角化细胞培养研究进展提纲KC来源及分化过程KC的作用KC培养方法滋养层细胞培养无滋养层细胞培养影响KC培养的的因素霍乱毒素(CT)、表皮生长因子(EGF)和钙离子(Ca2+)一、KC来源及分化过程KC来源及分化过程皮肤主要由表皮和真皮组成，中间由基底膜隔开；表皮由上至下分别为角质层、颗粒层、棘层和基底层；KC主要来源于基底层。1.皮肤结构和KC来源KC来源及分化过程表皮干细胞定向祖细胞终末分化KC凋亡KC10-14d干细胞含量较少，通常处于静息状态，分裂缓慢，短时间获取大量干细胞难度大；而定向祖细胞具有分化潜能且分裂较快的优点。桥粒和角化包膜形成2.KC分化过程二、KC的作用KC的抗菌作用1. KC通过PRR识别病原体Kollisch等 (2005)用 RT-PCR方法发现KC可表达不同的TLR亚型。PGN、poly (I:C)和flagelli可 分 别 与 KC的 TLR2、TLR3和TLR5结合，从不同程度刺激KC分泌IL-8说明KC可通过TLR识别细菌上的病原相关分子模式(PAMP)，分泌IL-8等物质清除病原体。KC的抗菌作用2. KC分泌AMP杀灭病原体Glaser等(2005)用抗菌测试 试 验 发 现 抗 菌 肽S100A7可特异性的杀死大肠杆菌。ONG等(2005)研究发现LL-37能有效杀灭葡萄球菌。KC在抵抗外来微生物入侵中的另一个重要作用是产生大量的AMP。阳离子抗菌肽主要有LL-37、防御素和S100蛋白家族(Harder and Schroder, 2005)。三、KC的培养方法KC培养最早始于1967年(Briggaman等，1967) ，随后人们陆续培养出鼠(Marvin等，1971)、兔(Liu等，1978)和狗(Wilkinson等，1987)等的KC。使用的培养方法包括滋养层培养法和无滋养层培养法。滋养层细胞培养1.以以3T3细胞作胞作为滋养滋养层 1975年，Rheinwald等首次成功地在体外连续培养人正常KC。 他们把射线灭活的鼠3T3细胞作为滋养层，将胰蛋白酶消化后的单个KC接种于其上，发现KC能明显抑制3T3细胞，且自身生长良好，并将3T3滋养层细胞不断推至培养皿边缘。图中红色为KC，蓝色为3T3细胞滋养层细胞培养1.以以3T3细胞作胞作为滋养滋养层Alain等(1986)用3T3滋养层培养法成功培养了人头皮毛囊KC。5d18d滋养层细胞培养2.以成以成纤维细胞作胞作为滋养滋养层Alain等(1989)首先介绍了用自体成纤维细胞代替3T3细胞作为滋养层，成功培养了人头皮毛囊KC。真皮成纤维细胞 丝裂霉素C或射线有丝分裂后细胞成纤维细胞滋养层KC接种6d3weeks滋养层细胞培养优点：细胞接种密度低、增殖速度较快、细胞生长稳定；而且灭活的3T3细胞自身无生长能力，有利于接种的KC生长增殖。弊端：一反面可能会造成KC和3T3细胞的混合污染，另一方面存在着将3T3细胞DNA遗传信息整合入增殖的KC内的危险。无滋养层细胞培养Wilkinson等(1987)率先用无滋养层方法成功分离培养了狗KC。皮肤组织分离酶4孵育18h表皮KC培养、传代20孵育45min特定培养基吸管吹吸无滋养层细胞培养Hager等(1999)用无滋养层方法成功分离培养了小鼠KC，并将其传至第19代，但只有前10代细胞具有分化能力。真皮胶原酶纱布过滤、离心混合细胞成纤维细胞成纤维细胞条件培养基HCMEMEM.06EMEM.06(1:1)KC培养基无滋养层细胞培养Caldelari等(2000)在Wilkinson方法基础上成功分离培养了17.5d小鼠胚胎KC，并在传至第61代依然保持分化活性。17.5d小鼠胚胎皮肤分离酶 defined keratinocyte-SFM表皮KC培养、传代剪碎胰酶消化defined keratinocyte-SFM提 高 Ca2+浓 度 后 ， Keratin和 E-cadherin表达呈阳性，且浆膜外形成排列紧密的角蛋白网络，细胞间形成稳定的连接结构，说明细胞仍保持分化活力。无滋养层细胞培养有学者认为无滋养层培养的细胞缺少分化标记物(中间丝蛋白、张力原纤维和桥粒)的表达(Prignano等，1999)；小鼠KC在培养30代后会出现非整倍型染色体。四、影响KC培养的因素人为因素接种密度、传代时间培养基无血清培养基、霍乱毒素(CT)、表皮生长因子(EGF)和钙离子(Ca2+)影响KC培养的因素1.霍乱毒素霍乱毒素(CT)CT是分子量为8400D的蛋白质，由A和B两个亚基组成。B亚基可将腺苷酸环化酶结合到细胞表面，A亚基可激活腺苷酸环化酶。Green(1978)发现浓度为10-11-10-9M的CT均可有效促进细胞生长。影响KC培养的因素1.霍乱毒素霍乱毒素(CT)说明当细胞密度较低时，CT可提高cAMP浓度并促进细胞增殖；当细胞密度增高时，CT可降低cAMP浓度，从而抑制高密度细胞生长。 Natsuko等(1982)细胞密度较低时，CT可促进DNA和蛋白质合成；细胞密度增加后，CT抑制DNA和蛋白质合成向培养基中加入浓度范围为10-14-10-8M的CT后6h，可成百倍的提高胞内cAMP浓度。影响KC培养的因素2.表皮生表皮生长因子因子(EGF)EGF是分子量为6045D的多聚肽，最先由Cohen(1962)从鼠颌下腺中分离，并发现其具有促进新生小鼠表皮生长和成熟的作用。Rheinwald等(1977)将EGF加入KC培养基后发现，EGF不仅可以促进KC生长，还能增加其寿命。影响KC培养的因素2.表皮生表皮生长因子因子(EGF)Wilkinson等(1987)也发现EGF可促进狗KC增殖，而且EGF和CT具有协同效应。影响KC培养的因素2.表皮生表皮生长因子因子(EGF)Miguel等(2001)的发现说明EGF主要通过提高端粒酶的活性来延缓细胞衰老。细胞每次分裂，端粒会缩短一点，当端粒消耗完之后，细胞便会凋亡；而端粒酶可阻止端粒缩短，也就是说端粒酶可延缓细胞凋亡。影响KC培养的因素3.钙离子离子(Ca2+)Hennings等(1980)发现在低Ca2+浓 度 (0.09mM)中 ， KC以单层形式聚合，并形成“铺路石”样；在高Ca2+浓度(1.14mM)中时，KC会向垂直方向角化并形成4-5层细胞，随后从培养皿上脱落，接种后5d，增殖细胞比例不到60%。0.09mMKC增殖1.14mMKC已分化最先被发现生长受到钙离子影响的细胞是鼠3T3细胞(Boynton等，1974)和人WI-38成纤维细胞(Boynton等，1977) 。作者发现，当钙离子浓度低于0.5mM时，这两种细胞生长均受到抑制。影响KC培养的因素3.钙离子离子(Ca2+)Ca2+浓度小于0.3mM时，细胞数量增多；大于0.3mM时，细胞数量减少。Ca2+浓度小于0.3mM时，含有角化包膜细胞比例较少；大于0.3mM时，含有角化包膜细胞比例增多。说明Ca2+浓度大于0.3mM时，Ca2+会抑制细胞增殖并促进细胞分化。Steven,等(1983)影响KC培养的因素3.钙离子离子(Ca2+)1，25-D3可通过诱导PLC-1表达来促进involucrin和 transglutaminase表达1，25-D3可通过诱导PLC-1表达来提升胞内Ca2+浓度。说明1，25-D3可通过诱导PLC-1表达来提升胞内Ca2+浓度，最后促进involucrin和 transglutaminase表达，引起细胞分化。Xie,等(2001）影响KC培养的因素霍乱毒素(CT) 当细胞密度较低时，CT可提高cAMP浓度并促进细胞增殖；当细胞密度增高时，CT可降低cAMP浓度，从而抑制高密度细胞生长。表皮生长因子(EGF)EGF主要通过提高端粒酶的活性来延缓细胞衰老。钙离子(Ca2+)1，25-D3可通过诱导PLC-1表达来提升胞内Ca2+浓度，最后促进involucrin和 transglutaminase表达，引起细胞分化。谢谢！