药敏试验（扩散法）操作方法药敏试验（扩散法）操作方法河南康星畜禽疫病诊断中心马长宇 13333835742内容内容: :一、药物敏感试验的目的与意义二、常用的药敏测定方法 三、试验准备及用品四、药敏试验操作步骤五、结果观察六、影响药敏结果的因素一、概念一、概念抗菌药物敏感性试验（AST，简称药敏试验）：用于测试抗菌药物在体外对病原微生物有无抑制作用。（1）MIC：体外能够抑制细菌生长的最低药物浓度，临床医师可以根据MIC确定药物剂量。通常达到稳态的血药峰浓度（Css）max应为MIC的4-8倍，重症感染以大于8倍为妥。 （2）为方便临床给药，根据MIC提供一个定性的结果是必要的。临床医师根据敏感、中介、耐药的提示结合MIC可以方便地制定用药方案。 敏感（S）：表示该药物对细菌的MIC值低于常规剂量下的抗菌 药物血液浓度或组织浓度4-8倍，可以用常规剂量治愈。 中介（I）：表示该药物对细菌的MIC值接近于常规剂量给药后的血药浓度或组织药物浓度，细菌对该药的敏感性降低，但仍可用于生理性浓集部位的感染或使用高剂量药物进行治疗（注：必须考虑高剂量的安全性）。 耐药（R）：表示该药物对细菌的MIC值等于或高于常规剂量下药物的血液浓度或组织浓度，细菌不能被该种药物抑制。意义：意义：1、检测病原菌对各种抗生素的敏感性，指导临床合理用药。避免盲目用药、滥用药、大剂量用药。2、监测耐药性，分析耐药菌变迁，了解某一地区致病菌的耐药变迁、流行病学调查及监控，控制和预防耐药菌株的流行3、为经验用药提供所选药物的参考依据，可预测抗菌治疗的效果。“敏感”治疗可能有效；“耐药” 肯定失败4、新抗菌药的研究以下情况不需进行药敏测定：以下情况不需进行药敏测定：标本污染细菌，非致病菌引起已知某些抗菌药对某菌有良好的抗菌作用且很少有耐药菌产生已知细菌全部耐药的药物对营养要求高而不易生长的细菌二、常用的药敏测定方法二、常用的药敏测定方法 1、扩散法：纸片法、牛津杯法、打孔法等。 纸片法 手工测试的方法，通过测试药物纸片在固体培养基上的抑菌圈的大小，判断细菌对该种药物是否敏感。目前临床上广泛使用此法。定性2、稀释法：琼脂稀释法、液体稀释法（试管、微量） 通过测试细菌在含不同浓度药物培养基内的生长情况，判断其最低抑菌浓度（MIC）。自动化仪器均采用液体稀释法为药敏试验的方法。 定量3、E测定法（E test）： 与扩散法相似，但药物包被于长塑料条上，能够精确测定MIC值。适于一些特殊病原菌的药敏测试，但价格较为昂贵。 4、全自动药敏仪法：三、试验准备及用品三、试验准备及用品药品（单品药、药厂的成品药、中药）、恒温培养箱、药敏片、培养基、平皿（直径90mm）、烧杯、蒸馏水、滤纸、打孔器（文具店有售）、0.5麦氏比浊管配制方法： 0.048M BaCL2 (1.17% W/V BaCL2.2H2O) 0.5ml 0.36N H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml 将二液混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。用前混匀。有效期为6个月。1 1、培养基、培养基MH肉汤（MHB）Mueller-Hinton Broth用途：用于抗生素敏感试验配方：（g/L）牛肉粉2.0可溶性淀粉1.5酸水解酪蛋白17.5pH值7.40.225 原理：牛肉粉和酸水解酪蛋白提供氮源、维生素和氨基酸；可溶性淀粉吸收有毒的代谢产物。用法：称取本品21.0g,加热溶解于1000ml 蒸馏水中,121高压灭菌15分钟,备用。MH琼脂（MHA）Mueller-Hinton Agar用途：用于抗生素敏感试验配方：（g/L）牛肉粉6.0可溶性淀粉1.5酸水解酪蛋白17.5琼脂17PH值7.30.125 原理：牛肉粉和酸水解酪蛋白提供氮源、维生素和氨基酸；可溶性淀粉吸收有毒的代谢产物；琼脂是培养基的凝固剂。用法：称取本品42.0g,加热溶解于1000ml蒸馏水中,121高压灭菌15分钟,待冷至50，倾入无菌平皿,备用。1、是兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培养基2、如营养要求高可加0.5%羊血。3、平板直径为9cm。4、琼脂板厚度4mm。误差1mm。5、4保存7天。营养肉汤（营养肉汤（NBNB）Nutrient Broth用途：用途：一般细菌培养,转种,复壮,增菌等（GB标准） 配方：（配方：（g/Lg/L）蛋白胨10牛肉粉3氯化钠5pH值7.20.2 25 原理：原理：蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源；氯化钠能维持均衡的渗透压。用法：用法：称取本品18.0g,加热溶解于1000ml蒸馏水中,分装三角瓶或管,121高压灭菌15分钟备用。营养琼脂（营养琼脂（NANA）Nutrient Agar用途：用途：一般细菌培养,转种,复壮,增菌等（GB标准） 配方：（配方：（g/Lg/L）蛋白胨10肉浸粉10氯化钠 5琼脂20pH值7.20.2 25 原理：原理：蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源；氯化钠能维持均衡的渗透压。用法：用法：称取本品18.0g,加热溶解于1000ml蒸馏水中,分装三角瓶或试管,121高压灭菌15分钟备用。MH肉汤（100）、MH琼脂（250） ；营养肉汤（60） 、营养琼脂（80）均可以生化试剂店买到。操作步骤：操作步骤：1、玻璃器皿的准备 冲洗、包裹、灭菌、干燥2、记量、称取原料3、加热溶解4、校正PH值5、灭菌6、分装、包裹、备用2 2、药敏片、药敏片1、单药（一种成分） 市场生化试剂店有售，也可自制。但含量及监测标准有严格界定。建议购买2、成药（复方成分） 多种联合的抗菌药物制剂应以其成分中某种含量最高的抗菌药物为标准稀释成有效浓度。但多数厂家由于产品配方机密，多按产品用量进行配制。药敏片可由厂家提供，也可自制。3、中药草药 将中药研成粉未，1克加适量的水充分浸泡煮沸,滤液除去杂质后浓缩成1毫升,过滤、高压灭菌后加入100张纸片干燥备用。制作步骤：1、纸片的准备2、药液的配制3、抗菌药敏纸片制作质控：标准菌株的抑菌圈直径应落在预期范围内，如果超出该范围，应视为失控而予以纠正。简易药敏片的制法简易药敏片的制法纸片的准备：纸片的准备：1、取新华1号定性滤纸，用打孔机打成6毫米直径的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。经15磅15-20分钟高压消毒后，放在37温箱或烘箱中数天，使完全干燥。2、药片吸水量的测定 在上述药片用微量移液器进行滴加蒸馏水，最可使药片完全浸透又不滴水为宜，最终计算出每片药片的吸水量。一般常用直经6mm的定性滤纸药片吸水量为0.01ml。药液的制备（用于商品药的试验）：药液的制备（用于商品药的试验）：按兽药说明书(或标签)上标明的治疗量的10-20倍比例配制药液。如某药品：100g兑水100kg，表明该药治疗量为1g兑水1L，配制药液时就是1g加50-100ml水或1L水加10-20g药品，即为配制药敏片所用的药液浓度。抗菌药的稀释剂通常用纯化水。说明：不同厂家标示成分及含量相同的成品制剂在用成品做成药敏时常出现显著差异（包括同一厂家生产）由于在进行成品制作时常加入一定量的辅助成份，其对药敏试验结果常造成较大影响，所以成品药敏试验结果并不能完全显示成品的真实结果。不能用单药的药敏结果代替成药进行用药。（标示与真实成份及含量有很大差别）建议选用厂家提供的以成品主药成份制作的药敏片使用。中药由于其成份复杂及独特作用机理，药敏试验不能作为唯一的判定标准。抗菌药敏纸片制作：抗菌药敏纸片制作：方法一方法一: : 按每张纸片饱和吸水量为0.01毫升计，在上述含有50片纸片的青霉素瓶内加入药液0.5毫升，并翻动纸片，使各纸片充分浸透药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。同时在瓶口上记录药物名称，放37温箱内过夜，干燥后即密盖。方法二： 1、将药液盛于干净干燥的平皿中。然后将烘干的纸片逐片放入配制好的药液中，置于4-8浸泡1-2小时，同时要注意翻动，使各纸片充分透药液。 2、将浸泡好的药敏片用镊子夹出，放入另一干燥平皿中。置于恒温箱中，温度37，烘干1224小时。（注意经常翻动，避免药敏片重叠粘连）。 3、将烘干好的药敏片放入青霉素瓶内进行保存。药敏纸片的储存：药敏纸片的储存：长期储存应于20，日常使用的小量纸片可放在4，但应至于含干燥剂的密封容器内。使用时从低温取出后,放置平衡到室温后才可打开，用完后应立即将纸片放回冰箱内的密封容器内。 过期纸片不能使用, 应弃去。3 3、高压灭菌锅及使用、高压灭菌锅及使用4 4、其他用品、其他用品四、药敏试验操作步骤：四、药敏试验操作步骤：一步法：用病料直接在平板上进行涂抹后贴药敏片，培养后观察。二步法：先进行细菌的增值培养后，再取培养菌进行平板药敏试验。（纸片法、牛津杯法、打孔法）细菌增值培养：细菌增值培养：1、剖检已死亡或即将死亡的家禽。2、以无菌手术镊子陆续取出病料（心，肝，肺，脾均可）。3、在酒精灯上把手术刀，镊子，接种环灭菌，再用接种环采取病料划在备好的培养基上，划线要均匀。（也可用MHB肉汤或营养肉汤上进行增菌培养，摇床培养一般约需6-8h）1、纸片琼脂扩散法（1/3）纸片扩散法(diskdiffusiontest)，K-B法：WHO推荐的全球统一的标准方法。原理：原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度,在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关关系。1、纸片琼脂扩散法（2/3）1、细菌涂抹平板 在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。 具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。 （另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密。） 2、贴药片： 将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；一般可在平皿中央贴一片，外周可等距离贴若干片（外周一般可贴七片），每种药敏片的名称要记住。1、纸片琼脂扩散法（3/3）3、培养观察 将平皿培养基置于37温箱中倒置培养24小时后，观察效果 2、牛津杯法 第一步同“纸片法”细菌涂抹平板。以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（内径6nm、外径8nm、高10 nm的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，并在小管处标记各种药物名称。每个平板可放4-6支小管。待分钟后，分别向各小管中滴加一定数量的各种药液，勿使其外溢。置37培养8-18小时，观察结果。 3、打孔法：第一步同“纸片法”细菌涂抹平板。以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（外径为4毫米、孔径与孔距均为3毫米，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上打孔，将孔中的培养基用针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分的与平皿融合（以防药液渗漏，影响结果）。加样：按不同药液加样，样品加至满而不溢为止。将平皿培养基置于37温箱中培养24小时后，观察效果。五、结果观察：五、结果观察：在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度呈梯度递减，因此在纸片周围一定距离内的细菌生长受到抑制。培养一定时间后形成一个抑菌圈，抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感性越大，反之越小，若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。其直径大小与药物浓度、划线细菌浓度有直接关系。联合药敏试验抑菌圈边缘分界清晰、内部洁净透明,说明该抗菌药物作用迅速,多半为杀菌剂,边缘不十分清晰、内部朦胧说明该抗菌药物可能是慢效抑菌剂或有耐药的产生、或分解较快维持抗菌时间短。抑菌圈中分层次形成同心年轮样,可能是联合使用抗菌药物或该抗菌药物失效过快或细菌产生了耐药性。药物敏感实验判定标准抑菌圈直径（毫米）敏感度20以上极敏1520高敏1014中敏10以下低敏0不敏 l多黏菌素抑菌圈；在9毫米以上为高敏，69毫米为低敏，无抑菌圈为不敏。l抗菌中草药的判定不同于抗菌西药,通常纸片抑菌直径达10毫米以上即视为高度敏感。用游标卡尺测量抑菌圈直径，从平板背面测量最接近的整数毫米数并记录。抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环，磺胺药在抑菌环内出现轻微生长，这些都不作为抑菌环的边缘。结果判断依据鉴定所药敏纸片判定标准。 六、影响药敏结果的因素六、影响药敏结果的因素药物因素细菌因素培养条件培养基药敏片药物因素药物因素1.药物的溶解性 易溶于水的药物易扩散，难溶性药物就不易扩散2.药物的稳定性 如水解（某些内酰胺类药物）、PH值（青霉素钠遇酸碱分解、红霉素遇酸不稳定）3.药物的抗菌机理 杀菌药物 环边沿明晰 抑菌药物 环边沿模糊细菌恢复生长环缩小杀菌药物 氨基糖苷类、喹诺酮类等。抑菌药物 磺胺类、红霉素类、林可霉素、四环素类、氯霉素类等4.离子的影响 喹诺酮类、四环素类、泰乐菌素等药物在Ca、Mg等阳离子的作用下（一般是形成不溶性络合物）抗菌作用降低或丧失。5.适宜的PH值 氨基糖苷类在弱碱情况下抗菌作用稍有增强6.药物在体内外作用有别 只有在体内进一步分解（或转化）后才能表现出抗菌作用细菌因素细菌因素细菌层的薄厚细菌的生长特性培养基培养基培养基厚度水的质量PH值培养基成分培养条件培养时间的长短培养温度药敏片药物含量的多少试纸片材质应用应用1、在选择高敏药物时还应考虑药物的吸收途径。高敏药物一定要配合适宜的给药方法。2、药敏试验结果仅为临床选择高敏药物的参考。药敏试验与临床治疗效果的符合率一般为7080%。如发现疗效不显著应及时换药。3、药敏试验确定的首选药物不是一成不变。要定期进行药敏试验。 4、窄谱抗生素能解决的问题不选广谱抗生素，一种抗生素可达到治疗作用时，不要用两种药物联合应用。必须应用两种抗生素时，应选择联合应用具有协同作用的药物。5、避开已经使用过的药物或其同类药物，发病期间已用过的药物或同类药物一般不用。6、加强饲养管理，提高卫生条件，能起到很好的辅助治疗作用感谢以下文献作者：感谢以下文献作者：禽传染病实验诊断技术复方兽药的药敏试验(药敏片法)与药物选择基层兽医临床中药敏试验方法分析药敏试验影响因素指导临床用药兽医临床纸片法药敏试验结果的影响因素依赖药敏试验治疗鸡大肠杆菌病的误区基层兽医药敏试验操作的调查分析WST 125-1999 纸片法抗菌药物敏感试验标准