会计学1PCR技术技术(jsh)上岗培训上岗培训第一页，共30页。疾病疾病(jbng)的诊断的诊断分子分子(fnz)诊断诊断影象(yn xin)学诊断细胞/组织诊断 临 床 诊 断免疫诊断生化诊断第1页/共29页第二页，共30页。几乎几乎(jh)所有的疾病都是基因所有的疾病都是基因病病n n科学研究已证明，基因可以揭示疾病的本质，人类(rnli)几乎所有疾病都直接或间接与基因有关，在某种意义上都是基因病， 第2页/共29页第三页，共30页。第3页/共29页第四页，共30页。第4页/共29页第五页，共30页。第5页/共29页第六页，共30页。PCR技术技术(jsh)n n19851985年美国人莫里斯（年美国人莫里斯（Kary MullisKary Mullis）发明了一种模拟）发明了一种模拟DNADNA体内复制过体内复制过程，在体外复制特定程，在体外复制特定DNADNA片段的方法片段的方法(fngf(fngf ) )，并将其命名为聚合酶，并将其命名为聚合酶链式反应（链式反应（PolymeraseChain ReactionPolymeraseChain Reaction，PCRPCR）。）。PCRPCR可以在短时间内倍可以在短时间内倍增极微量增极微量DNA DNA （理论上说（理论上说, ,仅有一个足够了）至百万或十亿倍，通过仅有一个足够了）至百万或十亿倍，通过PCRPCR可以简便、快速地从微量生物材料中获得大量特定的核酸，并具可以简便、快速地从微量生物材料中获得大量特定的核酸，并具有很高的灵敏度和特异性，可用于微量核酸样品的检测。有很高的灵敏度和特异性，可用于微量核酸样品的检测。 第6页/共29页第七页，共30页。PCR技术技术(jsh)n nPCRPCR技术被科学界誉为生物技术领域最伟大的发明之一，美国人莫里斯在技术被科学界誉为生物技术领域最伟大的发明之一，美国人莫里斯在发明该技术不久就因此于发明该技术不久就因此于19931993年获得诺贝尔化学奖。年获得诺贝尔化学奖。PCRPCR及其相关技术于及其相关技术于8080年代末在国外开始应用：欧共体（现欧盟）、日本、美国相继把年代末在国外开始应用：欧共体（现欧盟）、日本、美国相继把PCRPCR这这一基因诊断核心技术列入献血员筛查，美国食物与药品管理局已批准一基因诊断核心技术列入献血员筛查，美国食物与药品管理局已批准(p (p zhzh n)n)了了6060多种基因诊断试剂用于临床，美国国家疾病控制中心已把多种基因诊断试剂用于临床，美国国家疾病控制中心已把PCRPCR技术列入疾病诊断的常规技术。技术列入疾病诊断的常规技术。 第7页/共29页第八页，共30页。第8页/共29页第九页，共30页。变性（变性（9090-96-96）：双链）：双链DNADNA模板在热作用模板在热作用(zuyng)(zuyng)下，下， 氢键断裂，形成单链氢键断裂，形成单链DNADNA2. 2.退火（退火（2525-65-65）：系统温度降低，引物与）：系统温度降低，引物与DNADNA模板结合，形成局部双链。模板结合，形成局部双链。3. 3.延伸（延伸（7070-75-75）：在）：在TaqTaq酶（在酶（在7272左右最佳的活性）的作用左右最佳的活性）的作用(zuyng)(zuyng)下，以下，以dNTPdNTP为原为原料，从引物的料，从引物的5 5端端33端延伸，合成与模板互补的端延伸，合成与模板互补的DNADNA链。链。 每一循环经过变性、退火和延伸，每一循环经过变性、退火和延伸，DNADNA含量既增加一倍。含量既增加一倍。 标准的PCR过程(guchng)分为三步第9页/共29页第十页，共30页。荧光荧光PCRPCR检测技术是在传统检测技术是在传统PCRPCR技术基础上，加入荧光技术基础上，加入荧光标记标记(bioj)(bioj)的基因探针，通过探针与扩增产物的结的基因探针，通过探针与扩增产物的结合释放出荧光信号，再通过专门的仪器（荧光合释放出荧光信号，再通过专门的仪器（荧光PCRPCR仪）仪）对荧光信号的实时检测，经过电脑分析以后，可以准对荧光信号的实时检测，经过电脑分析以后，可以准确计算出目的基因的初始数量，实现定量检测。与传确计算出目的基因的初始数量，实现定量检测。与传统统PCRPCR检测相比，荧光检测相比，荧光PCRPCR检测技术不仅实现了检测技术不仅实现了PCRPCR检测检测从定性到定量的飞跃，而且它具有特异性更强、有效从定性到定量的飞跃，而且它具有特异性更强、有效解决解决PCRPCR污染问题、自动化程度高等特点。因此，荧光污染问题、自动化程度高等特点。因此，荧光PCRPCR检测技术自二十世纪九十年代中期出现以来，已成检测技术自二十世纪九十年代中期出现以来，已成为最具代表性的为最具代表性的PCRPCR检测技术，为检测技术，为PCRPCR检测技术临床应检测技术临床应用打开了方便之门，现已得到广泛应用。用打开了方便之门，现已得到广泛应用。荧光荧光(ynggung)PCR(ynggung)PCR检测技术简介检测技术简介 第10页/共29页第十一页，共30页。短柄圆环探针荧光短柄圆环探针荧光(ynggung)PCR原理原理分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸链，一般含有2535个核苷酸。在结构上，分子信标大体上可以分为三部分：（1）、环状区：一般由1530个核苷酸组成，可以与靶分子特异结合；（2）、茎干(jn n)区：一般由58个碱基对组成，在分子信标与靶分子结合过程中可发生可逆性解离。（3）、荧光基团和淬灭基团：荧光基团一般连接在5端；淬灭基团一般连接在3端，常用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作为淬灭基团。根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。所以只有荧光基团与淬灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光。第11页/共29页第十二页，共30页。荧光荧光(ynggung)标记标记n n荧光发光是通过激发光激发荧光基团到达高能量状态,而后产生发射光。常用(chn yn)的有绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白DsRed 、CY3、CY5、FAM及其它荧光报告基团 第12页/共29页第十三页，共30页。探针探针(tn zhn)荧光标记及荧光标记及荧光基团：如红色荧光Cy3和绿色荧光Cy5标记探针(tn zhn)淬灭基团常：用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）第13页/共29页第十四页，共30页。影响分子影响分子(fnz)信标的主要因信标的主要因素素分子信标分子信标(xn bio)(xn bio)中，荧光基团和淬灭基团之间的距离是影响分子信标中，荧光基团和淬灭基团之间的距离是影响分子信标(xn bio)(xn bio)的的最主要因素。根据最主要因素。根据FoersterFoerster理论，荧光基团与淬灭基团之间的距离直接影响荧理论，荧光基团与淬灭基团之间的距离直接影响荧光的强度。光的强度。 另外，温度也是影响分子信标另外，温度也是影响分子信标(xn bio)(xn bio)的一个重要因素。在较低温度下，分子信的一个重要因素。在较低温度下，分子信标标(xn bio)(xn bio)才可以保持发卡结构。在较高温度下，分子信标才可以保持发卡结构。在较高温度下，分子信标(xn bio)(xn bio)将无法保将无法保持其发卡结构，甚至使其伸展为随机线状，造成荧光基团和淬灭基团分离，持其发卡结构，甚至使其伸展为随机线状，造成荧光基团和淬灭基团分离，从而发出荧光，出现假阳性结果。有文献表明，其熔链温度取决于茎干区的从而发出荧光，出现假阳性结果。有文献表明，其熔链温度取决于茎干区的长度、长度、G-CG-C含量和缓冲液的离子强度含量和缓冲液的离子强度第14页/共29页第十五页，共30页。PCR反应反应(fnyng)特点特点 n n特异性强特异性强 n n灵敏度高灵敏度高n n PCR PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10- 12)(pg=10- 12)量级的起始待测模板扩量级的起始待测模板扩增到微克增到微克(ug=-6)(ug=-6)水平。能从水平。能从100100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCRPCR的灵敏的灵敏度可达度可达3 3个个RFU(RFU(空斑形成单位空斑形成单位) )；在细菌学中最小检出率为；在细菌学中最小检出率为3 3个细菌。个细菌。n n简便、快速简便、快速PCRPCR反应用耐高温的反应用耐高温的Taq DNATaq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNADNA扩增液和水浴锅扩增液和水浴锅上进行变性上进行变性- -退火退火- -延伸反应，一般在延伸反应，一般在2 24 4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。n n对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA DNA 粗制品及粗制品及RNARNA均可作为扩增模板。可直接均可作为扩增模板。可直接(zhji)(zhji)用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNADNA扩增检测。扩增检测。 第15页/共29页第十六页，共30页。实时实时(sh sh)荧光荧光PCR结果判读结果判读第16页/共29页第十七页，共30页。荧光荧光PCR试剂盒检测试剂盒检测(jin c)结结果果第17页/共29页第十八页，共30页。第18页/共29页第十九页，共30页。第19页/共29页第二十页，共30页。荧光荧光(ynggung)域值域值（threshold）的设定）的设定 PCR反应管的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，即：threshold=10sd cycle6-15.荧光域值设定(sh dn)在PCR扩增的指数期。第20页/共29页第二十一页，共30页。Ct值值 在荧光定量在荧光定量PCRPCR技术中，有一个很重要的概念技术中，有一个很重要的概念CtCt值。值。C C代表代表cyclecycle，t t代代表表thresholdthreshold，CtCt值的含义为每个反应管内荧光信号达到设定的域值时值的含义为每个反应管内荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。个模板的所经历的循环数。个模板的CtCt值与该模板的起始拷贝数的对数存在线值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，性关系，CtCt值越小，起始拷贝数越多，反之亦然。利用已知起始拷贝值越小，起始拷贝数越多，反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表坐标代表CtCt值。因此值。因此(ync(ync ) )，只要获得未知样品的，只要获得未知样品的CtCt值，就可从标准曲值，就可从标准曲线上算出该样品的起始拷贝数。线上算出该样品的起始拷贝数。第21页/共29页第二十二页，共30页。PCR诊断试剂诊断试剂(shj)生产管理要点生产管理要点1、应具有阳性血清（或阳性质粒）处理、分装的隔离实验室2、PCR试剂的生产区与检定区应严格分开3、专用原材料 PCR引物的设计要合理(hl)、合适，引物的合成要有固定的地方和设备，纯度能到达一定标准第22页/共29页第二十三页，共30页。荧光荧光(ynggung)定量定量PCR试剂的试剂的质量检查操作程序质量检查操作程序n n每次买来一批新试剂时，先观察外包装有无破损及有效期等，试剂运输过程中有无冷冻保存，每次买来一批新试剂时，先观察外包装有无破损及有效期等，试剂运输过程中有无冷冻保存，如有异常，及时与厂家联系。如有异常，及时与厂家联系。n n内包装：试剂是否漏液，真空包装是否破损，试剂是否齐全以及是否有使用说明书等。内包装：试剂是否漏液，真空包装是否破损，试剂是否齐全以及是否有使用说明书等。n n试剂的灵敏度：取卫生部临检中心购买的已知拷贝数的血清试剂的灵敏度：取卫生部临检中心购买的已知拷贝数的血清1 1份，并稀释至份，并稀释至1010拷贝数，用新试剂拷贝数，用新试剂检测，计算检测，计算(j sun)(j sun)出灵敏度。出灵敏度。n n试剂的重复性：取从卫生部临床检验中心购买的已知拷贝数的血清试剂的重复性：取从卫生部临床检验中心购买的已知拷贝数的血清1 1份，用新试剂稀释平行检测份，用新试剂稀释平行检测1010次，计算次，计算(j sun)(j sun)出出SDSD，CV%CV%。CV%CV%应在应在30%30%。n n试剂的特异性：取临床标本试剂的特异性：取临床标本1010份（包括：低拷贝、高拷贝、阴性、高黄疸的标本各份（包括：低拷贝、高拷贝、阴性、高黄疸的标本各2 2份），用新份），用新试剂检测，用于考察试剂的特异性。试剂检测，用于考察试剂的特异性。第23页/共29页第二十四页，共30页。荧光定量荧光定量PCR室内室内(sh ni)质控质控程序程序n n每天门诊抽取病人血标本时，须先仔细认真核对化验单和病人姓名是否符合。每天门诊抽取病人血标本时，须先仔细认真核对化验单和病人姓名是否符合。n n编完化验单号后，在对血标本进行编号编完化验单号后，在对血标本进行编号(bin ho)(bin ho)时要仔细核对化验单的病人姓名与标本管上的时要仔细核对化验单的病人姓名与标本管上的姓名，不得有误。姓名，不得有误。n n每次试验中，须同时测定每次试验中，须同时测定1 1份阴性对照与一份质控品。份阴性对照与一份质控品。n n首次制作质控图时（新批号开始时），采用首次制作质控图时（新批号开始时），采用“ “即刻法即刻法” ”质控方法，具体步骤如下：质控方法，具体步骤如下：n n将连续的质控测定值从小到大排列，即将连续的质控测定值从小到大排列，即X1X1，X2X2，XNXNn n计算均值计算均值(X)(X)和标准差和标准差(S)(S)n n按下述公式计算按下述公式计算SISI上限和上限和SISI下限下限n nSISI上限上限=(X=(X最大值最大值-X-X均值均值)/2)/2n nSISI下限下限=(X=(X均值均值-X-X最小值最小值)/2)/2第24页/共29页第二十五页，共30页。PCR定量为何定量为何(wih)要设内参照要设内参照？ 影响影响影响影响PCRPCR定量的主要原因有定量的主要原因有定量的主要原因有定量的主要原因有1 1、反应效率的差异：可能为反应体系和、反应效率的差异：可能为反应体系和、反应效率的差异：可能为反应体系和、反应效率的差异：可能为反应体系和PCRPCR扩增仪的工作扩增仪的工作扩增仪的工作扩增仪的工作状态所致。由于状态所致。由于状态所致。由于状态所致。由于PCRPCR产物增加按指数方式进行，所以扩增效率即使相差极小，也会极产物增加按指数方式进行，所以扩增效率即使相差极小，也会极产物增加按指数方式进行，所以扩增效率即使相差极小，也会极产物增加按指数方式进行，所以扩增效率即使相差极小，也会极大改变产物的浓度。解决办法就是设内对照，使参照基因在同一反应管内进行大改变产物的浓度。解决办法就是设内对照，使参照基因在同一反应管内进行大改变产物的浓度。解决办法就是设内对照，使参照基因在同一反应管内进行大改变产物的浓度。解决办法就是设内对照，使参照基因在同一反应管内进行PCRPCR扩扩扩扩增，起到校正增，起到校正增，起到校正增，起到校正(jiozhng)(jiozhng)作用，这样，任何影响扩增效率的因素同样会影响两种模板。作用，这样，任何影响扩增效率的因素同样会影响两种模板。作用，这样，任何影响扩增效率的因素同样会影响两种模板。作用，这样，任何影响扩增效率的因素同样会影响两种模板。2 2、终产物浓度的影响：终产物浓度达到一定水平后，不会再保持指数式增长，而是进、终产物浓度的影响：终产物浓度达到一定水平后，不会再保持指数式增长，而是进、终产物浓度的影响：终产物浓度达到一定水平后，不会再保持指数式增长，而是进、终产物浓度的影响：终产物浓度达到一定水平后，不会再保持指数式增长，而是进入平台期。解决办法：系列稀释待测模板，或在一定入平台期。解决办法：系列稀释待测模板，或在一定入平台期。解决办法：系列稀释待测模板，或在一定入平台期。解决办法：系列稀释待测模板，或在一定PCRPCR反应周期后间隔测定反应周期后间隔测定反应周期后间隔测定反应周期后间隔测定PCRPCR终终终终产物的浓度。产物的浓度。产物的浓度。产物的浓度。第25页/共29页第二十六页，共30页。PCR诊断试剂质量控制诊断试剂质量控制(kngzh)要点要点1、酶活性测定2、引物序列的确定(qudng)3、PCR加样区、扩增区、检测区应严格分开4、选择特异、敏感及简单快速的PCR产物检测方法第26页/共29页第二十七页，共30页。5、DNA聚合酶的活性及稳定性能达到一定的要求，并有固定的来源6、PCR产物检测方法(fngf)要尽可能的可靠、快速方便7、PCR试剂盒的检定人员应进行专门的培训第27页/共29页第二十八页，共30页。PCR的假阴性和假阳性的假阴性和假阳性(yngxng)产生原因产生原因n n假阴性：操作不当，试剂质量差（包括引物和探针设计不当）或过期、仪器设备不准确(zhnqu)n n假阳性：几乎均由污染所致第28页/共29页第二十九页，共30页。内容(nirng)总结会计学。（2）、茎干区：一般由58个碱基对组成，在分子信标(xn bio)与靶分子结合过程中可发生可逆性解离。每天门诊抽取病人血标本时，须先仔细认真核对化验单和病人姓名是否符合。按下述公式计算SI上限和SI下限。SI下限=(X均值-X最小值)/2。PCR的假阴性和假阳性产生原因。假阳性：几乎均由污染所致第三十页，共30页。