第七章 遗传毒物与细胞死亡 12024/7/27第一节 细胞凋亡与非凋亡性死亡第二节 细胞凋亡概论第三节 遗传毒物诱导细胞凋亡的信号及其转导通路第四节 细胞凋亡信号转导通路的负调控机制第五节 细胞的非凋亡性死亡第六节 细胞凋亡的生物学特征及其检测22024/7/27第一节 细胞凋亡与非凋亡性死亡3细胞死亡是生物界普遍存在的现象，不同于机体死亡。正常组织中，每天都有千千万万个细胞死亡。细胞死亡的方式通常有2种：细胞坏死（necrosis）细胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）2024/7/272024/7/2741 1、细胞坏死（、细胞坏死（necrosisnecrosis）概念：细胞坏死是由于有害刺激或细胞内环境的严重紊乱导致细胞急剧死亡。主要形态学特征：细胞发生肿胀，最后导致细胞膜破裂和溶解，细胞内前炎症因子等内容物释放，引起严重的炎症反应。细胞坏死现象与人类多种疾病相关。如病毒感染引起的急性重型肝细胞坏死，青光眼导致神经细胞坏死，造成视力逐渐减弱，最终导致失明。52 2、细胞凋亡（、细胞凋亡（apoptosisapoptosis）细胞凋亡(apoptosis)也称细胞程序性死亡( programmed cell death，PCD)则是由于细胞内外因子诱发的细胞内一个特殊的蛋白酶级联反应而发生的有序死亡。诱发因素：体外因素，细胞处于不利生长环境，如温度、pH、射线、药物和病毒感染等；体内因素，如肿瘤、自身免疫病和退行性病变等；生理因素：胚胎发育和变态过程也可产生细胞凋亡。形态特征：细胞皱缩、染色质浓缩和出现凋亡小体，细胞膜完整、无前炎症因子等细胞内容物流出，无炎症反应。2024/7/27ApoptosisversusNecrosis2024/7/2767 特征特征 细胞凋亡细胞凋亡 细胞坏死细胞坏死定义定义在形态学上表现为细胞皱缩，核碎在形态学上表现为细胞皱缩，核碎裂、胞浆生芽和形成凋亡小体裂、胞浆生芽和形成凋亡小体为为病病理理性性袭袭击击的的结结果果，质质膜膜的的完完整整性性突突然然消消失、膜电化学梯度消失和细胞内容物释出失、膜电化学梯度消失和细胞内容物释出 诱发刺激诱发刺激 生理性或病理性生理性或病理性 病理性病理性 形态表现形态表现 成泡成泡 有（细胞器呈泡状）有（细胞器呈泡状） 有（无细胞器呈泡状）有（无细胞器呈泡状） 质膜完整性质膜完整性 保持保持 破损破损 细胞大小细胞大小缩小缩小细胞皱缩和形成凋亡小体细胞皱缩和形成凋亡小体 增大增大细胞肿胀并溶解细胞肿胀并溶解 炎症反应炎症反应 无无 有有 细胞内容释出细胞内容释出 不不 是是 生化表现生化表现 大分子（蛋白大分子（蛋白质）合成质）合成 有些情况下必需有些情况下必需 非必需非必需 基因表达基因表达 有些情况下必需有些情况下必需非随机裂解为非随机裂解为5050、300kb300kb，随后再裂，随后再裂 非必需非必需 DNA DNA裂解裂解 解解为为180bp180bp为为倍倍数数的的碎碎片片（大大小小由由涉及的核小体数决定）涉及的核小体数决定） 随机裂解随机裂解 调控调控 高度受控高度受控 不受调控不受调控 半胱天冬半胱天冬酶酶级联反应级联反应 必需必需 非必需非必需细胞凋亡和细胞坏死的比较细胞凋亡和细胞坏死的比较2024/7/272024/7/2783 3、细胞凋亡的生物学意义、细胞凋亡的生物学意义细胞凋亡的生理意义：细胞凋亡对于保证个体正常发育、维持正常生理功能，并使机体适应内外环境的变化具有重要的生理意义。细胞凋亡是基因调控的主动过程，典型的细胞凋亡过程涉及一系列半胱天冬蛋白酶（caspase）的水解、活化和信号传递过程。在发育过程中清除多余的细胞在发育过程中清除多余的细胞清除已完成功能的细胞清除已完成功能的细胞 清除发育不正常的细胞清除发育不正常的细胞清除正常生理活动过程中无用的细胞清除正常生理活动过程中无用的细胞清除病理活动中有潜在危险的细胞清除病理活动中有潜在危险的细胞2024/7/2792024/7/27104 4、细胞凋亡的病理意义、细胞凋亡的病理意义细胞凋亡调节失控或错误将会引起生物体的发育异常、功能紊乱和严重疾病。与细胞凋亡相关的疾病如滤泡性淋巴瘤、乳腺癌和白血病等恶性肿瘤，系统性红斑狼疮和肾炎等自身免疫性疾病，腺病毒和疱疹病毒感染的疾病等，均与细胞凋亡缺陷（“该死不死”）有关；而阿尔茨海默病、帕金森氏病和小脑退化症等神经退行性疾病、骨髓发育不全性疾病、缺血性损伤和酒精中毒性肝炎等则与细胞凋亡过度（“不该死的死了”）有关。第二节 细胞凋亡概论凋亡过程的执行器(executor)为细胞中的蛋白酶，不论何种因素诱发的细胞凋亡，虽其具体的信号通路有别，但最终无例外都是激发以蛋白酶组成的级联反应这个中心环节。2024/7/2711接受凋亡信号接受凋亡信号凋亡的级联反应凋亡的级联反应凋亡调控分子间的相凋亡调控分子间的相互作用互作用蛋白水解酶（蛋白水解酶（caspasescaspases）的活化）的活化12半胱天冬酶Caspase(Cysteinyl aspartate-specific protease)： 在特异的天冬氨酸之后切割靶蛋白的一类进化上保守的半胱氨酸蛋白酶。一、半胱天冬酶（一、半胱天冬酶（CaspaseCaspase）是凋亡的执行者）是凋亡的执行者半胱天冬酶家族有十余个成员，是凋亡过程中最重要的影响因素之一，但不同成员在凋亡中起的作用不全相同。2024/7/27131、Caspase通常以酶原（Procaspase）形式存在，相对分子质量为29-49kD。2、酶原N末端具有一个前功能域（Prodomain）、一个大亚单位（约20kD）和一个C末端小亚单位（约10kD）。3、在大、小亚单位保守的QACXG基序（motif）中有半胱氨酸活性部位（X=R、Q或G），其中C是必需的。前功能域与大亚单位由一天冬氨酸裂解部位分开，大、小亚单位由接头隔开，接头位于大、小亚单位的含有一或两个天冬氨酸裂解部位的功能域之间。4、活性形式为杂四聚体（p17-20）2（p10-12）2二、二、CaspaseCaspase家族特征家族特征2024/7/27根据在细胞凋亡中起的作用，Caspases分为两大类：启始Caspase(Initiator)和效应Caspase(Effector)1）启始Caspases包括-2，-8，-9，-10等，对细胞凋亡的刺激信号作出反应，启动细胞的凋亡过程；2）效应Caspases包括-3，-6，-7等，是在细胞凋亡过程中的具体执行者，完成对特定蛋白底物的水解。半胱天冬酶的功能取决于半胱天冬酶的底物特异性、前功能域的长度和序列。三、三、CaspasesCaspases的分类的分类2024/7/2715哺乳类细胞内的哺乳类细胞内的哺乳类细胞内的哺乳类细胞内的CaspasesCaspasesCaspasesCaspases的一级结构的一级结构的一级结构的一级结构2024/7/2716按催化特异性分：按催化特异性分：组别组别催化感应催化感应序列序列成员成员活性中心活性中心前区域前区域特异催化位点特异催化位点 I WEHDCaspase-1 Caspase-4 Caspase-5QACRG QACRG QACRG P12 P12 P12WEHD(WL)EHD(WL)EHD II DEXDCaspase-2 Caspase-3 Caspase-7QACRG QACRG QACRG P17 P2 P2DEHDDEVDDEVD III (I/V/L)EXDCaspase-8 Caspase-9 Caspase-10Caspase-6QACRG QACGG QACQGQACRG P27 P19 P27 P2IETDLEHDLE(N/L/E)DVEHD2024/7/2717Caspase活化机制：活化机制： Caspase的活化是有顺序的多步水解的过程，虽然分子各异，但是它们活化的过程相似。首先在caspase前体的N-端前肽和大亚基之间的特定位点被水解去除N-端前肽，然后再在大小亚基之间切割释放大小亚基，并进而形成两两组成的有活性的四聚体。四、四、Caspase Caspase 激活的方式激活的方式2024/7/27182024/7/2719半胱天冬酶级联反应半胱天冬酶级联反应1 1、启始、启始CaspaseCaspase激活（同源激活）的两种典型方式激活（同源激活）的两种典型方式 ：（1 1）Caspase-8Caspase-8的激活的激活 (Caspases-2, -10)(Caspases-2, -10) 死亡受体（Fas或TNFR）与死亡配体（ FasL或TNF）结合后，死亡受体三聚体化。 通过死亡结构域DD（Death domain）的蛋白质-蛋白质相互作用，死亡受体与接头蛋白的DD结合Fas结合蛋白FADD（Fas-associated death domain）结合，形成死亡诱导信号复合物DISC（Death-inducing signalling complex）。 通过FADD的死亡效应结构域(DED(Death effector domain)，Procaspase-8 被募集在DISC上。 聚集后的Procaspase-8，通过自身或相互之间的切割产生成熟的Caspase-8。2024/7/2720Procaspase-8 的激活过程的激活过程2024/7/2721（2 2）Caspase-9Caspase-9的激活的激活l细胞色素c（Cytochrome c）从线粒体释放。l通过凋亡蛋白酶活化因子Apaf-1 (Apoptotic protease activating factor-1)的WD40结构域，细胞色素c和Apaf-1结合。l通过Apaf-1的半胱天冬酶募集功能域CARD（Caspase activation and recruitment domain）结构域，Apaf-1形成七聚体。l通过各自的CARD结构域，Procaspase-9被募集到细胞色素c/dATP/Apaf-1组成的凋亡复合体（Apoptosome）而水解激活。2 2、效应、效应CaspaseCaspase的激活（异源激活）的激活（异源激活） 效应Caspases不象启始Caspases ，不能被募集到或结合到DISC或凋亡复合体上，它们必须依赖启始Caspases才能活化。2024/7/2722Caspase-9Caspase-9的激活过程的激活过程2024/7/272324 底物底物类别类别 预计功能预计功能 底物举例底物举例促一和抗凋亡蛋白信号放大抑制因子激活作用前一半胱天冬酶，BCL-2，BCL-XL，BID，P28Bap31凋亡机器成员诱发凋亡表型半胱天冬酶激活脱氧核糖核酸酶抑制因子(ICAD)、肌动蛋白、胶溶蛋白(gelsolin)、P21激活的激酶-2(PAK2)，丝裂原激活的蛋白激酶-细胞外信号调节激酶的激酶-1(MEKKl)、蛋白激酶C(PKC)结构蛋白和结合分子细胞完整性解体细胞包装核纤层蛋白、核有丝分裂器蛋白(nuclearmitoticapparatusprotein)、支架附着因子-A(scaffoldattachmentfactor-A)、胞衬蛋白(fodrin)、Gas2生成停顿特异基因-2(growtharrestspecificgene-2)编码蛋白、角蛋白、肌动蛋白、rabaptin-5，p-连环蛋白，黏着斑激酶(focaladhesionkinase，FAK)稳态蛋白破坏大分子合成和细胞修复机制DNA-依存性蛋白激酶酶促亚单位(DNAdependentproteinkinase catalyticsubunit DNA-PKcs)、多聚（ADP -核糖）聚合酶 poly( ADP-ri-bose)polymerase，PARP、U1-70-kDa蛋白、复制因子C(replicationfactorC，RFC-140)、不均一核核糖核蛋白(HnRNP)、D4-GDP解离抑制因子(GDPdissociationinhibitor，GDI)、转录因子终止存活信号其他不明？凋亡诱导Huntingtin蛋白、早老蛋白(presenilin)、萎缩索-1（atrophin-1），ataxin-3，胞浆磷脂酶A2五、五、CaspasesCaspases的底物的底物2024/7/272024/7/2725半胱天冬酶是凋亡执行器的中心组成成分半胱天冬酶是凋亡执行器的中心组成成分2024/7/2726第三节 遗传毒物诱导细胞凋亡的信号及其转导通路一、P53蛋白介导的细胞凋亡二、经第二信使神经酰胺介导的细胞凋亡三、经应激信号触发的细胞凋亡四、经死亡受体触发凋亡的信号通路五、钙过荷诱发的细胞凋亡六、线粒体触发细胞凋亡及其对死亡信号整合作用七、MYC与细胞凋亡促进细胞凋亡促进细胞凋亡抑制细胞凋亡抑制细胞凋亡bax ,bcl-xsbax ,bcl-xsbcl-2, bcl-xlbcl-2, bcl-xl野生型野生型p53p53突变型突变型p53p53FAS/Apo-1FAS/Apo-1IAPIAP（survivinsurvivin）caspasecaspaseC-mycC-myc细胞凋亡是一个多基因调控的过程1、细胞凋亡过程表达的基因 ，多数抑癌基因；2、促细胞凋亡基因，多数抑癌基因；3、抑制细胞凋亡基因，多数癌基因。 一、细胞凋亡相关基因一、细胞凋亡相关基因2024/7/27271、Bcl-2家族家族（B cell lymphoma/leukemia-2）B细胞淋巴瘤胞淋巴瘤/白血病白血病-2)Bc1-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同源物。和一般的癌基因不同，Bc1-2延长细胞的生存，能抑制细胞凋亡,而不是促进细胞的增殖。Bcl-2家族已发现15个成员，所有Bcl-2家族成员均含有1个或多个保守功能区（BH结构域）。蛋白含有4个Bcl-2同源结构域，依次命名为BHl、BH2、BH3和BH4。可分为3个亚族：2024/7/27282024/7/2729 Bcl-2亚家族家族：Bcl-2Bcl-xlBcl-w、Mcl-1、A1Bcl-2亚家族成员对细胞凋亡起抑制作用。Bax亚家族：家族：Bax、Bak、Bok，它们的作用与Bcl-2亚家族的作用相反，可促进细胞凋亡。BH3亚家族：家族：Bik、Blk、Hrk、BNIP3、Biml、Bad、Bid；仅有BH3结构域。它们的作用也与Bcl-2亚家族的作用相反，可促进细胞凋亡。作用作用机制机制：影响凋亡蛋白酶活化因子Apaf-1的功能影响线粒体的结构与功能2024/7/2730Bcl-2蛋白家族成员概况蛋白家族成员概况家族成员家族成员氨基酸数目氨基酸数目与与Bcl-2同源性同源性 分子量分子量C-疏水端疏水端调节凋亡调节凋亡Bcl-2，H239m23626有有抑制抑制Bcl-XLH233m2414426有有抑制抑制Bcl-XsH178m17018有有促进促进Baxh1922121有有促进促进BakH216/m2112823,4无无促进促进BadM204 *22,1无无促进促进AIM17240*20无无抑制抑制Mcl-1H3503537有有抑制抑制Ced-9C2782332有有抑制抑制BHRF-1v1912222有有抑制抑制LMW5-HLv1782620无无抑制抑制EIB19Kv17619无无抑制抑制2024/7/2731Bcl-2 Bcl-2 蛋白家族成员的相互作用与细胞凋亡的关系蛋白家族成员的相互作用与细胞凋亡的关系2024/7/2732家族成员家族成员可能存在的聚合体形式可能存在的聚合体形式抑制凋亡抑制凋亡bcl-2 bcl-2/bcl-2 bax/bcl-2bcl-XL bcl-XL/bcl-XL bcl-2/bcl-XLMcl-1 Mcl-1/ /bcl -XL Mcl-1/bcl-2bax Bax/bax bax/bax-XL促进凋亡促进凋亡bcl-Xs Bcl-Xs/bcl-2 bcl-Xs/bcl-XLbad Bad/bcl-2 bad/bcl-XLbak Bak/bcl-XL2024/7/27332024/7/27342 2、电压依赖性阴离子通道电压依赖性阴离子通道 （VDAC)和和腺嘌呤核腺嘌呤核苷酸转位酶苷酸转位酶(ANT) 是线粒体外膜上最为丰富的两种蛋白。最近有一些研究工作表明，WDAC和ANT可与Bc1-2家族蛋白相互作用，在细胞凋亡过程中介导对线粒体的损伤。VDAC本身是一种通道蛋白，它与Bax的结合可使共通道性能发生某种变化，这样一些凋亡蛋白如cytC就可通过。因为这两种蛋白在跨越线粒体膜的核苷酸和小分子转运中起作用，所以它们与Bax的结合可能与细胞凋亡过程中线粒体ATP/ADP转化和磷酸肌酸外运的抑制有关。 2024/7/27352024/7/27363、P53P53与细胞凋亡与细胞凋亡 P53是肿瘤抑制基因，其产物主要存在于细胞核内。P53基因是人类肿瘤有关基因中突变频率最高的基因。在依赖P53蛋白的细胞凋亡中，P53基因是通过调节Bc1-2和Bax基因的表达来影响细胞凋亡的。P53蛋白能特异地抑制Bc1-2的表达，相反对Bax的表达则有明显的促进作用。研究表明，P53蛋白是Bax基因的直接的转录活化因子。在这些细胞中，P53蛋白的积累和活动引起了细胞凋亡。2024/7/27374、IAP IAP （inhibitor of apoptosisinhibitor of apoptosis，细胞凋亡抑制，细胞凋亡抑制因子）因子） IAP超家族的成员较多，如c-IAP1,c-IAP2,XIAP, NIAP和Survivin，新的成员在不断的被发现。IAP家族成员有一个共同的特征，含有一个或多个由70个氨基酸的重复序列（BIR），类似于锌指状的结构。c-IAP1、c-IAP2和 XIAP含有环指状结构。BIR功能域和之间的连接区域介导对caspase的抑制作用，而环指状结构则具有泛素化蛋白连接酶的作用，介导caspase-和-的泛素化降解作用。 2024/7/27382024/7/27395 5、Smac/DabloSmac/Dablo 在细胞凋亡过程中它可以从线粒体释放进入细胞质。成熟的Smac蛋白产生一个新的N基端,这个N基端的前面4个氨基酸可以与lAP的BIR结构域结合。Smac的功能就是拮抗活化胱解酶9与lAP的结合。Smac与BIR2的结合可以中和XlAP对胱解酶9的抑制，促进凋亡。 2024/7/27402024/7/27416、白介素-1转换酶（interlukin1-convertingenzyme，ICE），与线虫细胞凋亡相关基因Ced-3有较高的同源性，具有直接诱导细胞凋亡的作用。7、Fas为死亡受体，Fas-L是T淋巴细胞产物，Fas和Fas-L结合诱导细胞凋亡。2024/7/27422024/7/27438、癌基因c-myc是调控细胞周期的主要基因。研究表明，c-myc 在哺乳动物的细胞凋亡中发挥作用，它的过度表达既可使细胞周期变短、分裂增加，也可使细胞凋亡，这主要取决于能否获得关键的生长因子。Cleveland认为，抑癌因素存在时，c-myc 促进凋亡，而有致癌因素时，c-myc促进增殖。Bax为Bcl-2基因家族成员，可诱导细胞凋亡。 PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10）是随P53以后呈现最高突变率的抑癌基因表达产物，它主要催化PI-3，4，5-P3的肌醇3位上去磷酸形成PI-4，5-P2，拮抗PI-3KinasePKB/Akt信号通路的抗凋亡作用。因为PKB具有磷酸化抑制Caspase 9、Bad的活性和抑制细胞色素C的释放与Fas介导的凋亡信号转导，以及通过FKHR间接抑制某些凋亡因子基因表达等作用，因此具有很强的抗凋亡作用。9 9、张力蛋白同源磷酸酯酶（、张力蛋白同源磷酸酯酶（PTENPTEN）2024/7/2744PI-4,5-PI2PI-3,4,5-P3PDKPKBPKBPTENpPI3-KpT308S470-PCytCBad-s112-pCaspase-9-s196-pFKHR-s256-pFas denpendent apoptosisApoptosis张力蛋白同源磷酸力蛋白同源磷酸酯酶（PTEN）的促）的促细胞凋亡机胞凋亡机制制2024/7/2745病 毒在感 染 宿主 细 胞 后 进行 病毒分 泌(virocrine),分泌的病毒因子中有些同源于细胞生长因子、生长因子受体或信号转导分子，促进宿主细胞增殖和转化，有些是阻止宿主细胞的凋亡防御，保护病毒的生存和免被消灭和清除。（1）CrmA（cytokineresponsemodifierA，细胞因子反应修饰因子A）。这是牛痘病毒分泌的一种 蛋 白 质 因 子 ， 分 子 量 38KD， 它 具 有 抑 制Caspase3和颗粒酶B（GranzymeB）活性而起到抗凋亡作用。10、病毒因子、病毒因子2024/7/2746（2）P35:这是由杆状病毒分泌的一种病毒因子，分子量35KD，其分子结构与BcL-2部分同源，故具有抑制凋亡的作用。（3）EIB55KD和EIB19KD:均是腺病毒分泌的病毒因子，二者可分别结合P53和FLASH而抑制细胞凋亡。FLASH是最近报道的Pro-caspase-8结合FADD的竟争性抑制分子，故有抑制Fas介导的凋亡作用）。2024/7/2747二、二、P53P53蛋白介导的细胞凋亡蛋白介导的细胞凋亡1P53基因 P53并非为所有细胞的凋亡过程所必需，但对DNA损伤而诱发的细胞凋亡却是必不可少的。（1）P53的两大功能： 使细胞在G1期停滞。当DNA由于各种原因损伤后，P53首先诱导细胞进入G1期，抑制细胞增殖，直至损伤的DNA修复。 一旦DNA不能被修复，P53就会活化那些诱导细胞凋亡的基因转录，使细胞发生凋亡。例如在P53缺乏的小鼠模型中，发现Bcl-2表达增高伴随 Bax表达降低。2024/7/2748P53GADD45结合PCNA（增殖细胞核抗原）结合RPA（复制蛋白A）TNF Fas从储存处释放出Fas FasL DR5 BaxBcl-2P21阻止DNA修复和复制细胞凋亡阻止细胞周期在G1期2024/7/2749（2）野生型P53和突变型P53对细胞凋亡的作用： 野生型P53对细胞凋亡有促进作用，突变型P53对细胞凋亡有抑制作用。目前认为野生型P53抑制Bcl-2基因的表达，促进Bax基因的表达。 而突变型P53仍保留对Bcl-2的负调控，而它自身又成为细胞凋亡的抑制者。因而，P53在调节Bcl-2依赖的细胞死亡/生存途径中发挥重要作用。2024/7/2750p53的功能的功能野生型和突变型野生型和突变型P53对细对细胞凋亡的作用胞凋亡的作用2024/7/2751P53P53与细胞凋亡与细胞凋亡2024/7/2752p53 and cellular stressinduced apoptosis各种应激刺激如细胞毒药物，-射线, 热休克，组织缺氧，DNA损伤剂可稳定抑肿瘤蛋白P53，P53促进细胞周期捕获和修复DNA或促使细胞凋亡以清除损伤细胞。但是，P53怎样选择G1期捕获或者凋亡还不太清楚。P53的脯氨酸富集区(残基64-92) 和转录激活区(残基43-63) 被认为是介导凋亡所必须，因为去除这两个区域会导致凋亡活性的丢失。2024/7/2753另一方面，磷酸化和甲基化对调节P53的生物学活性起着重要作用。虽然具体的调节机制尚不清楚，但很可能在调节P53和其负调节子Mdm2的结合方面发挥作用。另一个负调节机制涉及JNK和P53的结合，从而介导泛素化（ubiquitination）与P53蛋白水解切除。Rb蛋白能阻止P53的凋亡作用。Rb和Mdm2这两个P53抑制子在凋亡过程中均被切割，提示是程序性细胞死亡的正自我调节以及与关键细胞周期调节子的密切联系。2024/7/2754 虽然P53的作用机制尚不完全清楚，但有一点很清楚，P53的转录激活功能是其生物学作用的重要组成部分。许多P53的靶基因及其功能已被确证。 依赖于P53的细胞周期捕获需要P21Waf1,GADD45,和cyclin G的转录激活。 促凋亡的P53靶蛋白包括Bax,PIG genes,CD95,DR5(a receptor for the death ligand TRAIL),IGF-BP3,Rpr(in Drosophila),Cdc42 (a Ras-like GTPase),Noxa(a Bcl-2 familyprotein),和P53AIP1。 2024/7/2755Nuclear and Cytoplasmic Roles of p53 in Apoptosis 2024/7/2756P53诱导凋亡的机制已被广泛地研究,涉及mitochondrial Apaf-1/caspase-9途径,死亡受体信号,和下游caspases的激活。 例如,表达突变P53的细胞不能诱导CD95,对药物诱导的凋亡敏感性降低。P53能帮助CD95从Golgi转运到细胞膜，导致死亡受体的集合。但是，在某些情况下，CD95不是P53诱导凋亡所必须，P53依赖的CD95上调并不是每次都能诱导凋亡。2024/7/2757另一条P53凋亡信号通路是通过活性氧离子（ROS），影响线粒体膜功能，但并不涉及cytochrome C的释放。特别是P53诱导的基因PIG3与NADPH-quinone氧化还原酶具有同源性，产生ROS。当独自过表达时，PIG3不能激发凋亡，提示其他的信号在同时起作用。最近的研究显示P53自身能在 E1A/ras-transformed的纤维原细胞而不是正常纤维原细胞的提取物中诱导caspase激活,并且不依赖Bax或cytochrome C的转录或存在。2024/7/2758P53也能与c-myc作用，影响c-myc诱导的细胞凋亡。另一P53促进凋亡的机制是通过激活Ras-相似的GTPase Cdc42，激活JNK-1诱导的Bcl-2磷酸化。总之，P53介导或涉及P53的凋亡包括一系列不同分子和通路的平行或连续激活，最终导致完全的死亡反应。2024/7/27592 2、P53P53基因家族的其他成员基因家族的其他成员（1）P73基因是P53基因家族发现的第一个新成员。P73是P53基因家族的成员。P73基因在神经母细胞瘤、结肠癌、恶性黑色素瘤、肝细胞癌、乳腺癌等多种肿瘤发生缺失的频率极高。（2）P51基因是P53基因家族发现的又一新成员。 P51在正常组织的表达远低于P53的水平，同时表现出组织特异性。2024/7/27602024/7/2761三、第二信使神经酰胺介导的细胞凋亡三、第二信使神经酰胺介导的细胞凋亡许多激动剂和应激信号（凋亡诱导因子）可诱发鞘磷脂(SM)的水解及(或)其他鞘脂代谢改变而发生神经酰胺的积聚。细胞外应激因子激活酸性神经鞘磷酯酶(A-smaSe)，催化细胞膜上的神经鞘磷酯产生神经酰胺，神经酰胺将信号传递到细胞内相应的靶分子，启动凋亡。一些细胞因子和环境应激因子(包括TNF、CD95FasAPO-1、电离辐射、紫外线、热休克和氧应激)能激活神经鞘磷酯酶，迅速地诱发神经酰胺的产生。鞘磷脂SMase神经酰胺磷酸胆碱+鞘磷脂神经酰胺通路介导多种受体和环境应激在细胞内的信号转导。鞘磷脂酶（鞘磷脂酶（SMaseSMase）2024/7/2762Smase中性Smase(细胞膜上)酸性Smase(溶酶体)ERK通路细胞凋亡促进细胞增殖炎症反应SAPK/JNK2024/7/27632024/7/2764 神经酰胺可激活多条信号转导通路，包括SAPK-JNK信号转导通路并改变一些关键蛋白，如RB、MYC蛋白等的功能或表达。转录因子NF-B也可因神经酰胺的积累而激活。这些通路的激活是通过神经酰胺对神经酰胺激活的蛋白磷酸酶(CAPP)、神经酰胺激活的蛋白激酶(CAPK)、和PKC的激活而实现。 2024/7/2765（1）神经酰胺可激活CAPP家族中的丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶PP1和PP2A家族，这些磷酸酶参与神经酰胺的某些细胞反应的信号转导。（2）CAPK是神经酰胺另一个直接的靶分子，是RAS的激酶抑制因子。它的一个底物为RAF-1，后者的磷酸化活性型可使MEK磷酸化，从而诱导MAPK的激活。（3）神经酰胺的靶分子可能还包括PKC、PKCa、RAF和GDP-GTP交换因子VAV等。（4）神经酰胺也可直接激活半胱天冬酶一3。神经酰胺在TNFa（死亡配体）诱发细胞凋亡的作用见下图：2024/7/2766神经酰胺在神经酰胺在TNFaTNFa诱发细胞凋亡的作用诱发细胞凋亡的作用2024/7/2767四、经应激信号触发细胞凋亡四、经应激信号触发细胞凋亡细胞应激是细胞对环境因素导致大分子损伤的一种防御反应，目的是对抗伤害、修复损伤、增加对损伤的耐受性，以最终保护细胞和/或通过细胞死亡过程最终除去损伤后不能修复的细胞。 活性氧UV电离辐射缺氧渗透压变化细胞因子炎症因子冷热药物机械作用毒物应激原应激原2024/7/2768常见细胞应激的类型常见细胞应激的类型（一）热应激（二）氧化应激（三）低氧应激（四）内质网应激（五）基因毒应激2024/7/2769细胞应激包括一系列高度有序的事件细胞应激包括一系列高度有序的事件1.启动细胞内信号转导通路进而调节靶蛋白的活性，特别是促进转录因子如AP-1、NF-B、P53、低氧诱导因子表达（或提高其转录活性）；2.多种特异性和非特异性的对细胞具有保护作用的应激蛋白质合成：保护细胞免受损伤或修复已有的损伤；3.若细胞损伤严重而修复无望，则诱导细胞调亡以细胞的自杀行为保护整体的利益。2024/7/27701.包括JNK/SAPK、p38、ERK途径。激活的级联反应类似：MAPKKKMAPKKMAPK2.效应：激活转录因子保护性蛋白质生成增强细胞对应激原的抵抗力、或介导细胞调亡的信号转导3.激活因素: JNK/SAPK：紫外线、DNA损伤剂、活性氧、高渗状态、促炎细胞因子； P38：高渗状态、 LPS、细胞因子等； ERK：多种应激原( (一一) )丝裂原活化的蛋白激酶丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activited protein kinase, MAPK(mitogen-activited protein kinase, MAPK(mitogen-activited protein kinase, MAPK(mitogen-activited protein kinase, MAPK）2024/7/27712024/7/27722024/7/27731.磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)： 产生:二酰甘油(DAG) PKC，拮抗细胞调亡； 三磷酸肌醇(IP3) Ca2+i增高（如：炎症细胞被激活的重要标志）2.磷脂酶A2 (PLA2 )：炎症反应中发挥重要作用 激活因素：TNF、凝血酶、缓激肽( (二二) )激活多种磷脂酶激活多种磷脂酶2024/7/27742024/7/27753.鞘磷脂酶(SMase)： 作用：降解鞘磷脂生成神经酰胺（CM, 重要的第二信使）鞘磷脂-神经酰胺通路； 分类： 中性SMase：分布于细胞膜上，与ERK通路及促进细胞增殖、炎症反应的发生有关； 酸性SMase：分布于溶酶体，与SAPK通路和细胞调亡密切相关；2024/7/27761、诱导因素：紫外线、电离辐射、DNA损伤剂2、激活酶类：DNA活化的蛋白激酶(DNA-activated protein kinase, DNA-PK)、毛细血管扩张共济失调突变（ATM）激酶3、作用：活化多种转录因子：P53、c-Jun、c-Fos、c-myc等；使热休克蛋白90(HSP90)磷酸化。( (三三) DNA) DNA损伤激活的蛋白激酶损伤激活的蛋白激酶2024/7/2777五、死亡受体触发凋亡的信号通路五、死亡受体触发凋亡的信号通路 死亡受体介导的细胞凋亡起始于死亡受体与配体的结合。死亡受体主要是肿瘤坏死因子（TNF）家族成员。其诱导细胞凋亡和诱发炎症反应，TNF-R1和Fas(Apo-1,CD95)是死亡受体家族的代表成员，他们的胞质部分均含有死亡结构域（DD），负责招募凋亡信号通路中的信号分子。2024/7/27782024/7/2779死亡受体家族成员死亡受体家族成员参与死亡受体信号转导的接头蛋白：死亡结参与死亡受体信号转导的接头蛋白：死亡结构域蛋白（构域蛋白（death domain proteindeath domain protein）TRADDTRADD：TNFTNF（肿瘤坏死因子）受体相关死亡（肿瘤坏死因子）受体相关死亡结构域蛋白结构域蛋白 TNF+TNFRI TNF+TNFRI（死亡结构域）（死亡结构域）+ TRADD+ TRADD细胞凋细胞凋亡亡FADDFADD：FasFas相关死亡结构域蛋白相关死亡结构域蛋白 FasL+Fas FasL+Fas （死亡结构域）（死亡结构域） +FADD +FADD 细胞凋细胞凋亡亡RIPRIP：受体相互作用蛋白受体相互作用蛋白CRADDCRADD：含有死亡结构域的：含有死亡结构域的caspasecaspase和和RIPRIP接接头蛋白头蛋白MADDMADD：活化活化MAPMAP激酶的死亡结构域蛋白激酶的死亡结构域蛋白2024/7/2780以以FasL-FasFasL-Fas系统为例系统为例1.Fas （factor associated suicide）：自杀相关因子是广泛表达于正常细胞和肿瘤细胞膜表面的型受体，其胞浆段内含有死亡结构域（death domain，DD）及阻抑结构域（suppresive domain，SD）。Fas的阻抑结构域被Fas结合磷酸酶-1（FAP-1）结合后可抑制Fas的诱导凋亡作用。2. FasL（fas Ligand）：Fas的配体主要表达于T效应淋巴细胞和肿瘤细胞中，是呈现于膜表面的型受体。Fas和FasL都是以纯三聚体形成存在。2024/7/27812024/7/27822024/7/2783细胞内Ca2+的升高可通过生成活性氧和活性氮离子等下游环节而破坏细胞的能量内稳状态而导致细胞死亡。六、钙过荷诱发的细胞凋亡六、钙过荷诱发的细胞凋亡线粒体Ca2+积聚将损害氧化磷酸化作用，并通过电子传递链促进活性氧离子如超氧化物(02-)、过氧化氢(H202)的生成。高线粒体Ca2+也改变线粒体膜的通透性，抑制ATP的生成和促进坏死。2024/7/2784CaCa2+2+激活的磷酸酶，钙神经蛋白(calcineurin)可诱导细胞凋亡，可导致BAD去磷酸化，引起它转移至线粒体从而促进Bad与BCL-X形成二聚体。在海马神经元中，L-谷氨酸通过NMDA受体诱发CaCa2+2+内流并激活钙神经蛋白，从而触发BAD的线粒体定位和细胞凋亡。此外，线粒体选择性细胞色素c(Cyt c)通透将激活半胱天冬酶，进而促进细胞凋亡。CaCa2+2+还可直接激活一些细胞的酶从启动细胞毒级联反应。2024/7/2785正常时线粒体外膜的通透性一般只允许5KD的小分子和离子进出，当受某些因素作用破坏了线粒体外膜的这种屏障性通透，引起膜间腔内储存的凋亡因子释放入胞浆内，立即启动凋亡反应。膜间腔内的凋亡因子有：Cyt C, 凋亡诱导因子（AIF）, 第二个Caspase的线粒体激活因 子 （ Smac） , Pro-caspase-2,-3,-7,-9和Hsp-10, Hsp-60等。七、线粒体触发的细胞凋亡及其对死亡信号的整合七、线粒体触发的细胞凋亡及其对死亡信号的整合2024/7/2786线粒体外膜通透性增高胞质中出现CytC与细胞浆中成分作用激活caspases诱导细胞凋亡的发生如染色质浓缩和核碎裂2024/7/2787影响影响线粒体膜通透性粒体膜通透性转变的因素的因素1、BcL-2族的促凋亡亚族成员（1）Bad：在生长因子存在下，可通过磷脂酰肌醇-3-激酶（PI-3-K）和PKA促使Bad的Ser112，136磷酸化而抑制其促凋亡活性。在去除生长因子时，则Bad被去磷酸化而与Bcl-2或Bcl-XL二聚化，破坏线粒体外膜通透性释放出凋亡分子而导致细胞凋亡。（2）Bid：本来存在于胞浆内，当被Caspase 8催化分裂成N端11kD和C端15kD二个片段，后者即转位线粒体破坏其外膜通透性而导致凋亡放大作用。（3）Bim：本是结合在胞浆微管复合体，当受到凋亡刺激时转位到线粒体，中和Bcl-2（或Bcl-XL）而导致凋亡。2024/7/2788细胞内钙离子浓度（Ca2+i）升高可激活胞浆内的钙调磷酸酶（Calcineurin），后者促使Bad去磷酸化激活导致细胞凋亡。2、Ca2+i升高：PKC-与其它的PKC成员（PKC-，PKC-）的功能不同。它一方面可直接作用改变线粒体膜的通透性导致凋亡，另一方面PKC-是Caspase 3的靶底物，Caspase3可催化PKC-部分蛋白分解而增强激活，后者磷酸化并分解核膜的层连蛋白（Lamin）导致核膜破裂。故最近又将PKC-称为凋亡层连蛋白激酶（apoptotic lamin kinase）。3、蛋白激酶C-（PKC-）： 在线粒体老化时，其呼吸链电子传递受损，产生活性氧（ROS）增多，破坏线粒体跨膜压（m），增大线粒体膜通透性导致细胞凋亡。4、线粒体老化2024/7/27892024/7/27902024/7/2791八、八、MYCMYC与细胞凋亡与细胞凋亡MYC是具有螺旋-环-螺旋结构的转录因子，它同它的分子伴侣MAX结合后，可诱导处于低浓度生长因子环境中的细胞发生凋亡。细胞在生长环境中促进生长的因子不足这种应激条件下的细胞凋亡与MYC基因的表达有关。九、细胞凋亡信号转导特点：九、细胞凋亡信号转导特点：多样性、耦联性、同一性、多途性2、凋亡信号转导系统（1）胞内Ca2+信号系统（2）cAMP/PKA信号系统（3）Fas蛋白/Fas配体信号系统（4）神经酰胺信号系统（5）二酰甘油/PKC信号系统（6）酪氨酸蛋白激酶(PTK)信号系统APOPTOSIS腺苷酸环化酶钙调素 Ca2+ cAMP谷氨酰胺转移酶 PKA转录因子FasFas L神经酰胺 SPP AP-1S期(抗凋)caspaseH1组蛋白CKCK-RMAPKMAPKKRaf-1RasPTK分化PKC二酰甘油Tc-R糖皮质激素2024/7/279394第四节 细胞的非凋亡性死亡2024/7/27 线粒体除可触发细胞凋亡外，还可诱发细胞的非凋亡性死亡。一般说来有3种机制与之有关：1、电子传递和能量代谢受损 射线和神经酰胺诱发细胞凋亡时还在电子传递链的细胞色素b-c1与细胞色素c步骤引起破坏；FASL作用下的细胞也可发生细胞色素c的功能损害。并由此而发生的ATP产生下降。2024/7/27952、活性氧离子(ROS)和细胞氧化还原(redox) 许多刺激引起凋亡过程中有超氧化物和脂质过氧化物的增加，但它发生在半胱天冬酶激活之后。细胞色素。的释出也可导致线粒体ROS生成增加和ATP生成减少。3、线粒体外膜破损 线粒体渗透性转换小孔开放将导致线粒体基质和线粒体内外膜间隙中，发生离子平衡而使内膜两侧H+梯度消失，还将导致因基质高渗而引起的线粒体容积失调，最终引起外膜破损。96第五节 细胞凋亡的生物学特征及其检测2024/7/27一、一、细胞凋亡的形胞凋亡的形态学学检测1、光学显微镜和倒置显微镜（1） 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。（2） 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。2024/7/27972、 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2-5mg/ml。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5-1mg/ml。2024/7/27983、 透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构；a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 2024/7/27992024/7/27100二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin VAnnexin V法）法）磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35-36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。2024/7/271012024/7/271022024/7/27103三、线粒体膜势能的检测三、线粒体膜势能的检测 线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位DYmt的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。 线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodideDiOC6（3）、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodideJC-1、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。 2024/7/27104 细胞凋亡时主要生物化学特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成180200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。四、四、DNADNA片断化检测片断化检测2024/7/27105SPC-A1（人肺癌细胞），10ug/ml顺铂（终浓度）处理，每隔8h，进行分析图片说明：凝胶两端为lamda marker，从左至右分别为空白（未用顺铂处理），处理8h、16h、24h、32h、40h、48h、56h、64h、72h， 2024/7/27106 MCF-7-C1 Con ATO 5 Msub-G1凋亡细胞凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析含量的流式细胞计分析2024/7/27107五、五、 TUNELTUNEL法法细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。 TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。2024/7/271082024/7/271092024/7/271102024/7/27111六六 、Caspase-3Caspase-3活性的检测活性的检测Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。2024/7/271121.Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶poly（ADP-ribose）polymerase，PARP等的裂解。2.荧光分光光度计分析原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。3. 流式细胞术分析方法：收获细胞正常或凋亡细胞,PBS洗涤,加Ac-DEVD-AMC, 37C反应1h, UV流式细胞计分析caspase-3阳性细胞数和平均荧光强度。2024/7/27113As2O3As2O3、热休克以及两者联合作用处理、热休克以及两者联合作用处理NB4NB4细胞对细胞对Caspase3Caspase3表达的影响表达的影响1.Control；2. 44 2hours ；3. As2O3 0.5 M；4. As2O3 1 M；5. As2O3 0.5 M + 44 2hours；6. As2O3 1 M + 44 2hours。ActinCaspase3 1 2 3 4 5 62024/7/271142024/7/271152024/7/271161172024/7/27谢谢！谢谢！