血清脂蛋白血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分析琼脂糖凝胶电泳分析【目的要求目的要求】1.掌握琼脂糖凝胶电泳分离血掌握琼脂糖凝胶电泳分离血清脂蛋白的脂蛋白的 原理原理,掌握正常人血浆浆脂蛋白的分类。2.熟悉琼脂糖凝胶电泳的特点和操作要点。3.了解电泳带中脂蛋白显色特点【实验原理实验原理】琼脂在化学上是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物，为一种含硫酸根、琼脂在化学上是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物，为一种含硫酸根、带负电荷的多糖类物质。琼脂是直链多糖，它由带负电荷的多糖类物质。琼脂是直链多糖，它由D-半乳糖和半乳糖和3，6脱水脱水L-半乳糖的残基交替排列组成。半乳糖的残基交替排列组成。琼脂糖主要通过氢键形成凝胶。电泳时，因为凝胶中含水量大（琼脂糖主要通过氢键形成凝胶。电泳时，因为凝胶中含水量大（9899%），近似自由电泳，固体支持物的影响较少，故电泳速度快、区），近似自由电泳，固体支持物的影响较少，故电泳速度快、区带整齐。而且由于琼脂糖不含带电荷的基团，电渗影响很小，是一种带整齐。而且由于琼脂糖不含带电荷的基团，电渗影响很小，是一种良好的电泳材料，分离效果较好。良好的电泳材料，分离效果较好。血清中脂类物质均与载脂蛋白结合成水溶性脂蛋白形式存在。各种脂血清中脂类物质均与载脂蛋白结合成水溶性脂蛋白形式存在。各种脂蛋白所含载脂蛋白的种类及数量不同，因而不同脂蛋白颗粒大小相差蛋白所含载脂蛋白的种类及数量不同，因而不同脂蛋白颗粒大小相差很大。因此，以琼脂糖凝胶为支持物，在电场中可使各种脂蛋白颗粒很大。因此，以琼脂糖凝胶为支持物，在电场中可使各种脂蛋白颗粒分开。分开。琼脂糖凝胶电泳分离血清脂蛋白方法简单。将血清脂蛋白用脂类染料琼脂糖凝胶电泳分离血清脂蛋白方法简单。将血清脂蛋白用脂类染料苏丹黑（或油红等）进行预染。再将预染过的血清置于琼脂糖凝胶板苏丹黑（或油红等）进行预染。再将预染过的血清置于琼脂糖凝胶板上进行分离。通电后，可以看到脂蛋白被分成三条区带，从负极到正上进行分离。通电后，可以看到脂蛋白被分成三条区带，从负极到正极依次为极依次为脂蛋白（最深）、前脂蛋白（最深）、前脂蛋白（最浅）及脂蛋白（最浅）及脂蛋白（比前脂蛋白（比前脂蛋白略深），在原点处应无乳糜微粒。脂蛋白略深），在原点处应无乳糜微粒。【实验器材实验器材】1.电泳仪、电泳槽2.载玻片3.台式离心机【实验操作实验操作】1.预染血清血清0.2ml中加苏丹黑色液0.02ml，混合置37水浴中染色30分钟，离心（2，000转/分）5分钟。2.制备琼脂糖凝胶板将已配制好的0.50%琼脂糖凝胶于水浴中加热融化，用吸管吸取约3ml凝胶溶液浇注在载玻片上，立即放上“桥”，静置待其凝固后，小心取下“桥”。3.电泳将凝胶板平行放入电泳槽中，加样孔端置负极。用四层滤纸于巴比妥缓冲液浸湿，然后轻轻盖贴在凝胶板两端，滤纸的另一端则浸于电泳槽内的巴比妥缓冲液中。接通电源后低压加样，加样完后电压调为120130V。经电泳3550分钟，即可见到分离的区带。4.如果需要保留电泳图谱，可将电泳后的凝胶板放入干胶机中制成干胶片。若无干胶机，可用玻璃纸包好凝胶板（连同载玻片），其上平铺多层吸水滤纸，滤纸上再压上书等重物，吸干凝胶中的水分。也可将凝胶板先放入清水中浸泡脱盐2小时，然后放烘箱（80左右）中烘干，但应陋随时注意温度的变化以及凝胶的脱水程度，以避免凝胶在脱水过程中龟裂。【注意事项注意事项】1.预染血清与温度有关，低温着色慢，高温着色快，37较为适宜。2.浇注琼脂糖凝胶板要尽量使厚薄均一，否则会影响脂蛋白的分离效果。3.将凝胶板放入电泳槽中，应切记与电力线平行、样品端置负极、搭桥滤纸不能搭在样品上。4.制备干胶时，要严控制脱水的温度和速度，避免脱水时温度过高、速度太快引起凝胶收缩龟裂。【思考题思考题】1.琼脂糖凝胶电泳有哪些操作要点？2.在不同的实验方法（超速离心、琼脂糖凝胶电泳、PAGE）中，正常人血清脂蛋白如何分类，电泳后的相对位置及其与超速离心法的对应关系？3.各种脂蛋白的功能？为什么正常人血清脂蛋白电泳时见不到乳糜微粒区带？【正常参考值】乳糜微粒（CM）00%脂蛋白（-LP）（LDL为主）5060%前脂蛋白（Pre-LP）1325%-脂蛋白（LP）（HDL为主）2040%