一、分光光度法的特点一、分光光度法的特点二、可见二、可见(kjin)(kjin)分光光度法与紫外分光光度法与紫外的区别的区别三、分光光度计测定物质含量的原理三、分光光度计测定物质含量的原理四、工作曲线法测定芦丁含量四、工作曲线法测定芦丁含量五、本次实验注意事项五、本次实验注意事项六、仪器的操作六、仪器的操作内容内容(nirng)(nirng)第1页/共17页第一页，共18页。 分光光度法与其他测定方法比较有这样一些特点1、首先，它的应用广泛，在国际上发表的有关分析的论文总数中，分光光度法占28%，我国约占所发表论文总数的33%。2、灵敏度高，由于新的显色剂大量合成，并在应用研究方面取得了重要进展，使得测定物质的灵敏度提高。3、选择性好，目前有些(yuxi)元素只要控制适当的显色条件就可以直接进行光度法测定。4、准确度高，浓度测量的相对误差在13%范围5、分析成本低，操作简便快速。分光光度法的特点（包括分光光度法的特点（包括(boku)紫外和紫外和可见）可见）第2页/共17页第二页，共18页。可见分光可见分光(fn un)光度法与紫外的区别：光度法与紫外的区别：1、光源不同，紫外用氢灯作光源，可见用钨灯、光源不同，紫外用氢灯作光源，可见用钨灯 2、测定波长不同，紫外波长范围、测定波长不同，紫外波长范围180350nm 可见波长范围可见波长范围32010003、可见需显色，紫外不需显色、可见需显色，紫外不需显色 可见分光光度测定中通常是被测物质与显可见分光光度测定中通常是被测物质与显色剂反应，生成有色物质，然后测定其吸光度，色剂反应，生成有色物质，然后测定其吸光度，进而进而(jn r)求得被测物质的含量。求得被测物质的含量。第3页/共17页第三页，共18页。分光光度计测定物质含量的原理：分光光度计测定物质含量的原理： （紫外与可见基本相同）（紫外与可见基本相同）均采用一个能产生均采用一个能产生(chnshng)(chnshng)多个波长的光源，通过系列分光装置后产生多个波长的光源，通过系列分光装置后产生(chnshng)(chnshng)特定波长的光源，其透过被测特定波长的光源，其透过被测 样品后，部分光源被样品后，部分光源被 吸收，计算样品吸光吸收，计算样品吸光 值，由比尔值，由比尔- -朗白定律朗白定律 求得样品的浓度。求得样品的浓度。第4页/共17页第四页，共18页。一、实验一、实验(shyn)目的目的（1）掌握可见分光光度计的使用（2）掌握光电比色的一般操作(cozu)。（3）学会用作图法及计算器回归法求芦丁样品的浓度工作工作(gngzu)曲线法测定芦丁含曲线法测定芦丁含量量第5页/共17页第五页，共18页。芦丁又名芸香甙，维生素芦丁又名芸香甙，维生素P，属黄酮类化合物，临床主要用于治疗脑溢血，高血压，视网，属黄酮类化合物，临床主要用于治疗脑溢血，高血压，视网膜出血等疾病。膜出血等疾病。黄酮类化合物的结构性质黄酮类化合物的结构性质结构中含有酚羟基结构中含有酚羟基(qingj)和环酮基结构，可与某些金属盐试剂生成有色络合物，在和环酮基结构，可与某些金属盐试剂生成有色络合物，在510nm波长波长 处有吸收，用可见分光光度计测处有吸收，用可见分光光度计测 其含量。其含量。本实验利用黄酮甙与亚硝酸钠、本实验利用黄酮甙与亚硝酸钠、 硝酸铝反应在碱性时显红色的硝酸铝反应在碱性时显红色的 反应测定芦丁的含量。反应测定芦丁的含量。二、实验二、实验(shyn)原理原理第6页/共17页第六页，共18页。 1 显色反应的完全程度（取决于）：介质(jizh)的pH显色剂的用量反应温度反应时间要使得测定要使得测定(cdng)浓度准确浓度准确应当考虑影响测定应当考虑影响测定(cdng)准确的因素：准确的因素： 2 吸光度(gungd)的物理测定条件第7页/共17页第七页，共18页。如何确定反应最佳条件如何确定反应最佳条件在建立方法时，需要通过实验确定最佳反在建立方法时，需要通过实验确定最佳反应条件，为此改变其中一个因素（例如应条件，为此改变其中一个因素（例如(lr)(lr)介质的介质的pHpH值暂时固定其他因素，显值暂时固定其他因素，显色后测量相应溶液的吸光值，通过吸光度色后测量相应溶液的吸光值，通过吸光度-pH-pH曲线确定反应的酸度范围，其他几个曲线确定反应的酸度范围，其他几个影响因素的适宜值也可以按这一方法分别影响因素的适宜值也可以按这一方法分别确定。确定。第8页/共17页第八页，共18页。三、实验三、实验(shyn)内容内容仪器 光电分光比色计 使用方法见附件 比色皿的校核 将同样厚度的四个比色皿分别编号标记，都装空白溶液，在所用波长（510nm）下比较各比色皿的透光率，应相同，若有显著差异，应将比色皿重新洗涤后再装空白溶液测试，经洗涤可使透光率的差异减小时，可通过多次洗涤使透光率一致。 若经几次洗，仍然不一致可如下校正：以透光率最大的比色皿为100%透光，测定其余各皿的透光率，分别换算成吸收度作为各比色皿的校正值(zhn zh)。测定溶液时，以上述100%透光率的比色皿作空白，用其他各皿装溶液，测得吸收度值然后碱去所用比色皿的校正值(zhn zh)。第9页/共17页第九页，共18页。芦丁的测定（标准曲线制备与芦丁测定一起完成）芦丁的测定（标准曲线制备与芦丁测定一起完成）精密移取芦丁标准溶液精密移取芦丁标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml和样品液和样品液3.0ml置置10ml容量瓶中容量瓶中各加各加30%乙乙醇醇(y chn)使成使成5.0ml各精密加入亚硝酸钠溶液各精密加入亚硝酸钠溶液（120）0.3ml，摇匀，放置，摇匀，放置6分钟分钟各加硝酸铝各加硝酸铝（120）0.3ml，摇匀，再放置，摇匀，再放置6分钟分钟各加氢氧各加氢氧化钠试液化钠试液4ml,用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，放置用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，放置15分钟。分钟。在在510nm波长下测定各瓶溶液的吸收度（以第一瓶作波长下测定各瓶溶液的吸收度（以第一瓶作空白）以浓度为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标空白）以浓度为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线。测定样品的浓度。准曲线。测定样品的浓度。第10页/共17页第十页，共18页。芦丁芦丁(l dn)的测定各试剂用量的测定各试剂用量编号编号1234567标准溶液(ml)01.002.003.004.005.00样品溶液(ml)3.0030%乙醇(ml)5.004.003.002.001.002.00NaNO2(ml)都加0.30ml，摇匀后放置6分钟Al(NO3)3(ml)都加0.30ml，摇匀后放置6分钟NaOH(ml)都加4ml，摇匀后放置15分钟后在510nm条件下测定A第11页/共17页第十一页，共18页。结果1、列出浓度C与吸光度A对应表格2、用作图法绘制芦丁(l dn)工作标准曲线3、用计算器回归求标准曲线方程A=(a)C+( b), 要求r=0.998以上4、从图中读出芦丁(l dn)的浓度,并计算瓶中芦丁(l dn)样品的浓度5、计算器回归求芦丁(l dn)样品的浓度并计算瓶中芦丁(l dn)样品的浓度。第12页/共17页第十二页，共18页。注意事项注意事项移液管，容量瓶的正确使用移液管，容量瓶的正确使用NaOH每吸一次可以放两个，比色杯不要甩每吸一次可以放两个，比色杯不要甩容量瓶易翻倒，注意放好容量瓶易翻倒，注意放好注意放的时间注意放的时间NaNO2加加0.3ml，不是，不是0.03ml标准浓度（看黑板），各浓度要计算标准浓度（看黑板），各浓度要计算蒸馏水要加至刻度后摇蒸馏水要加至刻度后摇(用滴管用滴管(d un)，容量瓶拿在手上看刻度，容量瓶拿在手上看刻度浓度的测定，以浓度的测定，以1号为空白，从低浓度至高浓度来测号为空白，从低浓度至高浓度来测数据当场交，报告回去做数据当场交，报告回去做第13页/共17页第十三页，共18页。四、思考题 相同厚度的各比色皿透光性不一致时，为什么要在经过多次洗涤后各皿透光率差异无改变下才使用(shyng)校正值？工作曲线法和标准对比法分别适用何种情况？从本实验结果看，能否用标准对比法？第14页/共17页第十四页，共18页。仪器仪器(yq)的操作的操作1、预热： 仪器开机后灯及电子部分需热平衡，故开机预热30分钟后才能进行测定工作2、调零：目的：校正基本读数标尺两端(lin dun)（配合100%T调节）进入正确测试状态调整时机：开机预热30分钟后，改变波长或测试一段时间，以及做高精度测试之前 操作： 将拉杆拉出半格（或打开盖子）遮断光路，然后按“0%”键，即能自动调整零位3、调整100%：目的：校正基本读数标尺两端(lin dun)（配合调零）进入正确测试状态调整时机：同上操作： 空白样品置入样品室光路中，盖下盖子（打开光门）然后按“100%T”键，即能自动调整100%。4、调波长：用、箭头调节波长，调至所需波长第15页/共17页第十五页，共18页。标准曲线：一份称样量，但是可以定量很宽的线性范围；中间可能存在的误差 -称样时引入的误差标准对照法：2份或者2份以上的称样量，只能定量90-110%的含量(hnling)，且不能存在较大的截距 第16页/共17页第十六页，共18页。感谢您的欣赏(xnshng)！第17页/共17页第十七页，共18页。内容(nirng)总结一、分光光度法的特点二、可见分光光度法与紫外的区别三、分光光度计测定物质含量的原理四、工作曲线法测定芦丁含量五、本次实验注意事项六、仪器的操作。3、可见需显色，紫外不需显色。Al(NO3)3(ml)。都加4ml，摇匀后放置15分钟后在510nm条件下测定A。3、用计算器回归(hugu)求标准曲线方程A=(a)C+( b),。蒸馏水要加至刻度后摇(用滴管)，容量瓶拿在手上看刻度。第16页/共17页。感谢您的欣赏第十八页，共18页。