第七章第七章 微生物的生微生物的生长及其控制长及其控制生长和繁殖是保证生长和繁殖是保证微生物获得巨大数量的必要前提。微生物获得巨大数量的必要前提。 生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致个体生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。体积扩大的生物学过程。生长生长（growth）：）： 生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。繁殖繁殖（reproduction）：）：生长是一个逐步发生的生长是一个逐步发生的量变过程量变过程，繁殖是一个产生新的生命个体的繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程质变过程。在高等生物里这在高等生物里这两个过程两个过程可以明显分开，可以明显分开，但在低等特别是在单细胞的生物里，由于细胞小，但在低等特别是在单细胞的生物里，由于细胞小，这两个过程是紧密联系又很难划分的过程。这两个过程是紧密联系又很难划分的过程。生长和繁殖生长和繁殖群体生长群体生长 = 个体生长个体生长 + 个体繁殖个体繁殖个体生长个体生长 个体繁殖个体繁殖 群体生长群体生长在一定时间和条件下细胞数量的增加在一定时间和条件下细胞数量的增加（微生物群体生长）（微生物群体生长）微生物生长微生物生长:在微生物学中提到的在微生物学中提到的“生长生长”，一般均指群体生长，这一点与，一般均指群体生长，这一点与研究大生物时有所不同。研究大生物时有所不同。第一节第一节 测定生长繁殖的方法测定生长繁殖的方法单位时间里单位时间里微生物数量微生物数量或或生物量生物量（Biomass）的变化的变化微生物生长：微生物生长：微生物生长的测定：微生物生长的测定：个体计数个体计数群体重量测定群体重量测定群体生理指标测定群体生理指标测定评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死或杀死)作用的效果；作用的效果；客观地反映微生物生长的规律；客观地反映微生物生长的规律；一、测生长量一、测生长量测定生长量的方法很多，适用于一切微生物。测定生长量的方法很多，适用于一切微生物。（一）（一）测生长量直接法测生长量直接法（二）（二）测生长量间接法测生长量间接法（一）测生长量直接法（一）测生长量直接法测体积法测体积法：粗放型粗放型，在刻度离心管中测沉降量，在刻度离心管中测沉降量称干重法称干重法：精确型精确型，离心法和过滤法获得菌体细胞，离心法和过滤法获得菌体细胞，微生物的干重一般为其湿重的微生物的干重一般为其湿重的10102020。测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法111.1.测体积：测体积：在刻度离心在刻度离心管中离心，管中离心，测定沉淀测定沉淀多多少来确定微生物的生长少来确定微生物的生长情况。情况。 2.2.测干重：测干重： 将细胞培养液离心将细胞培养液离心或过滤后，洗涤除去培养基成分或过滤后，洗涤除去培养基成分后转移到适当的容器中，置后转移到适当的容器中，置100105干燥箱烘干干燥箱烘干或或低温低低温低压干燥（压干燥（6080）至恒重后至恒重后，称重。称重。 若是固体培养物，可先加热若是固体培养物，可先加热溶解琼脂，溶解琼脂， 然后过滤出菌体，然后过滤出菌体，洗涤、干燥后再称重。该法适合洗涤、干燥后再称重。该法适合于单细胞和多细胞微生物的生长于单细胞和多细胞微生物的生长测定。测定。 （二）测生长量间接法（二）测生长量间接法 1.1.比浊法比浊法 用用分光光度法分光光度法对无色的微生物悬浮液进行对无色的微生物悬浮液进行测定，一般选用测定，一般选用450450650650nmnm波段。波段。实验测量时应控制在菌浓度与实验测量时应控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，光密度成正比的线性范围内，否则不准确。否则不准确。 在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度（optical density, 即即O.D.）表示菌量。表示菌量。 若要连续跟踪某一培养物的生长动态，可用带有若要连续跟踪某一培养物的生长动态，可用带有侧臂的三角烧瓶作原位测定，即不必取样。侧臂的三角烧瓶作原位测定，即不必取样。2.2.生理指标法生理指标法 样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。设备来测定相应的指标。 微生物的生理指标，如氮、碳、微生物的生理指标，如氮、碳、DNA、ATP等物质等物质的含量，呼吸强度、耗氧量、酶活性、生物热等与其群的含量，呼吸强度、耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模体的规模成正相关成正相关。常用于对微生物的快速鉴定与检测常用于对微生物的快速鉴定与检测 一种特定的微生物，每一个细胞中的一种特定的微生物，每一个细胞中的ATP浓度浓度几乎是一个常数，所以测定这种微生物的几乎是一个常数，所以测定这种微生物的ATP含量，含量，即可知其细胞数。即可知其细胞数。已知细胞数的微生物样品已知细胞数的微生物样品测定测定ATP含量含量测定未知细胞数的测定未知细胞数的微生物样品的微生物样品的ATP含量含量换算出每个细胞所含的换算出每个细胞所含的ATP量量即可算出未知样中细胞数即可算出未知样中细胞数二、计繁殖数二、计繁殖数测定繁殖，一定要测定繁殖，一定要一一计算一一计算各个体的数目。各个体的数目。单细胞状态的细菌和酵母菌单细胞状态的细菌和酵母菌放线菌和霉菌等丝状生长的微生物放线菌和霉菌等丝状生长的微生物计算其计算其孢子孢子数数计算计算细胞个体细胞个体的数目的数目link1（一）（一）计繁殖数直接法计繁殖数直接法（二）（二）计繁殖数间接法计繁殖数间接法（一）计繁殖数直接法（一）计繁殖数直接法 1. 计数板直接计数法计数板直接计数法 指采用指采用计数板计数板（细菌计数板细菌计数板或或血球计数板血球计数板），），在光学显微镜下直接观察微生物细胞并进行计数的在光学显微镜下直接观察微生物细胞并进行计数的方法。方法。 （计算一定容积里样品中微生物的数量）（计算一定容积里样品中微生物的数量）21采用血球计数板测定细胞个数采用血球计数板测定细胞个数22缺点：缺点：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察个体小的细菌在显微镜下难以观察；2. 染色后活菌计数法染色后活菌计数法 采用特定的染色技术进行采用特定的染色技术进行活菌染色活菌染色，然后用光学显，然后用光学显微镜计数的方法。可分别对活菌和死菌进行计数。微镜计数的方法。可分别对活菌和死菌进行计数。例：美蓝例：美蓝 酵母酵母 活细胞活细胞无无色色 死细胞死细胞蓝蓝色色Eg. 细菌经吖啶橙染色后，在紫外光显微镜下可观察细菌经吖啶橙染色后，在紫外光显微镜下可观察活细胞活细胞橙色荧光橙色荧光死细胞死细胞绿色荧光绿色荧光 将已知颗粒浓度的样品（例如血液）与待测细胞将已知颗粒浓度的样品（例如血液）与待测细胞细胞浓度的样品混匀后在显微镜下根据二者之间的比细胞浓度的样品混匀后在显微镜下根据二者之间的比例直接推算待测微生物细胞浓度。例直接推算待测微生物细胞浓度。4. 过滤计数法过滤计数法 当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、海水或饮用水等样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上染色，并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上（或一定面积中）的细菌数。（或一定面积中）的细菌数。3. 比例计数法比例计数法（二）计繁殖数间接法（二）计繁殖数间接法 是一种是一种活菌计数法活菌计数法，这是一种依据活菌在，这是一种依据活菌在液体培液体培养基养基中会使其变混或在中会使其变混或在固体培养基固体培养基上（内）形成菌落的上（内）形成菌落的原理而设计。原理而设计。最常用的是最常用的是菌落计数法菌落计数法（colony-counting methods）。）。1. 平板菌落计数法平板菌落计数法 可用可用浇注平板浇注平板（pour plate）或或涂布平板涂布平板（spread plate）等方法进行。此法适用于各种等方法进行。此法适用于各种好氧菌好氧菌或或厌氧菌厌氧菌。采用培养平板计数法要求操作熟练、准确，采用培养平板计数法要求操作熟练、准确，否则难以得到正确的结果。否则难以得到正确的结果。样品充分混匀；样品充分混匀；每支移液管及涂布棒只能接触每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液；一个稀释度的菌液；同一稀释度三个以上重复同一稀释度三个以上重复,取取平均值；平均值；每个平板上的菌落数目合适，每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数；便于准确计数；一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用一般用菌落形成单位菌落形成单位（colony forming units， CFU）来表示，来表示，而不是直接表示为细胞数。而不是直接表示为细胞数。 根据每皿上形成的根据每皿上形成的CFU数乘上稀释度可推算出菌数乘上稀释度可推算出菌样的含菌数。此方法最为常用，但操作较繁琐且要求样的含菌数。此方法最为常用，但操作较繁琐且要求操作者技术熟练操作者技术熟练缺点。缺点。 国外出现了微型、快速、商品化的用于菌国外出现了微型、快速、商品化的用于菌落计数的落计数的小型纸片小型纸片或或密封琼脂板密封琼脂板。原理是利。原理是利用加在培养基中的用加在培养基中的活菌指示剂活菌指示剂TTC（2，3，5氯化三苯基四氮唑），氯化三苯基四氮唑），它可使菌落在很微小是它可使菌落在很微小是就染成易于辨认的玫瑰色。就染成易于辨认的玫瑰色。2. 膜过滤培养菌落计数法膜过滤培养菌落计数法 当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器，然后将将膜转到相应的培或饮用水等样品通过膜过滤器，然后将将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计。养基上进行培养，对形成的菌落进行统计。3. 厌氧菌的菌落计数法厌氧菌的菌落计数法 一般可用一般可用亨盖特滚管培养法亨盖特滚管培养法进行。此法进行。此法设备较复杂，技术难度很高。设备较复杂，技术难度很高。 简便快速的简便快速的半固体深层琼脂法半固体深层琼脂法，可测定，可测定双歧杆双歧杆菌菌（bifidobacteria）和和乳酸菌乳酸菌（lactic acid bacteria）等厌氧菌活菌数。等厌氧菌活菌数。原理：原理： 试管中的深层半固体琼脂有良好的厌氧性能，并试管中的深层半固体琼脂有良好的厌氧性能，并利用其凝固前可作稀释用，凝固后又可代替琼脂平板利用其凝固前可作稀释用，凝固后又可代替琼脂平板作菌落计数用的良好性能。作菌落计数用的良好性能。兼有省工、省料、省设备和菌落易辩认等优点！兼有省工、省料、省设备和菌落易辩认等优点！