诊诊 断断 酶酶 学学 赵敏赵敏 第六章第六章 诊断酶学诊断酶学第一节第一节 概述概述第二节第二节 酶促反应动力学酶促反应动力学第三节第三节 血清酶血清酶第四节第四节 酶活性浓度的测定技术酶活性浓度的测定技术第五节第五节 酶的免疫化学测定酶的免疫化学测定第六节第六节 同工酶及其亚型测定同工酶及其亚型测定第七节第七节 临床常用血清酶、同工酶及其临床常用血清酶、同工酶及其 亚型分析亚型分析第一节概述第一节概述一、酶的组成、结构和功能一、酶的组成、结构和功能1 1、酶的本质和特性、酶的本质和特性本质：蛋白质（绝大部分）或核酸（极少数）本质：蛋白质（绝大部分）或核酸（极少数）特性：极高的催化效率、高度的特异性、催化特性：极高的催化效率、高度的特异性、催化的可调节性。的可调节性。常用术语常用术语酶促反应：酶促反应： 由酶所催化的反应由酶所催化的反应酶活性：酶活性： 酶催化化学反应的能力酶催化化学反应的能力底物：底物： 酶催化所作用的物质酶催化所作用的物质产物：产物： 酶促反应的生成物酶促反应的生成物酶的特异性：酶的特异性：酶对作用物的选择性酶对作用物的选择性激活剂：激活剂： 加速酶促反应的物质加速酶促反应的物质抑制剂：抑制剂： 减慢甚至终止酶促反应的物质减慢甚至终止酶促反应的物质 2 2、酶的结构与功能、酶的结构与功能 单纯酶：单纯酶：由约由约1001001000010000个氨基酸肽键相连而成个氨基酸肽键相连而成酶酶 结合酶结合酶 蛋白质蛋白质酶蛋白酶蛋白 辅酶辅酶 非蛋白部分非蛋白部分辅因子辅因子 辅基辅基 2 2、酶的结构与功能、酶的结构与功能 酶是蛋白质，具有一、二、三、四级结构酶是蛋白质，具有一、二、三、四级结构 单体酶：单体酶：只由一条多肽链构成的酶只由一条多肽链构成的酶 寡聚酶：寡聚酶：由多个相同或不同亚基以非共价键连接的酶由多个相同或不同亚基以非共价键连接的酶 多酶体系：多酶体系：在细胞内存在着许多由几种不同功能的酶在细胞内存在着许多由几种不同功能的酶 彼此聚合而成的多酶复合物彼此聚合而成的多酶复合物 酶的活性中心酶的活性中心 酶的必需基团在一级结构上可能相距很酶的必需基团在一级结构上可能相距很远，但在空间结构上彼此靠近，组成具有能远，但在空间结构上彼此靠近，组成具有能与底物结合并起催化反应的特定空间结构区与底物结合并起催化反应的特定空间结构区域，称为域，称为酶的活性中心酶的活性中心。 对结合酶来说，辅酶或辅基参与酶活性对结合酶来说，辅酶或辅基参与酶活性中心的组成。中心的组成。二、酶的催化作用机制二、酶的催化作用机制1 1、活化能、活化能2 2、酶降低活化能的作用机制、酶降低活化能的作用机制 酶通过与底物形成一种或多种中间酶通过与底物形成一种或多种中间复合物来降低反应的活化能复合物来降低反应的活化能三、酶的命名、分类与编号三、酶的命名、分类与编号 第二节第二节 酶促反应动力学酶促反应动力学一、酶促反应一、酶促反应 K K1 1 K K2 2E + S ES E + PE + S ES E + P K K-1-1酶酶 底物底物 酶酶- -底物复合物底物复合物 酶酶 产物产物 VmaxVmaxS SV VO O = = Km + Km +S S米米- -曼氏方程曼氏方程最大反应速率最大反应速率底物浓度底物浓度米氏常数米氏常数反应速反应速度度 （一）（一）KmKm 若若v=0.5Vmaxv=0.5Vmax，则，则Km=SKm=S，可见，可见KmKm值值等于酶促反应的初速率为最大速率等于酶促反应的初速率为最大速率VmaxVmax一半一半时的底物浓度。时的底物浓度。KmKm值一般在值一般在1010-6-61010-2-2molmolL L之间。之间。KmKm只与酶的性质有关，而与酶的浓只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关。度无关。VmaxSVO = Km +SKm Km 意义：意义： KmKm是酶的特征性常数之一，在临床酶学分是酶的特征性常数之一，在临床酶学分析中具有重要意义。析中具有重要意义。 1 11 1KmKm可近似地表示酶对底物的亲和力的大小，可近似地表示酶对底物的亲和力的大小，KmKm值越小，表示酶与底物的亲和力越大，反之亦然。值越小，表示酶与底物的亲和力越大，反之亦然。 2 2如果一个酶有几种底物，则对每一种底物各有如果一个酶有几种底物，则对每一种底物各有一个特定的一个特定的KmKm值，其中值，其中KmKm值最小的底物大都是该酶的值最小的底物大都是该酶的最适底物或天然底物。最适底物或天然底物。 VmaxSVO = Km +S3 3如已知酶的如已知酶的KmKm，可计算某一底物浓度时反应速率，可计算某一底物浓度时反应速率v v和最大速率和最大速率VmaxVmax的比值，并可推知酶的活性中心被底的比值，并可推知酶的活性中心被底物饱和的分数。同样，如要求物饱和的分数。同样，如要求v v和和VmaxVmax有一定的百分有一定的百分比，也可算出所需底物浓度为其比，也可算出所需底物浓度为其KmKm的多少倍。的多少倍。4 4利用工具酶来测定体液中某一成分的浓度或某一利用工具酶来测定体液中某一成分的浓度或某一酶的催化活性浓度时，可根据米酶的催化活性浓度时，可根据米- -曼氏方程或其衍变曼氏方程或其衍变方程式来计算工具酶的用量。方程式来计算工具酶的用量。5 5测定测定KmKm值可鉴别不同来源但催化相同反应的酶是值可鉴别不同来源但催化相同反应的酶是同一种酶或是同工酶。同一种酶或是同工酶。 VmaxSVO = Km +S6 6如一个酶催化正逆两个方向，测定正逆两个如一个酶催化正逆两个方向，测定正逆两个方向底物的方向底物的KmKm及底物浓度，可大体推测该酶在及底物浓度，可大体推测该酶在体内催化反应的方向及其催化效率。体内催化反应的方向及其催化效率。 7 7在代谢酶系中，当一组酶催化连续的代谢反在代谢酶系中，当一组酶催化连续的代谢反应时，如已知各酶的应时，如已知各酶的KmKm及其相应底物的浓度，及其相应底物的浓度，有助于寻找代谢的限速步骤。一般有助于寻找代谢的限速步骤。一般KmKm值最大的值最大的酶所催化的反应为该酶系的限速步骤。酶所催化的反应为该酶系的限速步骤。VmaxSVO = Km +S( (二二) )VmaxVmax VmaxVmax表示在一定酶量下的最大反应速率，表示在一定酶量下的最大反应速率，即酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度即酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度呈正比。在酶的浓度不变时，对于特定底物而言，呈正比。在酶的浓度不变时，对于特定底物而言，VmaxVmax也是一个常数。也是一个常数。 ( (三三)Km)Km和和VmaxVmax的测定的测定 将米曼氏方程进行倒数处理，将米曼氏方程进行倒数处理，而而转换成直线方程为：转换成直线方程为：1 1maxmax0 01 1 KmKm1 1o o斜率斜率双倒数作图法双倒数作图法 三、酶促反应的影响因素及反应条件的选择三、酶促反应的影响因素及反应条件的选择 1 1、酶浓度、酶浓度 2 2、底物的种类和浓度、底物的种类和浓度 3 3、缓冲液的种类、离子强度和、缓冲液的种类、离子强度和pH pH 4 4、温度、温度 5 5、激活剂与抑制剂、激活剂与抑制剂 6 6、其它、其它 1 1、酶浓度、酶浓度 在在S S E E时，酶促反应随酶浓度时，酶促反应随酶浓度的增加而增加，即反应速率与酶的浓度成正比。的增加而增加，即反应速率与酶的浓度成正比。 病理情况下，酶浓度过高时，底物过早而且病理情况下，酶浓度过高时，底物过早而且过多的被消耗，影响酶活性的测定，故需用生理过多的被消耗，影响酶活性的测定，故需用生理盐水或其它缓冲液进行适当的稀释，但要注意稀盐水或其它缓冲液进行适当的稀释，但要注意稀释对测定结果的影响，如低酶浓度时，酶易解离释对测定结果的影响，如低酶浓度时，酶易解离为单体，常比多聚体更易失活。为单体，常比多聚体更易失活。 2 2、底物的种类和浓度、底物的种类和浓度一级反应零级反应 一般选择一般选择KmKm最小最小的最适底物，酶测定的最适底物，酶测定时底物浓度最好为时底物浓度最好为KmKm的的10102020倍。倍。 ( (三三) )缓冲液的种类、离子强度和缓冲液的种类、离子强度和pHpH酶与底物结合的能力，酶的催化活性，会酶与底物结合的能力，酶的催化活性，会受不同受不同pHpH的影响，只有在最佳缓冲系统内才能的影响，只有在最佳缓冲系统内才能充分表达。各种酶都具有使酶促反应速率最大充分表达。各种酶都具有使酶促反应速率最大时的时的pHpH，即最适，即最适pHpH。一般来说，动物酶多在。一般来说，动物酶多在6.56.58.08.0之间。但之间。但ACPACP反应的最适反应的最适pHpH为为4.04.07.07.0而而ALPALP则为则为9.0 9.0 10.010.0。 最适最适pHpH并非酶的特征性常数，易受缓冲液的种类、离子并非酶的特征性常数，易受缓冲液的种类、离子强度及底物浓度不同等因素影响。临床酶学测定时发现，强度及底物浓度不同等因素影响。临床酶学测定时发现，用不同种类的缓冲液配制相同用不同种类的缓冲液配制相同pHpH介质所测酶活性并不相同。介质所测酶活性并不相同。缓冲液的离子强度也可影响酶的活性。必须强调的是，各缓冲液的离子强度也可影响酶的活性。必须强调的是，各种体液样品本身也是缓冲液，和底物混合后不一定维持原种体液样品本身也是缓冲液，和底物混合后不一定维持原来来pHpH，也会影响酶活性测定结果，所以应严格掌握测定样，也会影响酶活性测定结果，所以应严格掌握测定样品与底物的用量比例，一般样品在总体积中的比例应不超品与底物的用量比例，一般样品在总体积中的比例应不超过过1010。此外，缓冲液中的物质不应与分析系统中的任何。此外，缓冲液中的物质不应与分析系统中的任何物质反应，否则应特别加以说明。物质反应，否则应特别加以说明。 ( (四四) )温度温度 酶促反应也有一个最适温度，在其酶促反应也有一个最适温度，在其两侧反应速率都比较低。在达到最适温两侧反应速率都比较低。在达到最适温度以前，温度每增加度以前，温度每增加1010，反应速率增，反应速率增加加1 12 2倍。但温度对酶活性的影响具有倍。但温度对酶活性的影响具有双重性，一方面温度升高可加快酶促反双重性，一方面温度升高可加快酶促反应；而另一方面温度可能使酶失活。应；而另一方面温度可能使酶失活。 人体大多数酶的最适温度为人体大多数酶的最适温度为3737左右，超左右，超过过4242酶活性就逐渐降低，至酶活性就逐渐降低，至6060时酶因蛋时酶因蛋白变性而失去活性。反之，酶在白变性而失去活性。反之，酶在2020以下时以下时几乎无催化反应。酶的最适温度与底物浓度、几乎无催化反应。酶的最适温度与底物浓度、pHpH、离子强度、保温时间等许多因素有关。、离子强度、保温时间等许多因素有关。( (五五) )激活剂与抑制剂激活剂与抑制剂临床酶学测定中广泛应用金属离子等激活剂临床酶学测定中广泛应用金属离子等激活剂来提高测定的灵敏度。例如所有转磷酸的酶，如来提高测定的灵敏度。例如所有转磷酸的酶，如激酶类和激酶类和ALPALP的反应都需要的反应都需要MgMg2+2+的参加，如在反应的参加，如在反应体系中加入体系中加入EDTAEDTA等螯合剂或以其为抗凝剂常抑制等螯合剂或以其为抗凝剂常抑制一些酶的活性。测定一些酶的活性。测定CKCK活性时，加入的激活剂有活性时，加入的激活剂有MgMg2+2+和巯基，其中和巯基，其中MgMg2+2+是是CKCK的辅基，含巯基的的辅基，含巯基的N-N-乙乙酰酰-L-L-半胱氨酸半胱氨酸(NAC)(NAC)使使CKCK被激活。被激活。 抑制剂所产生的抑制作用分为不可逆抑制剂所产生的抑制作用分为不可逆性与可逆性两类。前者抑制剂与酶共价结性与可逆性两类。前者抑制剂与酶共价结合，使酶活性丧失。后者抑制剂通过非共合，使酶活性丧失。后者抑制剂通过非共价键与酶可逆性结合。在设计和选择酶测价键与酶可逆性结合。在设计和选择酶测定的方法时，应设法避免抑制剂对酶促反定的方法时，应设法避免抑制剂对酶促反应的影响。应的影响。 第三节第三节 血血 清清 酶酶“血清酶血清酶”是指存在于血清中的酶，而非血清特是指存在于血清中的酶，而非血清特定产生的。定产生的。一、血清酶的来源一、血清酶的来源 根据酶的来源及其在血浆中发挥催化功能的情况，根据酶的来源及其在血浆中发挥催化功能的情况，可将血清酶分成两大类。可将血清酶分成两大类。 1 1、血浆特异酶、血浆特异酶 主要指作为血浆蛋白的固有主要指作为血浆蛋白的固有成分，在血浆中发挥特定的催化作用的酶，如凝血酶原。成分，在血浆中发挥特定的催化作用的酶，如凝血酶原。 2 2、非血浆特异酶、非血浆特异酶 这类酶在血浆中浓度很低，并且在血浆中很少发挥催化这类酶在血浆中浓度很低，并且在血浆中很少发挥催化作用。可分为：作用。可分为： 外分泌酶外分泌酶 指来源于消化腺或其他外分泌腺的酶，如胰淀粉酶等。指来源于消化腺或其他外分泌腺的酶，如胰淀粉酶等。它们在血液中含量与相应的分泌腺的功能及疾病有关。它们在血液中含量与相应的分泌腺的功能及疾病有关。 细胞酶细胞酶 指存在于各组织细胞中进行代谢的酶类。随着细胞的新指存在于各组织细胞中进行代谢的酶类。随着细胞的新陈代谢，有少量酶释入血液。其中大部分无器官专一性，只陈代谢，有少量酶释入血液。其中大部分无器官专一性，只有小部分来源于特定的组织，有器官专一性。这类酶细胞内有小部分来源于特定的组织，有器官专一性。这类酶细胞内外浓度差异悬殊，病理情况下极易升高，其下降的临床意义外浓度差异悬殊，病理情况下极易升高，其下降的临床意义很少。这些酶最常用于临床诊断，如转氨酶、很少。这些酶最常用于临床诊断，如转氨酶、LDLD、CKCK等。等。二、血清酶的去路二、血清酶的去路1 1、血清酶的半寿期、血清酶的半寿期 酶失活至原来活性一半时所需时间称为酶失活至原来活性一半时所需时间称为酶酶的半寿期的半寿期。一般以半寿期来代表酶从血中清除。一般以半寿期来代表酶从血中清除的快慢。的快慢。 血清酶甚至同工酶之间半寿期差别很大。这些血清酶甚至同工酶之间半寿期差别很大。这些有助于了解同一疾病不同酶升高持续时间的差异，有助于了解同一疾病不同酶升高持续时间的差异，半寿期长的酶，在血清中持续时间长。半寿期长的酶，在血清中持续时间长。 2 2、血清酶的失活和排泄、血清酶的失活和排泄 研究表明酶主要是在血管内失活或分解的，研究表明酶主要是在血管内失活或分解的，酶的清除与血浆蛋白的清除途径并不完全相同。酶的清除与血浆蛋白的清除途径并不完全相同。血清酶受蛋白酶水解而产生的低分子多肽或氨基血清酶受蛋白酶水解而产生的低分子多肽或氨基酸可经小肠粘膜排至肠腔，再彻底分解成氨基酸酸可经小肠粘膜排至肠腔，再彻底分解成氨基酸后重吸收，其中大部分氨基酸可被组织利用，不后重吸收，其中大部分氨基酸可被组织利用，不能利用的氨基酸可经尿排出体外。能利用的氨基酸可经尿排出体外。 三、血清酶变化的病理机制三、血清酶变化的病理机制 正常情况下血清酶活性相对恒定。但在一些正常情况下血清酶活性相对恒定。但在一些病理情况下，如细胞膜通透性增加或细胞坏死，病理情况下，如细胞膜通透性增加或细胞坏死，细胞内酶合成增加，酶排泄障碍，恶性肿瘤异位细胞内酶合成增加，酶排泄障碍，恶性肿瘤异位分泌，酶合成障碍，中毒及遗传缺陷等，常导致分泌，酶合成障碍，中毒及遗传缺陷等，常导致血清中酶活性的改变。血清中酶活性的改变。 ( (一一) )酶合成异常酶合成异常 1 1合成减少合成减少 肝损害时肝损害时合成酶的能力受损合成酶的能力受损，血清中相应酶减，血清中相应酶减少，慢性肝病时更为显著。如肝病时因少，慢性肝病时更为显著。如肝病时因LCATLCAT合成的合成的减少而使血清中减少而使血清中 ChEChE浓度降低；浓度降低；酶基因变异酶基因变异，也可，也可引起酶合成减少，如肝豆状核变性引起酶合成减少，如肝豆状核变性 (Wilson(Wilson病病) ) 患患者，血中铜氧化酶可明显下降。者，血中铜氧化酶可明显下降。 2. 合成增多合成增多 细胞对血清酶的合成增加或酶的诱导作用是细胞对血清酶的合成增加或酶的诱导作用是血清酶活性升高的重要原因。血清酶活性升高的重要原因。 增生性疾病如骨骼疾病时，可因成骨细胞增增生性疾病如骨骼疾病时，可因成骨细胞增生，合成分泌更多的生，合成分泌更多的ALPALP而使血清中此酶升高。而使血清中此酶升高。一部分恶性肿瘤患者血中酶升高有可能与肿瘤细一部分恶性肿瘤患者血中酶升高有可能与肿瘤细胞中酶的合成增加有关，如前列腺癌细胞可产生胞中酶的合成增加有关，如前列腺癌细胞可产生大量大量ACPACP。 ( (二二) )酶释放增加酶释放增加 酶从病变酶从病变( (或损伤或损伤) )细胞中释放增加是疾病时大多数细胞中释放增加是疾病时大多数血清酶增高的主要机制。研究表明，炎症、缺血缺氧、血清酶增高的主要机制。研究表明，炎症、缺血缺氧、能源供应缺乏、坏死和创伤等是细胞释放大分子酶蛋白能源供应缺乏、坏死和创伤等是细胞释放大分子酶蛋白的重要原因。细胞酶的释放量还受下述一些因素影响：的重要原因。细胞酶的释放量还受下述一些因素影响： 1 1细胞内外酶浓度的差异细胞内外酶浓度的差异 2 2酶的相对分子量酶的相对分子量 3 3酶的组织分布酶的组织分布 4 4酶在细胞内的定位和存在形式酶在细胞内的定位和存在形式 ( (三三) )酶排出异常酶排出异常 约有约有2424的血清的血清AMYAMY由肾脏排出，肾功能减退时，由肾脏排出，肾功能减退时，血清血清AMYAMY活性升高可能因酶排泄障碍而在血液中滞留所活性升高可能因酶排泄障碍而在血液中滞留所致。胆道梗阻时，血清致。胆道梗阻时，血清ALPALP升高的原因是梗阻区升高的原因是梗阻区ALPALP合合成加强，成加强，ALPALP排泄受阻而逆流人血。但对于大多数酶而排泄受阻而逆流人血。但对于大多数酶而言，并不存在酶经肾脏或胆道排出异常而导致血清酶言，并不存在酶经肾脏或胆道排出异常而导致血清酶升高的这种清除机制。升高的这种清除机制。 四、血清酶的生理差异四、血清酶的生理差异1 1性别性别: :多数血清酶的男女性别差异不大，但少数酶如多数血清酶的男女性别差异不大，但少数酶如CK、 ALP及及-GT等有性别差异，男性高于女性。等有性别差异，男性高于女性。 2 2年龄年龄: :血清中有些酶的活性常随年龄而变化。最明显的一个血清中有些酶的活性常随年龄而变化。最明显的一个 例子是例子是ALP 3 3进食进食: :血清中大多数酶不受进食的影响，故测定酶活性不一血清中大多数酶不受进食的影响，故测定酶活性不一 定需要空腹采血。高脂、高糖饮食后血清定需要空腹采血。高脂、高糖饮食后血清ALP活性升高。活性升高。 4 4运动运动: :激烈的肌肉运动可使血清中多种酶，如激烈的肌肉运动可使血清中多种酶，如CK等活性升高。等活性升高。 5 5妊娠妊娠: :妊娠胎盘组织可分泌一些酶进入母体血液，如耐热妊娠胎盘组织可分泌一些酶进入母体血液，如耐热ALP、 LD等，引起血清中这些酶升高等，引起血清中这些酶升高。 6 6其他其他: :血清中有些酶与同工酶有种族差异血清中有些酶与同工酶有种族差异.