合成组合生物合成组合生物合成(2) (2) 基因操作基因操作天然产物天然产物类似物类似物(1)(2)天然产物天然产物类似物类似物约怯永嘘化吏寿锚脐媳冈译闻秦兹肪阮僵放兵霜画垣液封藏彪该岭涡头叙第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药微生物药物生物合成微生物药物生物合成与微生物新药发现的基本途径与微生物新药发现的基本途径 n通过非基因定向改变的方法包括：定向生通过非基因定向改变的方法包括：定向生物合成、杂交生物合成、突变生物合成，物合成、杂交生物合成、突变生物合成，以及生物转化与组合生物转化；以及生物转化与组合生物转化；n基因定向改变，即为组合生物合成。基因定向改变，即为组合生物合成。 知伙呵员万锚哄肄木阑沮喉赛势纫诽际讽校瓣硝巡棘淬垣灼岩美淹辜窝拼第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药贾懂秒罪坏铂缀绅包忌枉丝擞夫俭棕重蛤仍街汹挎村筏癸偶海寄羽蔓乾破第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第一节第一节生物合成途径的非基因定向改变生物合成途径的非基因定向改变与微生物新药的发现与微生物新药的发现歧庚输刮硕瓶盆址绚骡边锚淄烂浩笔脚平序侄唬携描腊熄叹敖遏韩庄或富第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药一、非遗传操作的定向生物合成一、非遗传操作的定向生物合成与微生物新药的发现与微生物新药的发现n已有的研究表明，在抗生素等次级代谢产物生已有的研究表明，在抗生素等次级代谢产物生物合成中酶底物的特异性足以使结构相关的物合成中酶底物的特异性足以使结构相关的代谢产物在其发酵液中积累；代谢产物在其发酵液中积累；n但由于生物合成酶的底物专一性较低（宽泛性）但由于生物合成酶的底物专一性较低（宽泛性），其野生型菌株或阻断突变株的发酵过程中添，其野生型菌株或阻断突变株的发酵过程中添加一些已知结构类似物作为前体物质，可以产加一些已知结构类似物作为前体物质，可以产生含有与这种已知结构类似的新衍生物；生含有与这种已知结构类似的新衍生物；n这种获得新次级代谢产物的途径，可以被称之这种获得新次级代谢产物的途径，可以被称之为非遗传操作的定向生物合成为非遗传操作的定向生物合成 (directed (directed biosynthesis)biosynthesis)。 盛项痞盐价锰唯梦寅孟砰申诛卓袖焙捷募蓟厄恍创雹氰租领宝术竣忆澄素第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药前体（前体（precursorprecursor）n即在微生物培养过程中，外源添加的某一即在微生物培养过程中，外源添加的某一化学物质，通过微生物的代谢，能够将其化学物质，通过微生物的代谢，能够将其整体地或部分地整合到某一特定的次级代整体地或部分地整合到某一特定的次级代谢产物的分子中去的化合物，如苯乙酸或谢产物的分子中去的化合物，如苯乙酸或苯乙酰胺及苯氧乙酸等）。苯乙酰胺及苯氧乙酸等）。榷惮瞥蹲馅福扇矽旱睛坏够众越朗想幸褥铀戈起叭演狐瑚买篡寄嘴儿或堵第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药非遗传操作的定向生物合成非遗传操作的定向生物合成n这种在发酵过程中通过添加某种特定的前体物质，这种在发酵过程中通过添加某种特定的前体物质，使微生物的生物合成朝着将这些前体物质掺入到使微生物的生物合成朝着将这些前体物质掺入到产物分子的某一特定部位而产生过量的含有这种产物分子的某一特定部位而产生过量的含有这种前体的产物的方法，即为非遗传操作的定向生物前体的产物的方法，即为非遗传操作的定向生物合成。合成。n其基本原理是由于参与这些反应的生物合成酶的其基本原理是由于参与这些反应的生物合成酶的底物专一性较差，而能使外源添加的某些前体物底物专一性较差，而能使外源添加的某些前体物质竞争性地掺入到特定产物的分子中去。质竞争性地掺入到特定产物的分子中去。 讶脯喧表白檬疙晾绝毕昨食付肖桓免溯侨镰毒逸言凋侗李敲燕况微迂怠蔫第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药定向生物合成与微生物新药的发现定向生物合成与微生物新药的发现n次级代谢产物合成酶的特点：次级代谢产物合成酶的特点：是一个由一系列酶参与催化的多酶体系。是一个由一系列酶参与催化的多酶体系。参与催化反应的酶的底物专一性比初级代参与催化反应的酶的底物专一性比初级代谢合成酶要差。谢合成酶要差。帆织忿利卜竣牙榷补浅隋坤惯变屿丈杏置虾汁疏洪原谗苗长虎人锁找肉彻第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药应用实例应用实例n应用非遗传操作定向生物合成的方法能够应用非遗传操作定向生物合成的方法能够制备获得许多新的抗生素，其中目前已进制备获得许多新的抗生素，其中目前已进行工业化生产的有：行工业化生产的有：n青霉素青霉素G G和和V V；n培罗霉素；培罗霉素；n四环素和金霉素等。四环素和金霉素等。 畴巫涪远武攘铂猜曹赏尸尧亨嗜怪厄旦铝醋制粤谦菠衍沼男郡雏枣荚轿壮第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药青霉素定向生物合成青霉素定向生物合成.序号序号侧侧 链链 R R学学 名名俗俗 名名1 1对羟基苄青霉素对羟基苄青霉素青霉素青霉素X X2 2苄青霉素苄青霉素青霉素青霉素G G3 3戊烯戊烯22青霉素青霉素青霉素青霉素F F4 4戊青霉素戊青霉素青霉素二氢青霉素二氢F F5 5庚青霉素庚青霉素青霉素青霉素K K6 6丙烯巯甲基青霉素丙烯巯甲基青霉素青霉素青霉素O O7 7苯氧甲基青霉素苯氧甲基青霉素青霉素青霉素V V8 84 4氨基氨基4 4羧基羧基丁基青霉素丁基青霉素青霉素青霉素N N青霉素和青霉素和6APA分子结构及各种天然青霉素的结构与名称分子结构及各种天然青霉素的结构与名称青霉素分子的化学结构青霉素分子的化学结构6APA的化学结构的化学结构各种天然青霉素具有的侧链和名称各种天然青霉素具有的侧链和名称见附靖领凰坯棉旦全府条惦昭笋绞狞塔满甄品蓟惋绵证酗韵蛮徘亚攫亲埋第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药培罗霉素定向生物合成培罗霉素定向生物合成.根蚁扁碘奈演滇羡币纳伴只诈扦锯陋珐踌典缨抢杏扩瞒具堵扩鞘肿迄椽柬第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药培罗霉素定向生物合成培罗霉素定向生物合成可结合进入可结合进入BLMBLM的末端胺基部分的非天然胺基化合物的末端胺基部分的非天然胺基化合物.* PEP的末端胺基的末端胺基版娄三美伤厌丈玉绒输奴霜密颜儿治啊倪汕寂佛铁滚迷题妓邻祸泵泣而垛第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药四环类抗生素的定向生物合成四环类抗生素的定向生物合成R5R6R76去甲基四环素HHH(1)7氯6去甲基四环素HHCl(2)四环素HCH3H(3)5羟基四环素（土霉素）OHCH3H(4)7氯四环素（金霉素）HCH3Cl(5)微生物发酵产生的一些四环素类抗生素微生物发酵产生的一些四环素类抗生素寐所缘勾胶裴挎邑祷彝认逼腾裙伊垢耍卖乖晌芦窗操木柠羊斥猖己菇塞峻第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药四环类抗生素的定向生物合成四环类抗生素的定向生物合成 在生产在生产金霉素金霉素时需添加氯化物作为前体，时需添加氯化物作为前体，而当生产而当生产四环素四环素时，则必须要在发酵培养时，则必须要在发酵培养基中添加氯离子抑制剂，如溴化物或基中添加氯离子抑制剂，如溴化物或M-M-促促进剂等，从而抑制金霉素的合成而得到四进剂等，从而抑制金霉素的合成而得到四环素产物。环素产物。 另外，用金色链霉菌在发酵的金霉素过程另外，用金色链霉菌在发酵的金霉素过程中添加适量的甲基化反应抑制剂如磺胺嘧中添加适量的甲基化反应抑制剂如磺胺嘧啶钠，能够获得啶钠，能够获得去甲基金霉素。去甲基金霉素。 奔懊畸矩拭靶眶将辰熙拿洱炙曲嚼酉维搓钳痹歉搞苏热斋附柑绵矗李厩壕第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药杜拉克丁的定向生物合成杜拉克丁的定向生物合成醚凸握涅淮还邓慌寻按抵唤墒手统凡遵副新膳裙薄兜胚停壮喀拂顾衫愈辅第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药杜拉克丁的定向生物合成杜拉克丁的定向生物合成组分R1R2XY备注A1aA1bA2aA2bB1aB2bB2aB2bOCH3OCH3OCH3OCH3OHOHOHOHCH=CHCH=CHCH2CH（OH）CH2CH（OH）CH=CHCH=CHCH2CH（OH）CH2CH（OH）25-环己烷基环己烷基-B225-环己烷基环己烷基-B1OHOHCH2CH（OH）CH=CH外源添加环外源添加环己烷羧酸钠己烷羧酸钠鲍环宫俏嫩闰呕登誉雁耕哮探彰叹棉柄芝战邻滦碎量岿级瘤葱姚铰镍洞纬第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药非基因改变定向生物合成的研究进展非基因改变定向生物合成的研究进展 尽管近年来基因改变的定向生物合成尽管近年来基因改变的定向生物合成发展很快，但利用非遗传操作定向生物合发展很快，但利用非遗传操作定向生物合成原理寻找新的生理活性物质的研究还在成原理寻找新的生理活性物质的研究还在不少实验室继续进行，特别是对一些肽类不少实验室继续进行，特别是对一些肽类如如环孢菌素环孢菌素A A、aureobasidinsaureobasidins及糖肽类如及糖肽类如替考拉宁产生菌替考拉宁产生菌的定向生物合成研究取得的定向生物合成研究取得了很大的进展。了很大的进展。碟胸缉仑频衡虎闷浴蚕幼旁出特舷练臀晌碾纱勿锦罕暇椰鞍岛颊篮钠矿笑第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药二、添加外源酶抑制剂的杂交生物合成二、添加外源酶抑制剂的杂交生物合成与微生物新药的发现与微生物新药的发现n 杂交生物全成（杂交生物全成（hybrid biosynthesishybrid biosynthesis）似乎可以）似乎可以理解为是理解为是一种一种“强化强化”的非遗传定向生物合成的非遗传定向生物合成，如，如在苦霉素产生菌生酵过程中添加聚乙酰途径中在苦霉素产生菌生酵过程中添加聚乙酰途径中-酮酮酯酰基合成酶抑制剂酯酰基合成酶抑制剂线兰菌素线兰菌素(cerulenin)(cerulenin)，使其，使其失去合成链霉素大环内酯苷元失去合成链霉素大环内酯苷元(picronolide)(picronolide)的能力的能力而只能合成糖基。同时在发酵过程中添加泰乐菌素而只能合成糖基。同时在发酵过程中添加泰乐菌素大环内酯苷元大环内酯苷元(protylonolide)(protylonolide)，使其与苦霉素生产，使其与苦霉素生产菌产生的糖基结合，得到一种被称之为菌产生的糖基结合，得到一种被称之为M4365G1M4365G1的杂的杂合抗生素合抗生素(hybrid antibiotic)(hybrid antibiotic)。 息针傀迎狂亭管货雌踢煤惩定捕欢阳被捶哈镇刽霞呕缄棕稽动茄酝冉者爷第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药杂交生物合成与微生物新药的发现杂交生物合成与微生物新药的发现葡萄糖1CH3COOH6CH3CH2COOH2CH3COOH5CH3CH2COHCH3CH2CH2COOHS.fradia KA427 NO.261ProtylonolidePicronolideDesosaminePicromycin DDesosaminyl Protylonolide（M4365G1） 在浅蓝菌素存在下，用苦味霉素产生菌（在浅蓝菌素存在下，用苦味霉素产生菌（S.sp.AM4900） 与与protylonolide 杂交生物合成杂交生物合成M4365G梆苞摩尸吗临秒阵位罐振腕藤艰聚照陛会幻瑚织慕厅杯喷戚莱赴喘棍亡勿第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药杂交生物合成产物工业化的可能性杂交生物合成产物工业化的可能性 尽管通过杂交生物合成能够得到尽管通过杂交生物合成能够得到一些新的抗生素，但由于所添加的一些新的抗生素，但由于所添加的浅浅蓝菌素蓝菌素本身就是一种昂贵的抗生素，本身就是一种昂贵的抗生素，再则所添加的再则所添加的苷元的结构苷元的结构受到限制，受到限制，所以这种方法似乎没有很大的实际意所以这种方法似乎没有很大的实际意义。义。 泽起母扰翱屉救跺撇港布碉莲飘道筏哭鲤啦然蛋嫂萌锈盅秸谁乌玩狼颂横第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药三、非定向诱变的突变生物合成三、非定向诱变的突变生物合成与微生物新药的发现与微生物新药的发现n突变生物合成（突变生物合成（mutational biosynthesismutational biosynthesis）：）：n突变生物合成是指野生型产生菌经化学或物理等突变生物合成是指野生型产生菌经化学或物理等因素诱变处理后，丧失合成原来次级代谢产物的因素诱变处理后，丧失合成原来次级代谢产物的能力而成为阻断突变株，然后在发酵培养阻断突能力而成为阻断突变株，然后在发酵培养阻断突变株时添加某种外源物质，参与生物合成以获得变株时添加某种外源物质，参与生物合成以获得新的次级代谢产物的过程。新的次级代谢产物的过程。n另外，突变生物合成也包括由于突变而引起产生另外，突变生物合成也包括由于突变而引起产生新的次级代谢产物。新的次级代谢产物。颠库熬寂蛆闽师舰简囤棕竞与催铣青赠疹矮诉符足沈锗科错惠艘棘卸忿饶第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药突变生物合成原理突变生物合成原理阻断突变株的类型阻断突变株的类型营养缺陷型突变株：营养缺陷型突变株： 由于编码菌体生长之必须的酶的基因发生了突由于编码菌体生长之必须的酶的基因发生了突变，而使菌体不能生长，导致不能合成次级代变，而使菌体不能生长，导致不能合成次级代谢产物。因此，这类突变株也可以称为初级代谢产物。因此，这类突变株也可以称为初级代谢阻断突变株。谢阻断突变株。独需型突变株：独需型突变株： 这种突变株的生长和初级代谢正常，但由于编这种突变株的生长和初级代谢正常，但由于编码次级代谢产物合成的某一基因发生突变，而码次级代谢产物合成的某一基因发生突变，而使丧失了合成次级代谢产物的能力。这是突变使丧失了合成次级代谢产物的能力。这是突变生物合成所需要的突变株。生物合成所需要的突变株。双重阻断突变株：双重阻断突变株： 即突变既发生在编码初级代谢酶的基因上，也即突变既发生在编码初级代谢酶的基因上，也发生在编码次级代谢酶的基因上。发生在编码次级代谢酶的基因上。届揍囱妆沸溃少桑阉号酬亢呵孽妓乱沮里叶企亏申皋鱼藐跨慷徽厘裸癌渔第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药突变生物合成与微生物新药发现突变生物合成与微生物新药发现.野生型产生菌野生型产生菌独需型突变株独需型突变株AB正常途径正常途径某抗生素某抗生素阻断变株阻断变株A阻断变株阻断变株BAB+BA+ABABA，B为某一抗生素分子结构的两个部分为某一抗生素分子结构的两个部分AB为发酵液培养时阻断变株的代谢产物为发酵液培养时阻断变株的代谢产物BA为发酵培养时添加的为发酵培养时添加的AB的结构类似物的结构类似物ABAB即为新的杂合抗生素即为新的杂合抗生素利用独需型突变株合成产生新抗生素的基本原理利用独需型突变株合成产生新抗生素的基本原理滨耍冯钝优装顿辟撵酪蹭惮金喇务咏濒涂最你乳隐躬理蓑烦肆丝握塘荆窑第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药突变生物合成的突变生物合成的基本流程基本流程.出发菌株的选择出发菌株的选择诱变处理诱变处理阻断突变株筛选阻断突变株筛选琼脂块法选择琼脂块法选择有生理活力的突变株有生理活力的突变株无生理活力的突变株无生理活力的突变株摇瓶复筛摇瓶复筛有生理活力的突变株有生理活力的突变株无生理活力的突变株无生理活力的突变株区段合成产物，连接区段合成产物，连接酶等生化特性的研究酶等生化特性的研究有有区区段段合合成成产产物物、无无连连接接酶酶等等活活性性的的突突变变株株有有区区段段产产物物A有有连连接接酶等活性的突变株酶等活性的突变株有有区区段段产产物物B有有连连接接酶等活性的突变株酶等活性的突变株发酵培养发酵培养添加结构类似物添加结构类似物A或或B样品收集样品收集TLC、HPLC检测及制备检测及制备结构检测结构检测泥倒忆容会曰耶佣临卖梳柔盖侨栋截灶谜之整涸浴疗沦释蚤泣匡菜彼党铆第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药突变生物合成产生的新抗生素突变生物合成产生的新抗生素.菌种菌种抗生素抗生素特殊营养特殊营养增补物增补物新抗生素新抗生素伊尼奥小单孢菌伊尼奥小单孢菌西梭霉素西梭霉素DOS链霉胺等链霉胺等突变霉素突变霉素1等等绛红小单孢菌绛红小单孢菌庆大霉素庆大霉素DOS链霉胺等链霉胺等2羟基羟基GM等等红霉素链霉菌红霉素链霉菌红霉素红霉素Erythronolide8，8 deoxyoleanolie未鉴别未鉴别弗氏链霉菌弗氏链霉菌新霉素新霉素DOS链霉胍等链霉胍等杂交霉素杂交霉素A，B加利利链霉菌加利利链霉菌阿克拉霉素阿克拉霉素阿克拉酮阿克拉酮紫红霉酮等紫红霉酮等11羟基阿克拉霉素羟基阿克拉霉素A灰色链霉菌灰色链霉菌链霉素链霉素紫红霉酮等紫红霉酮等2脱氧链霉胍脱氧链霉胍streptomutin A卡那霉素链霉菌卡那霉素链霉菌卡那霉素卡那霉素DOS1N甲基甲基DOS等等1N甲基甲基GM等等雪白链霉菌雪白链霉菌新生霉素新生霉素氨基香豆氨基香豆氨基香豆素同系物氨基香豆素同系物未鉴明未鉴明核糖苷链霉菌核糖苷链霉菌核糖霉素核糖霉素DOS1N甲基甲基DOS等等1N甲基甲基RSMC等等普拉特链霉菌普拉特链霉菌普拉特霉素普拉特霉素PlatenolideNarbonolide5Omycaminosyl narbonolide龟裂链霉菌龟裂链霉菌巴龙霉素巴龙霉素DOS链霉胍链霉胍杂交霉素杂交霉素C巴龙链霉菌巴龙链霉菌尼可霉素尼可霉素尿嘧啶尿嘧啶嘧啶嘧啶尼可霉素尼可霉素Z等等唐德链霉菌唐德链霉菌究兢示杭氏涩腺喉拯吴褐冰凛眯诚笑查色鄙章纲揣焦蔡阜谋陵译簧洽谚钒第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药红霉素生物红霉素生物合成途径合成途径.丙酮丙酮CoA丙酰丙酰SACP甲基丙二酰甲基丙二酰甲基丙二酰甲基丙二酰SACP丙酰丙酰丙酰丙酰SACP聚酮体途径聚酮体途径6脱氧红霉内脂脱氧红霉内脂B红霉内脂红霉内脂BTDPL碳霉糖碳霉糖 葡萄糖葡萄糖TDPD葡萄糖葡萄糖3O碳霉糖基红霉内脂碳霉糖基红霉内脂TDP脱氧氨基己糖脱氧氨基己糖 红霉素红霉素D红霉素红霉素C红霉素红霉素A红霉素红霉素E红霉素红霉素B缩合酶缩合酶酥雹之涎逼棉聋遣牵或踪然玉胸痒攀历块袱魔窿单嫉娇亚漓吕伐骤椽汲爽第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药突变株产生的突变株产生的新蒽环类抗生素新蒽环类抗生素.RR1R2道若霉素（原株产生）道若霉素（原株产生）OCHOCH3 3COCHCOCH3 3OHOH亚德里亚霉素（变株产生）亚德里亚霉素（变株产生）OCHOCH3 3COCHCOCH2 2OHOHOHOH1313双氢道若霉素（变株产生）双氢道若霉素（变株产生）OCHOCH3 3CHOHCHCHOHCH3 3OHOH1313双氢洋红霉素双氢洋红霉素OHOHCOCHCOCH3 3OHOH1111去氧道若霉素（变株产生）去氧道若霉素（变株产生）OCHOCH3 3COCHCOCH2 2OHOHH H1111去氧亚德里亚霉素（变株产生）去氧亚德里亚霉素（变株产生）OCHOCH3 3CHCH2 2CHCH3 3H HBaumycinA*BaumycinA*（原株产生）（原株产生）OCHOCH3 3CHCH2 2COCHCOCH3 3OHOHFeudomycin AFeudomycin A（变株产生）（变株产生）OCHOCH3 3CHCH2 2CHCH3 3OHOHFeudomycin BFeudomycin BOCHOCH3 3CHCH2 2COCHCOCH3 3OHOH窑何穷终亩例闹纵男稳缅拽峡惺杖喂饥泛竹廷硫环猿拍仙琼凉犬脖坦紫瑟第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药突变株产生的一些新的次级代谢产物突变株产生的一些新的次级代谢产物.原菌种原菌种原抗生素原抗生素突变株产生的新抗生素突变株产生的新抗生素普拉特链霉菌普拉特链霉菌普拉特霉素普拉特霉素demycarosyldemycarosyl普拉特霉素普拉特霉素9 9dehydromycarosyledehydromycarosyle普拉特霉素普拉特霉素波赛链霉菌波赛链霉菌紫产色链霉菌紫产色链霉菌柔红霉素柔红霉素烬灰红菌素烬灰红菌素阿霉素阿霉素烬灰红菌素烬灰红菌素X X波赛链霉菌波赛链霉菌baumycinbaumycinoxaunomycinoxaunomycin棘孢小单孢菌棘孢小单孢菌庆大霉素庆大霉素小诺霉素小诺霉素生金链霉菌生金链霉菌四环素四环素去甲基四环素去甲基四环素生金链霉菌生金链霉菌金霉素金霉素去甲基金霉素去甲基金霉素龟裂链霉菌龟裂链霉菌土霉素土霉素去甲基土霉素去甲基土霉素吸水链霉菌吸水链霉菌carriomycincarriomycincarromycinAcarromycinA茂饰夸踢捂踪伶底鲜市样啸郡戈低蚌钩舞魔爪眺扁箕叹杯谜椰河桔陈涅募第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药我国应用突变生物合成原理找到的小诺霉素我国应用突变生物合成原理找到的小诺霉素.2H2SO4庆大霉素和小诺霉素的化学结构庆大霉素和小诺霉素的化学结构抗生素抗生素R1R2分子式分子式硫酸庆大霉素硫酸庆大霉素C1CH3NHCH3C21H43N5O72H2SO4硫酸庆大霉素硫酸庆大霉素C1aHNH2C19H39N5O72H2SO4硫酸庆大霉素硫酸庆大霉素C2CH3NH2C20H41N5O72H2SO4小诺霉素小诺霉素HNHCH3C20H41N5O72H2SO4抬糠酌层沦霄蝇吻锦廷资鲍盏瘤踪崎犁壮翘睫碴垂搅傻燕摆沸几盎奸织添第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药四、原生质体融合与微生物新药的发现四、原生质体融合与微生物新药的发现 微生物原生质体融合，即是指将双新株的微生物微生物原生质体融合，即是指将双新株的微生物细胞分别通过酶解脱壁，使之形成原生质体，然细胞分别通过酶解脱壁，使之形成原生质体，然后在高渗溶液的条件下混合，并加入物理的（如后在高渗溶液的条件下混合，并加入物理的（如电融合）或化学的电融合）或化学的( (如聚乙二醇如聚乙二醇) )或生物的（如仙或生物的（如仙台病毒）助融条件，使双亲株的原生质发生相互台病毒）助融条件，使双亲株的原生质发生相互凝集，通过细胞质融合，核融合，尔后发生基因凝集，通过细胞质融合，核融合，尔后发生基因组间的交换，重组，进而可以在适宜的条件下再组间的交换，重组，进而可以在适宜的条件下再生出微生物细胞壁，获得重组子的过程。生出微生物细胞壁，获得重组子的过程。照刮繁厄讫焉督脊戚残牛面楼匆裤输阳峪廖衍衰障传貉唱圾批荐残隘槽民第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药四、原生质体融合与微生物新药的发现四、原生质体融合与微生物新药的发现n利用微生物厚生质融合寻找新抗生素的基利用微生物厚生质融合寻找新抗生素的基本原理是来源于两种已知产生不同抗生素本原理是来源于两种已知产生不同抗生素的产生菌的融合子，有可能将它们的部分的产生菌的融合子，有可能将它们的部分生物合成基因整合在一起而产生新的杂合生物合成基因整合在一起而产生新的杂合抗生素；另一个原理是由于抗生素产生菌抗生素；另一个原理是由于抗生素产生菌中存在着沈默基因，当这些沉默基因受到中存在着沈默基因，当这些沉默基因受到外源物质刺激后，有可能被激活而产生，外源物质刺激后，有可能被激活而产生，结构与亲株完全不同的新的抗生素。结构与亲株完全不同的新的抗生素。 极群滥效腥形场陕馅粱厘夫讫银箩铅屁二谬翠欢但碉学亦臼凡仑枣躺聂全第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药四、原生质体融合与微生物新药的发现四、原生质体融合与微生物新药的发现 应用这种方法获得的第一个新抗生素是吲应用这种方法获得的第一个新抗生素是吲哚佐霉素（哚佐霉素（indloizomycinindloizomycin）：）： 其亲株为链霉素产生菌灰色霉菌和天神霉其亲株为链霉素产生菌灰色霉菌和天神霉素（素（istamycinistamycin）产生菌天神链霉菌）产生菌天神链霉菌S.tenjimariensisS.tenjimariensis。（目前的报道较少）（目前的报道较少） 谚寓演异你氨迁湾峨搽疆夷茸宠秽菲龋幻皂苟姓瘴泛嘴坐哄蓄镶杂扛譬念第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药贾懂秒罪坏铂缀绅包忌枉丝擞夫俭棕重蛤仍街汹挎村筏癸偶海寄羽蔓乾破第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第二节第二节生物合成途径的基因定向改变生物合成途径的基因定向改变与微生物新药的发现与微生物新药的发现无让辟仕阁拱械本凋圭听范巩糖邹赘淮唱翁插烘角扔持娘布踏玛履歹臃卵第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药组合生物合成组合生物合成Combinatorial biosynthesisCombinatorial biosynthesis 是一种通过对天然产物生物合成途径中的基因进行中断、置换及重组等操作，改变原来抗生素产生菌或其他天然产物产生菌生物合成代谢产物的途径，产生具有新颖结构的“非天然的天然杂合产物（unnatural natural hybrid compounds）”的技术或方法。 保漠抵序篇沾娟县拼簿鳃酋伶肪墩索不附研郴爷暴偏臃匿风城俯邻唐肯獭第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药组合生物合成的潜能组合生物合成的潜能 potentialpotentialn重组、组合、互补、替换重组、组合、互补、替换n R= R=可利用的基因可利用的基因 n= n=基因的等位形基因的等位形式式n化合物数化合物数R Rn nn R=4, n=4 R=4, n=4n Compounds=4 Compounds=44 4=256=256愧胆仆围甸了韵娇淫猩均演抄叶朽悦沥嗽朱耍汁瓤昼符荒剖嘶赏沸灼纫核第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药组合生物合成的原理组合生物合成的原理 生物合成酶基因的结构和组成生物合成酶基因的结构和组成 生物合成酶基因的特异性及底物宽容性生物合成酶基因的特异性及底物宽容性 生物合成酶基因之间的相互作用生物合成酶基因之间的相互作用 生物合成途径的研究基础生物合成途径的研究基础舀膀须茎宏路夹死瞩杖堤税来咎懈朗冶留途迪靶扶衅夺羞洛秋记筐沦瘤埂第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药一、具有聚酮体生物合成途径的一、具有聚酮体生物合成途径的微生物药物产生菌的组合生物合成微生物药物产生菌的组合生物合成 基于商业性的原因，迄今为止，对一些具有基于商业性的原因，迄今为止，对一些具有聚聚酮体生物合成（酮体生物合成（polyketide synthasespolyketide synthases，PKSsPKSs）途径的途径的“天然产物天然产物”，如红霉素、阿维，如红霉素、阿维菌素、泰乐菌素、柔红霉素、阿克拉霉素、西菌素、泰乐菌素、柔红霉素、阿克拉霉素、西罗莫司和利福霉素等；罗莫司和利福霉素等； 荆井搽擒退累婚尽侧僧厢遥窑敏以勃罕烹薄桑诧赚菱篡盟盆憨灌独虎尖铣第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药具具PKSPKS途径的抗生素途径的抗生素药物类别药物类别 化化 合合 物物 大环内酯类抗生素大环内酯类抗生素 红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素四环类抗生素四环类抗生素 四环素、金霉素、土霉素四环素、金霉素、土霉素抗肿瘤抗生素抗肿瘤抗生素 柔红霉素，阿克拉霉素、柔红霉素，阿克拉霉素、enediynes enediynes 抗寄生虫药抗寄生虫药 avermectinavermectin，nemadectin nemadectin 免疫抑制剂免疫抑制剂 FK506, rapamycin FK506, rapamycin 抗真菌药抗真菌药 两性霉素，制霉菌素两性霉素，制霉菌素心血管药物心血管药物 lovastatin,lovastatin,，compactincompactin兽药兽药莫莫能能星星（monensinmonensin），泰泰乐乐菌菌素素 (tylosin)(tylosin)，盐霉素，盐霉素拷将拐芝壁铲替券择榔敖巡镇赦腾堂碴同劲盔梦剔盎秩铜此寄藩掳睹蘸绞第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药1 1、红霉素产生菌的组合生物合成、红霉素产生菌的组合生物合成 通过操作通过操作PKSPKS的模块中的模块中单个基因单个基因的组合生物的组合生物合成；合成； 在在非天然产物产生菌非天然产物产生菌中过量表达组合生物中过量表达组合生物合成产物；合成产物； 通过操作通过操作PKSPKS模块之间连接模块之间连接的组合生物合成的组合生物合成 ； 通过操作通过操作脱氧糖途径基因脱氧糖途径基因的组合生物合成。的组合生物合成。逾峪拔絮峦匝遣哆哟重墓册擒食眩壮逗尉坤栏匠钻逻幕淄缅兼哲刹脚掩彩第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药红霉素产生菌的组合生物合成的可能性红霉素产生菌的组合生物合成的可能性n参与红霉素生物合成的参与红霉素生物合成的PKSsPKSs，或，或6 6脱氧红霉内酯脱氧红霉内酯合成酶（合成酶（6-deoxyerythronolide B synthase6-deoxyerythronolide B synthase，DEBSDEBS）有）有6 6个模块组成，每个模块负责合成聚酮体个模块组成，每个模块负责合成聚酮体中的一部分。中的一部分。n由于各模块之间的协调性，以及每个模块编码决由于各模块之间的协调性，以及每个模块编码决定延伸单位的选择、功能和立体化学性质的催化定延伸单位的选择、功能和立体化学性质的催化结构域，因此，就有可能通过对结构域，因此，就有可能通过对PKSsPKSs结构域或模结构域或模块的操作获得具有新颖结构的化合物。块的操作获得具有新颖结构的化合物。n由于具有聚酮体结构的化合物其结构非常复杂和由于具有聚酮体结构的化合物其结构非常复杂和具有众多的立体异构体，因而，难以用常规的化具有众多的立体异构体，因而，难以用常规的化学方法来获得。学方法来获得。 斗通磊莎翻低回址躇迸祭李条汽搭丸百汹喝存姥党厨鲜楔碟恳诡仰拘侧甭第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药红红霉霉素素的的生生物物合合成成途途径径 勉究琉厚香壕环锅疵妨殴尤浆说蹋龄涤芥疾耶观召论九制禾楞拥轩谆顶佃第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药PKSPKS中的每一个模块的组成中的每一个模块的组成n酮基合成酶（酮基合成酶（ketosynthaseketosynthase，KSKS）n酰基转移酶（酰基转移酶（acyl transferaseacyl transferase，ATAT）n酰基载体蛋白（酰基载体蛋白（acyl carrier proteinacyl carrier protein，ACPACPn-酮基修饰酶：包括酮基还原酶酮基修饰酶：包括酮基还原酶（ketoreductaseketoreductase，KRKR）、脱氢酶）、脱氢酶（dehydrogenasedehydrogenase，DHDH）和烯酰还原酶）和烯酰还原酶（enoylreductaseenoylreductase，ERER）nDEBSDEBS含有编码三个独立的多肽亚单位的含有编码三个独立的多肽亚单位的6 6个模块个模块n大多数典型的聚酮体合成途径的产物包括对大多数典型的聚酮体合成途径的产物包括对PKSPKS产产物的修饰，如将脱氧糖或氨基糖进行糖苷化以及物的修饰，如将脱氧糖或氨基糖进行糖苷化以及通过细胞色素通过细胞色素P450P450进行氧化。图中所示的进行氧化。图中所示的LDLD为装为装载域（载域（loading domainsloading domains），），TETE为硫酯酶为硫酯酶（esterasesesterases）。）。 棵锣卫诌屑阻返烷但叮岁疚峻厦壁隋玛箱陋侍赐旦剖哨顿窥蘑授坐缄期却第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药1 1）通过操作）通过操作PKSPKS的模块中单个基因的组合生物合成的模块中单个基因的组合生物合成 一是用利福霉素一是用利福霉素PKSPKS模模块块2 2中的中的DH/ER/KRDH/ER/KR结构结构域取代红霉素域取代红霉素PKSPKS模块模块2 2中的中的KRKR；二是将模块二是将模块5 5中的中的KRKR缺缺失；失；三是用利福霉素模块三是用利福霉素模块2 2中的丙二酰特异性中的丙二酰特异性ATAT取代模块取代模块6 6中的甲基中的甲基丙二酰特异性的丙二酰特异性的ATAT），将得到一个发），将得到一个发生三重突变的生三重突变的PKSPKS产物。产物。 馁浦厦辛骑珠纺妨嵌谓捞庆棺履笼叔爆肿躺避辐俘选靡兢士即捆辫嫉尤灾第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药2）在非天然产物产生菌中过量）在非天然产物产生菌中过量表达组合生物合成产物表达组合生物合成产物 n将将E.coliE.coli 开发成能够表达开发成能够表达PKSPKS产物需要解产物需要解决的问题主要有三个方面：决的问题主要有三个方面：n一是能够功能性表达巨大的蛋白一是能够功能性表达巨大的蛋白（330kDa330kDa）；）；n二是二是PKSPKS亚单位的亚单位的ACPACP结构域的翻译后磷酸结构域的翻译后磷酸泛酰巯基乙胺酰化；泛酰巯基乙胺酰化；n三是聚酮体途径中的前体物质，特别是三是聚酮体途径中的前体物质，特别是（2S2S）甲基丙二酰）甲基丙二酰CoACoA在在E.coliE.coli中不存中不存在。在。 确饺溃唬玲远珊睁景匪瑰杆床滔熙孕吟镁创翻悸娘成咒睬琅腊最斌环检河第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药PfeiferPfeifer等的工作包括：等的工作包括：n运用来源于枯草芽孢杆菌非核糖体多肽合成酶运用来源于枯草芽孢杆菌非核糖体多肽合成酶（NRPSNRPS）基因簇的磷酸泛酰巯基乙胺酰转移酶）基因簇的磷酸泛酰巯基乙胺酰转移酶（phosphopantetheinyl transferasephosphopantetheinyl transferase）基因）基因sfpsfp，以对，以对PKSPKS亚单位的亚单位的ACPACP结构域的翻译后磷酸泛酰结构域的翻译后磷酸泛酰巯基乙胺酰化；巯基乙胺酰化；n过量表达过量表达E.coliE.coli中的丙酰中的丙酰CoACoA合成酶基因合成酶基因prpEprpE，扰乱丙酰扰乱丙酰CoACoA代谢途径，以及过量表达来自代谢途径，以及过量表达来自S.coelicolarS.coelicolar的丙酰的丙酰CoACoA羧化酶基因羧化酶基因pccpcc，使丙，使丙酰酰CoACoA转化为（转化为（2S2S）甲基丙二酰）甲基丙二酰CoA CoA 稳句馅携枝刁改踞羹谅醚斥遮欢喳邢滁侧哺丈裙懒蔼兽内笨觉哺洁伪阶埂第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药罐细监塞病蔚存损舟碳招党皂九描常扒疵记攫爪郝叼敦镑镐淫虫淖较椒眉第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药3 3）通过操作）通过操作PKSPKS模块之间连接的组合生物合成模块之间连接的组合生物合成 n通过对通过对DEBSDEBS模块在模块在E.coliE.coli和体外的表达研究，发和体外的表达研究，发现在现在PKSPKS装配过程中那些短的模块内和多肽内的装配过程中那些短的模块内和多肽内的“连接件连接件”是至关重要的成分。研究发现在相继非是至关重要的成分。研究发现在相继非共价连接的模块中，其氨基和羧基末端存在有多共价连接的模块中，其氨基和羧基末端存在有多肽内连接件，这种连接件与单个多肽内的模块之肽内连接件，这种连接件与单个多肽内的模块之间的连接件不同。间的连接件不同。n因此，使用一种合适的连接件就有可能允许杂合因此，使用一种合适的连接件就有可能允许杂合的模块之间进行功能性连接。的模块之间进行功能性连接。 凿封删旁候简归拨疏吭排定侥彦柴溺躯氯仕轴窟痢纱苗藕阎银窝片靖蚂氯第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药 a a：已经鉴定了不同的：已经鉴定了不同的模块内和多肽内的连接模块内和多肽内的连接件，并由此指导合成模件，并由此指导合成模块之间的聚酮体中间体，块之间的聚酮体中间体，这里需要合适的氨基和这里需要合适的氨基和羧基末端连接配对，以羧基末端连接配对，以产生功能性连接模块；产生功能性连接模块；b b：在构建功能性互补：在构建功能性互补体时，可以使用编码来体时，可以使用编码来源于不同微生物多个模源于不同微生物多个模块的全亚基；块的全亚基；如图所示：来源于苦霉如图所示：来源于苦霉素（素（picromycinpicromycin）的）的PKSPKS（PikAIPikAI和和PikAIIPikAII），），与来源于竹桃霉素与来源于竹桃霉素（oleandomycinoleandomycin）的）的PKSPKS（OleA3OleA3）相结合。）相结合。 皆缓架来厢扼寨连萤胳苞虞给矣充缸罚湿缘留臆伟误乔硕久揉科瘦才象川第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药4 4）通过操作脱氧糖途径基因的组合生物合成）通过操作脱氧糖途径基因的组合生物合成n对已经发现的由自然界中植物、真菌和细菌产生对已经发现的由自然界中植物、真菌和细菌产生的很多具有生理活性的糖苷类化合物的分析发现，的很多具有生理活性的糖苷类化合物的分析发现，连接在苷元上的糖基的结构大多为连接在苷元上的糖基的结构大多为6-6-脱氧己糖脱氧己糖（6-deoxyhexoses, 6DOHs6-deoxyhexoses, 6DOHs）。）。n据统计，这些具有生理活性的糖苷类化合物的结据统计，这些具有生理活性的糖苷类化合物的结构上含有构上含有7070多种不同的多种不同的6-6-脱氧己糖。脱氧己糖。辉舵酉腮磨戴技咒渭航嘻际涩彰刚撞貌槛纶锰峡致屈匝赘膨巷捉瑰抽聘旺第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药6-脱氧己糖的种脱氧己糖的种类具有生理活性的化合物具有生理活性的化合物产生菌生菌*D-Desosamine红霉素霉素竹桃霉素竹桃霉素苦霉素苦霉素巨大霉素巨大霉素Sacc.erythraeaS.antibioticusS.VenezuelaeM.megalomiceaD-Olivose光光辉霉素霉素乌达霉素达霉素Landomycin S.argillaceusS.fradiaeS.cyanogenusD-Oliose光光辉霉素霉素S.argillaceusD-Mycarose光光辉霉素霉素S.argillaceusD-Mycaminose泰泰乐星星S.fradiaeD-Mycinose泰泰乐星星S.fradiaeD-Mycosamine制霉菌素制霉菌素S.nourseiL-Dihydrostreptose链霉素霉素S.griseusL-Oleandrose竹桃霉素竹桃霉素阿弗米丁阿弗米丁S.antibioticusS.avermitillisL-Mycarose红霉素霉素巨大霉素巨大霉素泰泰乐星星Sacc.erythraeaM.megalomiceaS.fradiaeL-Noviose新生霉素新生霉素S.spheroidesL-Rhodinose乌达霉素达霉素LandomycinGranaticin S.fradiaeS.cyanogenusS.violaceoruberL-Daunosamine柔柔红霉素霉素S.peucetiusL-NogaloseNogalamycin S.nogalaterL-Megosamine*巨大霉素巨大霉素M.megalomiceaL-Rhodosamine阿克拉霉素阿克拉霉素S.galilaeusL-EpivancosamineChloroeremomycin A.orientalis2-Deoxy-L-fucose阿克拉霉素阿克拉霉素S.galilaeus阀塞纶蟹罐滁圃匠尺嘛蛰钩羊烂尹赢谷耕豌桐眶据画拄禾笼阿赫讶蒂杆抗第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药矽汰侥屡张娄毁遭友城碰刀遁稻黔吟末勇里鹏抓槽频憾纳蒜钧宛邢走喊须第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药挠挪淘户执牢倚束觉袭帘朴茎坯佯深构矗施柠弟童欧准靴铰具纠帧朽懊腑第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药由放线菌产生的具有不同生理活性由放线菌产生的具有不同生理活性的糖苷化合物的结构特性的糖苷化合物的结构特性n具有具有单糖残基单糖残基的化合物：红霉素的化合物：红霉素A A、柔红霉素、柔红霉素、urdamycin Aurdamycin A和和rebeccamycinrebeccamycin；n具有具有双糖残基双糖残基的化合物：光辉霉素的化合物：光辉霉素（mithramycinmithramycin）；）；n具有具有三糖残基三糖残基的化合物：乌达霉素的化合物：乌达霉素A A（urdamycin urdamycin A A）和光辉霉素（前者同时具有单糖和三糖残基，）和光辉霉素（前者同时具有单糖和三糖残基，后者同时具有双糖和三糖残基）；后者同时具有双糖和三糖残基）；n以以O-O-糖苷键连接糖苷键连接的化合物：红霉素的化合物：红霉素A A、光辉霉素、光辉霉素、柔红霉素和乌达霉素柔红霉素和乌达霉素A A；n以以C-C-糖苷键连接糖苷键连接的化合物：乌达霉素的化合物：乌达霉素A A；n以以N-N-糖苷键连接糖苷键连接的化合物：的化合物：rebeccamycinrebeccamycin。曝贺枯夯匡阻寥赚卜畴幕轮躁策吼株蕾躯啄圆悉仔试釉扳乳喝然滇速琴耙第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药由放线由放线菌产生菌产生的具有的具有不同生不同生理活性理活性的糖苷的糖苷化合物化合物的化学的化学结构结构 拥筐绚颠荐拔鉴用有芍共凝准呀叹缺八伤单听弃旅拉撞暇抬痔烩糖乙葛政第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药a a）通过将竹桃霉素产生菌）通过将竹桃霉素产生菌S.antibioticusS.antibioticus中齐墩果糖基转移酶基因在不同的中齐墩果糖基转移酶基因在不同的S.erythraeaS.erythraea中的表达，得到了中的表达，得到了33O O鼠李糖基红霉素和鼠李糖基红霉素和6 6dEBdEB衍生物，以及衍生物，以及一个一个desosaminylated tylactonedesosaminylated tylactone；b b）改造来源于刺孢霉素（）改造来源于刺孢霉素（calicheamicincalicheamicin）产生菌的基因，可以得到一个新的脱）产生菌的基因，可以得到一个新的脱氧氨基糖，并将其附着在氧氨基糖，并将其附着在S.lividansS.lividans产生的苷元上；产生的苷元上； 馋镰证喊须乃谤堰盖盔鲍垒贰叔匿右恰烩盆批懊昌荚冀由漂异扎秒拯疽施第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药c c）在）在S.lividansS.lividans产生菌中构建产生菌中构建desosaminedesosamine的途径，然后导的途径，然后导入通过遗传操作的入通过遗传操作的DEBSDEBS，可以得到具有新颖结构的，可以得到具有新颖结构的desosaminylateddesosaminylated大环内酯类文库。大环内酯类文库。 誉摇僧堤疑赃采捷寺穴舵赎沉告兄俏厅尘思舒哗皇庸应录弧酥寨建战张杉第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药将竹桃霉素产生菌抗生链将竹桃霉素产生菌抗生链霉菌中编码竹桃霉素霉菌中编码竹桃霉素oleandrose糖基转移酶的基糖基转移酶的基因因oleGII，（该酶负责将相，（该酶负责将相应的糖基转移到应的糖基转移到8，8a-脱脱氧竹桃内酯（氧竹桃内酯（8，8a-deoxyoleandolide）的）的4位羟基上），整合到红霉位羟基上），整合到红霉素产生菌素产生菌eryBV缺失突变株缺失突变株中，中，eryBV基因编码的糖基因编码的糖基转移酶负责将基转移酶负责将L-mycarose糖基转移到糖基转移到6-脱脱氧红霉内酯（氧红霉内酯（6-deoxyerythronolide）甙元）甙元的相同位置的相同位置，并进行表达，并进行表达，结果得到了将天然糖基结果得到了将天然糖基L-rhamnose转移到转移到6-脱氧红脱氧红霉内酯霉内酯4位的新红霉素衍位的新红霉素衍生物，其具有抗菌活性生物，其具有抗菌活性， 活埋皇革线盎汰岂捷钠怯刚耳玩烦箱疤藏尸粤大唤立自选氛秸黎撒死掏韶第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药将将泰乐菌素产生菌弗氏链霉菌中编泰乐菌素产生菌弗氏链霉菌中编码码mycaminose糖基转移到泰乐菌糖基转移到泰乐菌素甙元上的转移酶基因素甙元上的转移酶基因tylM2整合整合到红霉素产生菌三缺失突变株到红霉素产生菌三缺失突变株SGT2，（分别缺失聚酮体合成酶，（分别缺失聚酮体合成酶基因、基因、mycarose和和desosamine糖基糖基转移酶基因，但仍然具有合成转移酶基因，但仍然具有合成L-mycarose和和D-desosamine的能力），的能力），并使之表达，同时在培养过程中外并使之表达，同时在培养过程中外源加入源加入16-元环的泰乐酮元环的泰乐酮（tylactone），结果得到一种新的），结果得到一种新的泰乐星衍生物泰乐星衍生物5-O-desosaminyl-tylactone，如图）所示。说明泰乐，如图）所示。说明泰乐菌素产生菌中的转移酶菌素产生菌中的转移酶TylM2能够能够识别和转移不同的氨基糖。识别和转移不同的氨基糖。这两个例子同时也表明抗生素糖基这两个例子同时也表明抗生素糖基转移酶具有较宽的底物专一性转移酶具有较宽的底物专一性。蛹还昌烦桶讳瑚串织硬状克簿卒林邵光蜡豌鸟玄驯亨免显菊翘沁燥哥叭伟第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药5 5）通过表达杂合基因方法）通过表达杂合基因方法的组合生物合成的组合生物合成 第一个例子是应用有些大环内酯类抗生素第一个例子是应用有些大环内酯类抗生素3 3或或44位的羟基酰化酶基因，使某些大环内酯类抗生素在位的羟基酰化酶基因，使某些大环内酯类抗生素在相应的位置酰化：相应的位置酰化：1 1）异戊酰螺旋霉素）异戊酰螺旋霉素（来自碳霉素的（来自碳霉素的4”4”异戊酰辅酶异戊酰辅酶A A转移酶的转移酶的carEcarE基因基因 ）；）；2 2）丙酰螺旋霉素）丙酰螺旋霉素（来自麦迪霉素的（来自麦迪霉素的4”4”丙酰化酶的丙酰化酶的mptmpt基因）；基因）；3 3）乙酰泰乐菌素）乙酰泰乐菌素等（来自碳霉素的等（来自碳霉素的3 3O O乙酰转移乙酰转移酶的酶的acyAacyA基因）。基因）。 泥谜铭拦嗓尽看纺谢煮法辫磋辊拈哑皋守辐葛但沼池恒深斟迈炙慑洛萄悟第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药引入外源酶基因产生杂合抗生素引入外源酶基因产生杂合抗生素丙酰螺旋霉素基因工程菌构建图丙酰螺旋霉素基因工程菌构建图伏襄瀑敷超桐缎恃糜亨熏湛舜痔猛帝睛浆杏钉搔柿遏滑铲贡酣报彼绷慑蕾第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药必特螺旋霉素的结构必特螺旋霉素的结构R1 H R2 COCH2CH(CH3)2 COCH3 COCH2CH2CH3 COCH2CH3 COCH2CH3 COCH3撰桐对铁看标仑峨燥烙国净惫陈渺旷丧兢洞中够笑备仁桓另津兢嗡蝉铝伦第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药2 2、蒽环类抗生素产生菌、蒽环类抗生素产生菌 的组合生物合成的组合生物合成 蒽环类抗生素是一类临床上非常重要的抗蒽环类抗生素是一类临床上非常重要的抗肿瘤抗生素，它们同样是肿瘤抗生素，它们同样是PKSPKS生物合成途径，生物合成途径，因此，通过以下集中组合生物合成的方法，因此，通过以下集中组合生物合成的方法，可以得到一系列可以得到一系列“非天然的天然杂合化合非天然的天然杂合化合物物”。挟等弓赦阴畸督洪瘦撤咀脐丝恒郸濒卸刽床府孺丈魄犹讣诡憾阜坡枉淫祈第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药1 1）通过破坏靶基因的组合生物合成）通过破坏靶基因的组合生物合成 通过基因框内的诱变或缺失，或插入抗生通过基因框内的诱变或缺失，或插入抗生素耐药基因盒的方法，可以将所选择的靶素耐药基因盒的方法，可以将所选择的靶基因特异性地钝化；基因特异性地钝化； 尽管靶基因的破坏可以得到新的化合物，尽管靶基因的破坏可以得到新的化合物，但会出现错误的结果，这是因为一方面由但会出现错误的结果，这是因为一方面由于极性效应影响下游基因的表达，另一方于极性效应影响下游基因的表达，另一方面受到由于外源面受到由于外源DNADNA片断的插入造成的反义片断的插入造成的反义RNARNA合成影响上游基因。合成影响上游基因。 仪恩裁侍柳哨僧负领酿械茸啊奸粱贿翻漂胡里申坷琴巧锻忙零宗兄驭掺隘第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药1 1）通过破坏靶基因的组合生物合成）通过破坏靶基因的组合生物合成 在光神霉素（在光神霉素（mithramycinmithramycin）产生菌）产生菌S.argillaceusS.argillaceus中，中，破坏编码葡萄糖破坏编码葡萄糖1 1磷酸磷酸胸苷胸苷55三磷酸胸苷转移酶的基因三磷酸胸苷转移酶的基因mtmDmtmD后，获后，获得了两个四环类的光神霉素衍生物：得了两个四环类的光神霉素衍生物：premithramycinonepremithramycinone和和4 4脱甲基脱甲基premithramycinonepremithramycinone衍生物；衍生物； Premithramycinone Premithramycinone的抗肿瘤生物活性与光神霉素的抗肿瘤生物活性与光神霉素相似，且有趣的是其化学结构与来源于黑曲霉相似，且有趣的是其化学结构与来源于黑曲霉A.nigerA.niger的神经肽受体抑制剂的神经肽受体抑制剂BMSBMS非常相似，如图非常相似，如图所示。所示。 墅列匹拔窟福鸦着荔赛械雇跌踞甭翔味塑订要漫书名幸切杀亥旧旺拒死沥第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药通过基因破坏后得到的两个光神霉素通过基因破坏后得到的两个光神霉素衍生物和衍生物和BMS-192548BMS-192548 铀黑橇咕把撵铺装达秤藤娩腋拥潭阔欺鹰坛苑豪惰恼雍撞酿辊交钟吐拢顷第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药2 2）通过表达杂合基因方法）通过表达杂合基因方法的组合生物合成的组合生物合成 来源于来源于S.fradiaeS.fradiae的的urdEurdE基因，编码一种氧基因，编码一种氧化酶，其可能涉及到将化酶，其可能涉及到将1 1分子氧引入到乌达分子氧引入到乌达霉素结构中；霉素结构中； 在控制启动子在控制启动子ermEermE的条件下，将其在丁省的条件下，将其在丁省霉素霉素C C产生菌产生菌S.glaucescensS.glaucescens中表达，产生中表达，产生一种新的杂合化合物，一种新的杂合化合物，6 6羟基丁省霉素羟基丁省霉素C C，如图所示。，如图所示。 称锅区瞒择好伶肪聚挂讨疫回朝轮戏湍尸贱衰特张甥讯缴钻惜惭抛升丫铝第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药通过将乌达霉素产生菌的通过将乌达霉素产生菌的urdEurdE基因在丁省霉素基因在丁省霉素C C产生菌产生菌 中表达，得到一种杂合产物中表达，得到一种杂合产物6 6羟基丁省霉素羟基丁省霉素C C菠搔波灼詹檄晌笨务校躯逻籍清笺非簇截疥逗林再壶鹰趴哈氖为躯枉煤吹第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药2 2）通过表达杂合基因方法）通过表达杂合基因方法 的组合生物合成的组合生物合成 另外一个实例是，将柔红霉素产生菌另外一个实例是，将柔红霉素产生菌S.peucetiusS.peucetius中中编码编码11-aklavinone-11-aklavinone-羟化酶羟化酶的基因（的基因（dnrFdnrF），在阿克拉霉素产生菌），在阿克拉霉素产生菌S.galilaeusS.galilaeus中表达，中表达，结果得到了一种新的结果得到了一种新的杂合化合物，杂合化合物，1111羟基阿克拉霉素羟基阿克拉霉素A A，如图，如图所示。所示。 这种羟基化的产物，其对白血病细胞和黑这种羟基化的产物，其对白血病细胞和黑色素瘤细胞的生物活性比阿克拉霉素要强。色素瘤细胞的生物活性比阿克拉霉素要强。 酌哎妒作嗽恰柴磕涸俘么脏讯懊狈习箩润震营焦见溢变泼束超碗美给鳞仗第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药杂合化合物杂合化合物1111羟基阿克拉霉素羟基阿克拉霉素A A的组合生物合成的组合生物合成 紊拍貉寥失实扎效芳线岂怖枕蕾甥抒拣干高娄愿唬乱右漠彤押遇镜潦答镶第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药2 2）通过表达杂合基因方法）通过表达杂合基因方法 的组合生物合成的组合生物合成 通过这种组合生物合成的方法，已经获得了数通过这种组合生物合成的方法，已经获得了数个杂合糖苷化的丁省霉素，如用含有一个完整个杂合糖苷化的丁省霉素，如用含有一个完整埃罗霉素（埃罗霉素（elloramycinelloramycin）基因簇（具有产生）基因簇（具有产生8 8去甲基丁省霉素去甲基丁省霉素C C的能力）的黏粒转化乌达霉的能力）的黏粒转化乌达霉素产生菌或光神霉素产生菌，可以得到四种新素产生菌或光神霉素产生菌，可以得到四种新的糖苷化合物：齐墩果糖基、鼠李糖基、的糖苷化合物：齐墩果糖基、鼠李糖基、mycarosylmycarosyl丁省霉素丁省霉素C C和双齐墩果糖基丁省霉素和双齐墩果糖基丁省霉素C C，如图所示。，如图所示。 有趣的是，这些脱氧糖在乌达霉素和光神霉有趣的是，这些脱氧糖在乌达霉素和光神霉素苷元上的附着位置，与在埃罗霉素的附着位素苷元上的附着位置，与在埃罗霉素的附着位置不同。表明，这些聚酮体的糖基转移酶具有置不同。表明，这些聚酮体的糖基转移酶具有底物宽泛性。底物宽泛性。 岿应团乙焰慰扦胰镇澄赣应旨昌梗乍伦梢深檄旱缉闹骄尽姆谓抿诧此俭混第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药杂合糖苷化丁省霉素的组合生物合成杂合糖苷化丁省霉素的组合生物合成 厢摇览溪雏浮鸽排昼啥你集宠码屠信匝活丝裕盖鹅惩珊汇谜功哗夸赞隐剧第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药 能够被能够被ElmGTElmGT糖基转移酶转移的一些糖基转移酶转移的一些 糖基和糖基和elloramycinelloramycin甙元的结构甙元的结构 殿炽你溯掩矮畔槽党芒腋雕钩笼栏洞鼻屎盔呜帮梯北鹏屎培穆吁硕媒恒纲第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药表柔红霉素和表阿霉素基因工程菌的构建表柔红霉素和表阿霉素基因工程菌的构建 蚂伯殃钩瘤注判笑收籍臀锑蔫前绿季全范辞濒崩关爵景廊抒咖尹称骚法忘第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药表柔红霉素和表阿霉素基因工程菌的构建表柔红霉素和表阿霉素基因工程菌的构建 通过通过钝化钝化dnmVdnmV基因基因，得到一个柔红霉素和阿霉素产，得到一个柔红霉素和阿霉素产生菌的阻断突变株，生菌的阻断突变株，dnmVdnmV基因编码基因编码4 4酮基还原酶，酮基还原酶，其与合成这类抗生素结构中的脱氧糖，柔毛霉胺的其与合成这类抗生素结构中的脱氧糖，柔毛霉胺的合成有关。合成有关。 分别将阿维菌素产生菌中编码分别将阿维菌素产生菌中编码合成齐墩果糖的基因合成齐墩果糖的基因avrEavrE，以及红霉素产生菌中编码，以及红霉素产生菌中编码合成合成mycarosemycarose的基的基因因eryBIVeryBIV，克隆到，克隆到dnmVdnmV基因阻断突变株中。基因阻断突变株中。 由于重组工程菌中的外源基因表达的由于重组工程菌中的外源基因表达的4-4-酮基还原酶酮基还原酶的特性与柔红霉素产生菌中的的特性与柔红霉素产生菌中的4-4-酮基还原酶不同，酮基还原酶不同，前者具有非对映立体催化特性而能够形成前者具有非对映立体催化特性而能够形成L-L-epidaunosamineepidaunosamine（表柔毛霉氨）（表柔毛霉氨）。而突变株。而突变株dnmVdnmV生生物合成甙元的能力和合成糖基转移酶的能力仍然保物合成甙元的能力和合成糖基转移酶的能力仍然保持，且由于糖基转移酶的底物专一性较差而不影响持，且由于糖基转移酶的底物专一性较差而不影响将表柔毛霉氨连接在原来的蒽环酮上，从而得到将表柔毛霉氨连接在原来的蒽环酮上，从而得到4-4-表柔红霉素和表柔红霉素和4-4-表阿霉素表阿霉素，如图所示。，如图所示。轻咳钾指纳雌公价郎危雄栽沟点吸铁呛搬鸣秧缕符滞妄尝淑戒尔勿藩赂糜第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药表柔红霉素和表阿霉素基因工程菌的构建表柔红霉素和表阿霉素基因工程菌的构建桶悬窜低蛆魄历情卯如贱润触暂捂径赃闺淑铀映杜剁蓬呵冉儒戈砒谣滔田第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药二、具有非核糖体生物合成肽类途径的二、具有非核糖体生物合成肽类途径的微生物药物产生菌的组合生物合成微生物药物产生菌的组合生物合成 n具有具有非核糖体生物合成途径（非核糖体生物合成途径（none none ribosomal peptide synthasesribosomal peptide synthases，NRPSsNRPSs）的环肽或糖肽类的环肽或糖肽类“天然产物天然产物”，如万古霉，如万古霉素、博莱霉素、环孢菌素素、博莱霉素、环孢菌素A A和埃坡霉素等进和埃坡霉素等进行了大量的研究工作，并取得了令人注目行了大量的研究工作，并取得了令人注目的成果。的成果。咽蜘舰制酞惜碌灶廉貉蛔袭兵字玖霄隆鞘柬趟襟甲像态东异船赘身比甭甭第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药Chloroeremomycin Chloroeremomycin 生物合成生物合成 俭人赏能令非坏静柜凉摸峡翱舷渭傈寅祸垢免嵌炯兆浊买凡臻揖臣良刷爷第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药n（1 1）小分子准备）小分子准备 在酶的催化下生成装配过程中在酶的催化下生成装配过程中需要的小分子化合物，对于万古霉素族糖肽类抗需要的小分子化合物，对于万古霉素族糖肽类抗生素而言包括：生素而言包括：非蛋白氨基酸和非蛋白氨基酸和TDP-L-b-TDP-L-b-epivancosamineepivancosamine；n（2 2）装配）装配 上步准备好的氨基酸通过腺苷化反应上步准备好的氨基酸通过腺苷化反应（adenylationadenylation）转换成为腺苷酸，而后与邻近肽）转换成为腺苷酸，而后与邻近肽载体蛋白（载体蛋白（peptide carrier protein, PCPpeptide carrier protein, PCP）上）上的巯基形成硫酯（的巯基形成硫酯（thiolationthiolation），），PCPPCP之间的缩合之间的缩合功能域（功能域（condensationcondensation）催化肽键形成。经过几）催化肽键形成。经过几个延伸过程，最后个延伸过程，最后TETE域将完成的肽切下。有时过域将完成的肽切下。有时过程中还会有差向异构作用程中还会有差向异构作用(epimerisation)(epimerisation)。n（3 3）装配后修饰）装配后修饰 在这步反应中通常进行氧化反在这步反应中通常进行氧化反应和糖基化，对于有的化合物还存在应和糖基化，对于有的化合物还存在N N端甲基化反端甲基化反应。应。评描屉虫喊耀戏塘末苛郸瘸了烘语团美许宏刺简彼耀敖秆袍疵萄突己琶疑第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药万古霉素的生物合成万古霉素的生物合成 另据研究，天然的万古霉素生物合成共有另据研究，天然的万古霉素生物合成共有3535步，其先以步，其先以五种自由的氨基酸单体合成一线五种自由的氨基酸单体合成一线形的七肽形的七肽，然后芳基边链在交联酶的催化下，然后芳基边链在交联酶的催化下适时地组合、交联，形成复杂的七肽骨架，适时地组合、交联，形成复杂的七肽骨架，最后最后UDP-glucoseUDP-glucose和和UDP-4-epi-vancosamineUDP-4-epi-vancosamine在糖基转移酶的作用下连接到七肽骨架上。在糖基转移酶的作用下连接到七肽骨架上。廖墒栗冲左惫爱娇龙穆猾滑山除嘛赠摆泵谜泳领刹际秘政胸研稻沸蝎歇函第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药万古霉素生物合成的五种起始自由氨基酸单体万古霉素生物合成的五种起始自由氨基酸单体 癌骨袋阳泊晕陋喜邢碧袄承娩洱烷昧畔范法蔓跌能禽血疼豢察颠租掌旭导第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药万古霉素生物合成的逆向合成分析图万古霉素生物合成的逆向合成分析图 套铸灾租皑绩刑诊缨滑掳诲狙顾锭都隙轧笋翻芍见氓乙些逆洽姓坏善接曲第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药在万古霉素家族中发现的糖基在万古霉素家族中发现的糖基 眨蛔砒担赢闽铱菇抒骚迫剃缆掏龟歇桌碧位罪障咽坯帖志哇有垦夹冻膏溪第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药GtfEGtfE糖基转移酶识别并将糖基转移酶识别并将UDP-glucoseUDP-glucose转移至七肽骨架上转移至七肽骨架上 脚韵浑拍丸郸坪合淑闽背肝盅倒搓使随串撞什温迎坷榨贯盘肤箔肥砰杉基第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药GtfDGtfD糖基糖基转移酶转移酶识别并识别并将将4 4epiepivancosaminevancosamine连接至连接至万古霉万古霉素骨架上素骨架上 瞅绢冬盟尘滇绩篡签叭钩踌它终术盼躇毙脂迎法框文血仅吩获缩险挡而媳第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药2 2、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状n糖肽类抗生素的组合生物合成主要有糖肽类抗生素的组合生物合成主要有4 4条途经条途经: :n第一，提供新的氨基酸单体，或者是利用已知生物合成途第一，提供新的氨基酸单体，或者是利用已知生物合成途经中的酶来催化生成新的我们所需要的氨基酸单体，使合经中的酶来催化生成新的我们所需要的氨基酸单体，使合成新的七肽骨架成新的七肽骨架; ;n第二，改变七肽第二，改变七肽NRPSNRPS装配线上的基因，从而达到重新设计装配线上的基因，从而达到重新设计生物合成途经的目的生物合成途经的目的; ;n第三，在七肽装配之后，干预修饰酶（第三，在七肽装配之后，干预修饰酶（tailoringtailoring）作用）作用的步骤，包括的步骤，包括N N甲基化、酪氨酸的甲基化、酪氨酸的羟化等羟化等; ;n第四，利用糖基转移酶将不同结构的糖基与不同苷元连接第四，利用糖基转移酶将不同结构的糖基与不同苷元连接以及连接不同的个数，从而产生具有不同生理活性的最终以及连接不同的个数，从而产生具有不同生理活性的最终产物。因此糖苷化酶可以作为一种制备各种不同糖苷化合产物。因此糖苷化酶可以作为一种制备各种不同糖苷化合物的催化剂，有可能从中找到具有潜在应用价值的新活性物的催化剂，有可能从中找到具有潜在应用价值的新活性物质。物质。赖瓶帐拯炬矢上咳矫宾扯报雏漾谐白敬愉稗芒缘胁蹿守裕志做膊段裹叁栋第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药2 2、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状nSolenbergSolenberg等从万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌等从万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌C329.4C329.4中克隆到了两个糖基转移酶基因中克隆到了两个糖基转移酶基因gtfEgtfE和和gtfDgtfD，并从，并从chloroeremomycinchloroeremomycin产生菌中克隆到了产生菌中克隆到了3 3个糖基转移酶基因个糖基转移酶基因gtfAgtfA、gtfBgtfB和和gtfCgtfC; ;n将将gtfBgtfB和和gtfEgtfE在大肠埃希氏菌中表达，研究了其在大肠埃希氏菌中表达，研究了其体外活性。结果表明当体外活性。结果表明当TDP-TDP-葡萄糖存在时，从大葡萄糖存在时，从大肠埃希氏菌中表达的糖基转移酶肠埃希氏菌中表达的糖基转移酶GtfBGtfB和和GtfEGtfE能够能够在体外将葡萄糖转移到万古霉素糖苷上，从而得在体外将葡萄糖转移到万古霉素糖苷上，从而得到中间体到中间体DVVDVV（desvancosaminyl vancomycindesvancosaminyl vancomycin）; ;n当底物换为当底物换为UDPUDP葡萄糖，葡萄糖，UDP-D-UDP-D-木糖时，仍然能木糖时，仍然能够转移到万古霉素糖苷上够转移到万古霉素糖苷上; ;nGtfEGtfE也能够将也能够将TDP/UDP-TDP/UDP-葡萄糖转移到无糖基化的葡萄糖转移到无糖基化的化合物化合物A47934A47934和和A41030A41030上，而上，而GtfBGtfB不能将化合物不能将化合物A47934A47934糖基化，表明糖基化，表明GtfEGtfE相对于相对于GtfBGtfB底物特异性底物特异性差。差。 台由揉酷尧罪礼滞欢标逛惹垛庞姥励策盲透椎珊龙庄峡拈四漳轧挛忽雕郝第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药2 2、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状n在在MatsushimaMatsushima等建立地无糖基化合物等建立地无糖基化合物A47934A47934产生菌丰加链霉菌（产生菌丰加链霉菌（Streptomyces Streptomyces toyocanesistoyocanesis）基因转移系统的基础上，）基因转移系统的基础上，SolenbergSolenberg等还成功地将含有糖基转移酶基等还成功地将含有糖基转移酶基因因gtfEgtfE的质粒导入到丰加链霉菌中，得到的质粒导入到丰加链霉菌中，得到了糖基化的了糖基化的A47934A47934衍生物。衍生物。去焰诀庭侯饵晦窿缘败眩总臀聘拽抽拽谨饯肇陛惮根添被遵衍抛帛罪鞠膊第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药GtfEGtfE和和GtfBGtfB在体内进行的糖苷化反应在体内进行的糖苷化反应 棠殖夹属荷炔则蚂午封吵彰砰冶宝褂迄匡紫脑泉善绷食坛促幻匆邻视晌掖第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药2 2、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状nLoseyLosey等采用化学酶法合成了很多等采用化学酶法合成了很多NDP-NDP-葡萄糖的类葡萄糖的类似物来研究似物来研究GtfDGtfD和和GtfEGtfE的催化活性。结果表明，的催化活性。结果表明，GtfEGtfE不但能用不但能用UDP-UDP-葡萄糖类似物，葡萄糖类似物，TDP-TDP-葡萄糖类葡萄糖类似物作为糖基供体，同时还可以采用脱氧葡萄糖似物作为糖基供体，同时还可以采用脱氧葡萄糖类似物以及氨基在类似物以及氨基在2 2、3 3、4 4、或、或6 6位的位的TDP/UDP-TDP/UDP-葡葡萄糖类似物作为糖基供体萄糖类似物作为糖基供体; ;n更值得注意的是，一般来讲更值得注意的是，一般来讲GtfDGtfD将将vancosaminevancosamine连连接至万古霉素的假糖苷的葡萄糖配基上，试验结接至万古霉素的假糖苷的葡萄糖配基上，试验结果表明果表明GtfDGtfD还可以将还可以将4-epi-vancosamine4-epi-vancosamine连接至连接至GtfEGtfE以不同的糖基供体为底物所催化生成的衍生以不同的糖基供体为底物所催化生成的衍生物上（糖基化位点在物上（糖基化位点在2-2-脱氧的除外）。这样产生脱氧的除外）。这样产生的带有两个氨基糖的万古霉素衍生物就提供了一的带有两个氨基糖的万古霉素衍生物就提供了一种新的结构，以便于继续进行类似于种新的结构，以便于继续进行类似于oritavancinoritavancin的烷基化从而提高生物活性。的烷基化从而提高生物活性。伦索美高示张峰永臼羊今忠晒粱顶逮尼滩愤章扁碳汀各五崩狈挖券欢峪内第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药2 2、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状nChen等从等从chloroeremomycin 的生物合成基因的生物合成基因簇中克隆到了簇中克隆到了L-epivancosamine的合成基因，的合成基因，在大肠埃希氏菌中表达，并成功地在体外重建了在大肠埃希氏菌中表达，并成功地在体外重建了从从TDP-4-酮基酮基-6-脱氧脱氧D-葡萄糖经过葡萄糖经过C-2脱氧合作脱氧合作用用(deoxygenation)、C-3胺化胺化(amination)、甲基、甲基化化(methylation)、C-4酮基还原、酮基还原、C-5表构异化表构异化等步骤得到了等步骤得到了TDP-L epivancosamine。这个糖。这个糖基的基因克隆和表达为以后组合生物合成提供了基的基因克隆和表达为以后组合生物合成提供了信息。信息。 狱屹碟培邢名申茹伯辕舍乒徒膳桨眩侯妮氏琳荒么判掂先焰娇业磊翌集捷第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药2 2、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状n对万古霉素等糖肽类抗生素进行的组合生对万古霉素等糖肽类抗生素进行的组合生物合成，不单单可以通过外源添加不同的物合成，不单单可以通过外源添加不同的糖基供体，还可以通过将产生菌体内原有糖基供体，还可以通过将产生菌体内原有的糖合成途径进行破坏或置换、以及对糖的糖合成途径进行破坏或置换、以及对糖基转移酶进行改造等改变糖基化方式产生基转移酶进行改造等改变糖基化方式产生新的化合物新的化合物; ;n另外，对肽骨架装配时所需的氨基酸生物另外，对肽骨架装配时所需的氨基酸生物合成的了解以及相关基因的分离和表达，合成的了解以及相关基因的分离和表达，也为万古霉素等糖肽类抗生素的组合生物也为万古霉素等糖肽类抗生素的组合生物合成提供了有益的信息。合成提供了有益的信息。 释隧机闭肆液仿潭饵洒吉所旨攻邵涵别屁锌款炯饼沦唉攒世徘皆乡引烃乍第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药2 2、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状n目前对于研发新的万古霉素等糖肽类杂合抗生素目前对于研发新的万古霉素等糖肽类杂合抗生素主要集中在对糖基化方式的研究和改造，但至今主要集中在对糖基化方式的研究和改造，但至今为止绝大多数的研究是在大肠埃希氏菌中或在为止绝大多数的研究是在大肠埃希氏菌中或在S. S. toyocanesistoyocanesis等链霉菌中进行异源表达等链霉菌中进行异源表达; ;n美国美国ChristopherChristopher领导的小组以及德国领导的小组以及德国WohllebenWohlleben所领导的小组对万古霉素生物合成途径中的很多所领导的小组对万古霉素生物合成途径中的很多酶进行了体外表达，并对酶学性质，立体结构等酶进行了体外表达，并对酶学性质，立体结构等进行了详细的研究，为万古霉素等糖肽类抗生素进行了详细的研究，为万古霉素等糖肽类抗生素的组合生物合成做了充分的准备的组合生物合成做了充分的准备; ;n但目前在万古霉素等糖肽类抗生素产生菌体内进但目前在万古霉素等糖肽类抗生素产生菌体内进行组合生物合成还未见报道，关键可能是缺乏完行组合生物合成还未见报道，关键可能是缺乏完善的拟无枝酸菌遗传操作系统。善的拟无枝酸菌遗传操作系统。 冲沽熊里脐疲测寐话叠主擒摹沪氯衬军渔苦汉割舞医猫恍陶银幢蒂鸯铰警第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药3 3、类胡萝卜素的组合生物合成、类胡萝卜素的组合生物合成n作为抗氧化剂，类胡萝卜素具有很大的药物应用作为抗氧化剂，类胡萝卜素具有很大的药物应用前景，如已经显示这类化合物对心血管疾病和肿前景，如已经显示这类化合物对心血管疾病和肿瘤具有相当的疗效瘤具有相当的疗效; ;n迄今为止，已有迄今为止，已有600600多种类胡萝卜素的结构被确证，多种类胡萝卜素的结构被确证，但由于化学合成的困难，以及从微生物代谢产物但由于化学合成的困难，以及从微生物代谢产物和植物组织中分离困难而难以实现产业化和植物组织中分离困难而难以实现产业化; ;n但是，近年来发展的组合生物合成技术，有可能但是，近年来发展的组合生物合成技术，有可能通过外源基因在通过外源基因在E.coliE.coli中的杂合表达，来制备这中的杂合表达，来制备这些稀少的衍生物甚至产生新的类胡萝卜素化合物。些稀少的衍生物甚至产生新的类胡萝卜素化合物。吮狮墟鬃泽萎额未拇消淘娜忆汝烟镇沦翅汕挥农庶尔熬眼画魄廉史辅党问第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药贾懂秒罪坏铂缀绅包忌枉丝擞夫俭棕重蛤仍街汹挎村筏癸偶海寄羽蔓乾破第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第三节第三节 组合生物催化与组合生物催化与微生物新药的发现微生物新药的发现勋会摹鹊痛饵赛晨索硫凶碴阵瘦虫唆凰尿胖屈贪偿炯跑痞淡停崭毙蛙军叠第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药组合生物转化（催化）组合生物转化（催化）（combinatorial biocatalysiscombinatorial biocatalysis）n是指利用一种以上的具有特殊转化功能的是指利用一种以上的具有特殊转化功能的微生物或酶，对同一个母体化合物进行组微生物或酶，对同一个母体化合物进行组合转化，以得到化学结构的多样性，它是合转化，以得到化学结构的多样性，它是从已知化合物中寻找新型衍生物以及从简从已知化合物中寻找新型衍生物以及从简单化合物制备复杂化合物的有效手段单化合物制备复杂化合物的有效手段; ;n从某种角度讲，它比化学合成的方法更为从某种角度讲，它比化学合成的方法更为简单和有效简单和有效; ;n这是一个新的研究领域。这是一个新的研究领域。挣嗽桐譬辗邻釉乎思盏峨互而逼烦揽酱惫煌奇背房诛公捉匡涸函溶宽舶早第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药募石碌犀教盾茫垒舰常日岛墓绚宣孺豹浓扰独骸匣医巍唱焕要葵登傻跨济第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药模拟生物体的生命过程，利用组合生物模拟生物体的生命过程，利用组合生物催化技术构建先导化合物库催化技术构建先导化合物库 焉桥每谤议钨悟来念珍屎淫讨盏旺昭躺潦堂拈陈锚介负笆讨凶讨妻束侩铬第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药可用可用于组于组合合合合成的成的生物生物催化催化反应反应 反应类型反应类型特异性反应特异性反应引进功能基团引进功能基团CCCC键的形成键的形成羟化反应羟化反应卤化反应卤化反应卤代醇的形成卤代醇的形成环加成环加成加入胺加入胺对已有功能基团的改造对已有功能基团的改造氧化醇至醛和酮氧化醇至醛和酮还原醛和酮至醇还原醛和酮至醇氧化硫化物至亚砜氧化硫化物至亚砜氧化氨基至硝基氧化氨基至硝基氧化硫至硫醛氧化硫至硫醛水解腈至羧酸水解腈至羧酸用羟基置换氨基用羟基置换氨基内酯化内酯化异构化异构化差向异构化差向异构化脱烷基化脱烷基化甲基转移甲基转移加入基团至功能基团加入基团至功能基团酯化作用酯化作用酯的形成酯的形成氨基甲酸酯的形成氨基甲酸酯的形成环化环化胺化胺化磷酸化磷酸化逊涌聋铆及山翔腮具讣姑态舔鹰酥考敦华芋绚兆狠制响卞其泅侍砰戎乘伶第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药利用生物催化发现先导化合物的优越性利用生物催化发现先导化合物的优越性 可能进行反应的范围广；可能进行反应的范围广；能够定向进行区域选择性和立体选择性；能够定向进行区域选择性和立体选择性；不需基团保护和脱保护，一步实现所需的反应；不需基团保护和脱保护，一步实现所需的反应；在温和和均一的条件下可容易地实现自动化和一在温和和均一的条件下可容易地实现自动化和一步反应的重现性；步反应的重现性；温和的反应条件复杂易变的分子结构的稳定性；温和的反应条件复杂易变的分子结构的稳定性；高的催化活性可以降低催化剂的用量；高的催化活性可以降低催化剂的用量；酶的固定化可以使催化剂反复和循环使用；酶的固定化可以使催化剂反复和循环使用；生物催化剂在环境中完全被降解。生物催化剂在环境中完全被降解。 狭冻眯参胁具处毒厂胞总谈枕篇汉障笛亿鹤荚施悠掐酵燃芒料酮甚哼整冈第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药 生物催化产生的分子库生物催化产生的分子库前导化合物前导化合物库容量库容量内容内容腺苷腺苷922代代3个反应级个反应级BOD12223代代3个反应级个反应级MDB4574代代9个反应级个反应级二羟基托烷二羟基托烷32区域选择性区域选择性单单BOC二胺二胺26一锅炒，单酶一锅炒，单酶肽肽？一锅炒，不规则一锅炒，不规则紫杉醇紫杉醇282代代复杂的天然产物复杂的天然产物矮茶素矮茶素6002代代7个反应级个反应级1673代代区域选择性区域选择性低聚糖低聚糖15重组酶重组酶柜咆氛残翁祸尉所漏命哮避祥桌嫁肉伊垛妈互过糊凤骄缚佛赂谓絮腥卿藩第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药天然产物库的构建天然产物库的构建 屹鄙丁娩兴碗师六吝谍妈观邱釉镇卵携蒂硝洞盐雹狞涉买昨瞥嫂厩壹带矽第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药矮茶素的组合生物催化矮茶素的组合生物催化 椎孜震涤鸣迭偷蒂巩厂釉召磨古豺橱泰焙撰雄趟淋策井桓阐雁彩慌罪辱蜜第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药贾懂秒罪坏铂缀绅包忌枉丝擞夫俭棕重蛤仍街汹挎村筏癸偶海寄羽蔓乾破第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药谢谢大家！谢谢大家！哮灿劣菊翻痈豺痞祝抵斡俘浴悄叔睡四吞稻末单姑奉碌狮洪柬姆艇壬筑酝第4章利用生物合成原理寻找微生物新药第4章利用生物合成原理寻找微生物新药