传染病病原体的诊断技术. .Friend or Foe?RotavirusEbola virusBacteriumAlgaeProtozoanVirus. . .19731973年以来部分新年以来部分新发的的传染病染病l l19731973轮轮状病毒状病毒婴婴儿腹泻的主要病因儿腹泻的主要病因l l19751975细细小病毒小病毒B195B195号病，慢性溶血性号病，慢性溶血性贫贫血的再障危象血的再障危象l l19761976隐孢隐孢子虫子虫隐孢隐孢子虫病，急性小子虫病，急性小肠结肠肠结肠炎炎l l19771977埃博拉病毒埃博拉病毒埃博拉出血埃博拉出血热热l l19771977嗜肺嗜肺军团军团菌菌军团军团病病l l19771977汉汉坦病毒坦病毒肾综肾综合征出血合征出血热热l l19771977空空肠肠弯曲杆菌弯曲杆菌空空肠肠弯曲菌弯曲菌肠肠炎炎l l19771977丁型肝炎病毒丁型肝炎病毒丁型肝炎丁型肝炎l l19801980嗜人嗜人T T细细胞病毒胞病毒I I型型T T细细胞淋巴瘤白血病胞淋巴瘤白血病l l19811981金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌产产毒株毒株中毒性休克中毒性休克综综合征合征l l19821982大大肠肠埃希菌埃希菌O157O157：H7H7出血性出血性结肠结肠炎炎l l19821982嗜人嗜人T T细细胞病毒胞病毒1111型型毛毛细细胞白血病胞白血病l l19821982伯氏疏螺旋体伯氏疏螺旋体莱姆病莱姆病l l19831983人人类类免疫缺陷病毒免疫缺陷病毒艾滋病艾滋病(HIV)(HIV). .1973年以来部分新发的传染病(续)1983 1983 1983 1983 幽幽幽幽门门螺杆菌螺杆菌螺杆菌螺杆菌 消化性消化性消化性消化性溃疡溃疡病病病病1986 1986 1986 1986 环孢环孢子球虫子球虫子球虫子球虫 环环型型型型孢孢子虫病子虫病子虫病子虫病( ( ( (顽顽固性腹泻固性腹泻固性腹泻固性腹泻) ) ) )1988 1988 1988 1988 人疱疹病毒人疱疹病毒人疱疹病毒人疱疹病毒6 6 6 6型型型型 突突突突发发性玫瑰疹性玫瑰疹性玫瑰疹性玫瑰疹1989 1989 1989 1989 丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒 丙型肝炎丙型肝炎丙型肝炎丙型肝炎1990 1990 1990 1990 戊型肝炎病毒戊型肝炎病毒戊型肝炎病毒戊型肝炎病毒 戊型肝炎戊型肝炎戊型肝炎戊型肝炎1992 01391992 01391992 01391992 0139霍乱弧菌霍乱弧菌霍乱弧菌霍乱弧菌 O139O139O139O139霍乱霍乱霍乱霍乱1992 1992 1992 1992 巴巴巴巴尔尔道氏体道氏体道氏体道氏体 猫抓病，杆菌性血管瘤病猫抓病，杆菌性血管瘤病猫抓病，杆菌性血管瘤病猫抓病，杆菌性血管瘤病1993 1993 1993 1993 汉汉坦病毒分离株坦病毒分离株坦病毒分离株坦病毒分离株 汉汉坦病毒肺坦病毒肺坦病毒肺坦病毒肺综综合征合征合征合征1994 Sabia1994 Sabia1994 Sabia1994 Sabia病毒病毒病毒病毒 巴西出血巴西出血巴西出血巴西出血热热1994 1994 1994 1994 新新新新变变异型克雅氏病异型克雅氏病异型克雅氏病异型克雅氏病( ( ( (人人人人类疯类疯牛病牛病牛病牛病) 1985) 1985) 1985) 1985年年年年疯疯牛病（牛海牛病（牛海牛病（牛海牛病（牛海绵绵状状状状脑脑炎炎炎炎BSEBSEBSEBSE） -1994-1994-1994-1994年出年出年出年出现现首例首例首例首例nvCJD-1996nvCJD-1996nvCJD-1996nvCJD-1996年提出年提出年提出年提出nvCJDnvCJDnvCJDnvCJD概念概念概念概念 病原病原病原病原为朊为朊蛋白蛋白蛋白蛋白PrPPrPPrPPrP（英）（英）（英）（英）1995 1995 1995 1995 庚型肝炎病毒庚型肝炎病毒庚型肝炎病毒庚型肝炎病毒 庚型肝炎庚型肝炎庚型肝炎庚型肝炎1997 H5N11997 H5N11997 H5N11997 H5N1禽流感病毒禽流感病毒禽流感病毒禽流感病毒 人禽流感人禽流感人禽流感人禽流感1998 Nipah1998 Nipah1998 Nipah1998 Nipah病毒病毒病毒病毒 尼巴病毒性尼巴病毒性尼巴病毒性尼巴病毒性脑脑炎炎炎炎1999 1999 1999 1999 西尼西尼西尼西尼罗罗病毒病毒病毒病毒 西尼西尼西尼西尼罗罗病毒性病毒性病毒性病毒性脑脑炎炎炎炎2000 2000 2000 2000 裂谷裂谷裂谷裂谷热热(Rift Valley)(Rift Valley)(Rift Valley)(Rift Valley)病毒病毒病毒病毒 裂谷裂谷裂谷裂谷热热2003 SARS2003 SARS2003 SARS2003 SARS冠状病毒冠状病毒冠状病毒冠状病毒 SARSSARSSARSSARS（传传染性非典型肺炎）染性非典型肺炎）染性非典型肺炎）染性非典型肺炎）. .l大部分人类致命性疾病均是由动物传播，包括现正肆虐全球的禽流感。l每年至少有一种新病原体，包括病毒、细菌、寄生虫、原生动物和真菌等从动物传染给人类。l前所未有的速度产生突变，并传给人类，就如艾滋病、马尔堡出血热、SARS以及现正肆虐全球的禽流感等难抗病毒。l研究人员分辨1407种令人类生病的病原体，发现其中至少800种越过种物界线，由动物传至人类。 新新发传染病染病动物物传播播. .与人类行为及环境的改变有关l l过过去去2525年来曾出年来曾出现现3838种新病原体种新病原体袭击袭击人人类类，其中，其中四分三四分三为为源自源自动动物的疾病，包括艾滋病、物的疾病，包括艾滋病、马尔马尔堡堡出血出血热热、SARSSARS及禽流感等。及禽流感等。l l丛丛林打林打猎猎、密集耕种、全球、密集耕种、全球变变暖及暖及长长途旅行的普途旅行的普及，增加疾病跨种物及，增加疾病跨种物传传播的机会，使播的机会，使动动物身体上物身体上的病原体容易的病原体容易产产生突生突变变，感染人，感染人类类。l l一个典型例子是艾滋病毒，最初原是在非洲猿猴一个典型例子是艾滋病毒，最初原是在非洲猿猴身上身上发现发现的一种病毒，其后的一种病毒，其后传传播至人播至人类类身上，更身上，更演演变变成世成世纪绝纪绝症。症。. .新病原体的特征l l现时人类新传染病的病原体，多属于核糖核酸(RNA)病毒类，包括艾滋病毒及流感病毒，可于短时间内发生突变，并容易适应新宿主，令跨种物传播机会变得更大。. .人人类与与传染病染病较量中的四方面重大量中的四方面重大突破突破隔离检疫制度的建立;病原微生物的发现;特效药物的出现;疫苗的诞生. .快速诊断是关键l l在人类与传染病的斗争中，诊断、治疗和预防是三个关键环节。其中，及时正确诊断最为关键，是有效治疗的基础，也是制定预防策略的依据。l l及时发现、有效鉴别、快速诊断和提出预警，这是现代传染病防治体系的最前沿对对已知已知已知已知传传染病要尽快明确染病要尽快明确染病要尽快明确染病要尽快明确诊诊断断断断 对对未知新未知新未知新未知新发传发传染病要染病要染病要染病要查查病因病因病因病因. .传染病的实验室诊断断n n一般检查;n n生化检查;n n病原学检查;n n免疫学检查;n n病理组织检查;n n影像学检查. .传统的和常规的病原学诊断断l l分离培养(细胞,组织动物);l l显微镜检查(光学和电子显微镜);l l抗原成分检测(ELISA,免疫荧光等);l l分子生物学基因诊断(核酸杂交,PCR等);. .ElectronmicrographsAdenovirusRotavirus(courtesy of Linda Stannard, University of Cape Town, S.A.). .免疫荧光检测Positive immunofluorescence test for rabies virus antigen. (Source: CDC)(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital). .细胞病胞病变效效应(cpe)l lSomeviruseskilltheSomeviruseskillthecellsinwhichtheycellsinwhichtheyreplicate,ofteneasilyreplicate,ofteneasilyvisibleascpe,othervisibleascpe,othervirusesproducelittlevirusesproducelittleornocpeornocpel lTypicallyroundingorTypicallyroundingordetachingofcellsanddetachingofcellsandcellfusion(syncytia)cellfusion(syncytia)From Principles of Virology , Flint et al ASM pressFromPrinciplesofVirology,FlintetalASMpress. .实验动物物LaboratoryanimalsLaboratoryanimals-animalmodelsofhumaninfection.-animalmodelsofhumaninfection.HistoricallytheonlywaytostudyviruseswasfromanimaltoHistoricallytheonlywaytostudyviruseswasfromanimaltoanimal.animal.l lProblems-1)inconvenientandexpensive,2)notadefinedProblems-1)inconvenientandexpensive,2)notadefinedsystem-leadstogenerationofvirusmutants,3)animalwelfaresystem-leadstogenerationofvirusmutants,3)animalwelfareissues,issues,l lAdvantages-1)somevirusescanonlybestudiedinthisway,2)Advantages-1)somevirusescanonlybestudiedinthisway,2)givesuniqueinsightintoviruspathogenesisgivesuniqueinsightintoviruspathogenesisl lEmbryonatedeggsEmbryonatedeggsFromPrinciplesofVirology,FlintetalASMpress. .核酸诊断的发展史l l核酸分子核酸分子核酸分子核酸分子杂杂交交交交l l聚合聚合聚合聚合酶链酶链反反反反应应（PCRPCR）l l核酸定量分析核酸定量分析核酸定量分析核酸定量分析核酸的直接核酸的直接检测检测核酸核酸扩扩增增检测检测(PCR)(PCR)定性定性PCRPCR定量定量PCRPCR. .11核酸分子核酸分子杂交交(nucleic acid molecula hybridization)genomeprobe32P 35S 3H 125I 生物素生物素 地高辛地高辛 酶genomegenomegenomeprobeprobeprobe检测方法：放射自方法：放射自显影影 底物底物显色色 化学化学发光光. .常用核酸分子常用核酸分子杂交技交技术斑点斑点杂交（交（spot blot hybridization)凝胶凝胶电泳印迹泳印迹转移移杂交（交（Southernblothybridization)原位原位杂交（交（in-situhybridization). .聚合聚合酶链反反应（PCR）基本步基本步骤和原理和原理变性（高温）性（高温）退火（低温）延伸（适温）延伸（适温）每一循每一循环模模 板板引物引物引物引物dATP dGTP dTTP dCTP Taq酶. .PCR原理和步原理和步骤. .定量PCR-荧光实时定量PCRl lTaqman水解探水解探针法法l l杂交双探交双探针法法l l分子信分子信标（环性探性探针）法）法l l Amplisensor能量能量转换法等法等. .新发传染病的病原体？. .病原学病原学发现的的“科赫三定律科赫三定律”一、每种传染病必定能发现其病原体；二、能培养出该病原体的纯种；三、以培养出的纯种病原体接种于动物可以产生相同的病变。. .建立该病原体的鉴定方法动物试验临床实验室诊断流行病学研究等分离到该病原体确定一种疾病病原体的基本步确定一种疾病病原体的基本步骤最终确定病原体与疾病的病因学关系. .基本思路回答两个问题：l l是否是已知的病原体或其变种？l l是否是完全未知的一种病原体？基本要求：快、准. .已知病原体的快速诊断高通量的检测技术. .高通量的病原体高通量的病原体筛选技技术病原体核酸的高通量检测技术一：多重PCR（联用技术：质谱技术、液相芯片技术）技术二：病原体基因芯片病原体抗原或抗体的高通量检测核心技术：蛋白质芯片. .MultiplexPCR-MassTagsystem多重 PCR-质谱联用技术. .美国哥伦比亚大学Lipkin 研究组发明了一种基于multiplex PCR-MassTag（多重PCR与质谱联用）的高通量病原体快速筛选技术。优点：由于使用光敏感的分子量标签，增强了multiplex PCR引物设计的适应性和灵活性，使检测通量有大幅度的提高。应用质谱分析PCR产物上的分子量标签克服了凝胶电泳分辨率的局限或荧光染料种类的局限。. .1.PCRamplificationwithconjugatedprimers90minutesB BA A2.PCRpurificationonfilterplate30minutes3.Elutioninto96-wellloadingplateformassspectrometeranalysis96-wellthermocyclerplate96-wellthermocyclerplateB BA A4.Automatedsampleinjection,photocleavageanddetection1:30minutes/samplePurifiedsamplesPurifiedsamplesUltravioletLightCleavageofmasstagsfromampliconCleavageofmasstagsfromampliconMSMSB BA AB BA AB BA AB BA A B BA AB BA AIonizationanddetectionIonizationanddetectionA AB BA AB BMassSizeMassSizeA Ab bu un nd da an nc ce e5.IdentificationofpathogenbysignalanalysisPCR-MassTagsystem. .NUCLEICACIDCONJUGATEDMASSTAGSPhotocleavablelinkerandspacerMSsensitivityenhancerVariablemassunit . .DETECTIONOF58DIFFERENTMASSTAGSBYAPCI-MS. .目前，建立在此技术上的有呼吸道病原体检测模块（包括19个病毒和3种细菌），流感病毒亚型检测模块，出血热病原体检测模块，痘疹病毒检测模块和脑炎脑膜炎病原体检测模块。尽管目前已开发的分子量标签只有64个，但根据质谱分析的分子量范围，还可有极大的拓展空间，保证了这一技术具有足够的发展前景和潜力。 应 用. .RESPIRATORYSYNDROMEPANELl lInfluenzaAMatrixInfluenzaAMatrixl lInfluenzaAN1InfluenzaAN1l lInfluenzaAN2InfluenzaAN2l lInfluenzaAH1InfluenzaAH1l lInfluenzaAH2InfluenzaAH2l lInfluenzaAH3InfluenzaAH3l lInfluenzaAH5InfluenzaAH5l lInfluenzaBHAInfluenzaBHAl lRSVGroupARSVGroupAl lRSVGroupBRSVGroupBl lMetapneumovirusMetapneumovirusl lEuropeanstrainsEuropeanstrainsl lAmericanstrainsAmericanstrainsl lCoV-SARSCoV-SARSl lCoV-OC43CoV-OC43l lCoV-229ECoV-229El lHPIV-1HPIV-1l lHPIV-2HPIV-2l lHPIV-3HPIV-3l lHPIV-4HPIV-4l lHPIV-4aHPIV-4al lHPIV-4bHPIV-4bl lChlamydia pneumoniaeChlamydia pneumoniael lMycoplasma pneumoniaeMycoplasma pneumoniael lLegionella pneumophilaLegionella pneumophilal lStreptococcus pneumoniaeStreptococcus pneumoniael lHaemophilus influenzaeHaemophilus influenzael lInfluenzaAH7InfluenzaAH7l lRhinovirusRhinovirusl lHerpesSimplexVirus1,2HerpesSimplexVirus1,2l lVaricellaZosterVirusVaricellaZosterVirusl lCytomegalovirusCytomegalovirusl lHIV-1HIV-1l lHIV-2HIV-2l lMeaslesvirusMeaslesvirusl lMycobacterium Mycobacterium tuberculosistuberculosisl lPneumocystis cariniiPneumocystis cariniil lCoxiella burnettiCoxiella burnettiCurrentRespiratoryPanelInProgressEnterovirusAdenovirus. .HEMORRHAGICFEVERPANELl lEbolavirus(Zaire)Ebolavirus(Zaire)l lEbolavirus(Sudan)Ebolavirus(Sudan)l lMarburgvirusMarburgvirusl lCrimean-CongoCrimean-Congohemorrhagicfeverhemorrhagicfevervirusvirusl lRiftValleyvirusRiftValleyvirusl lHantaanvirusHantaanvirusl lSeoulvirusSeoulvirusl lYellowFeverYellowFeverl lKyasanurForestKyasanurForestvirusvirusl lLassavirusLassavirusl l(lineageIV)(lineageIV)l lEbolavirus(Reston)Ebolavirus(Reston)l lJuninvirusJuninvirusl lMachupovirusMachupovirusl lDobravavirusDobravavirusl lTacaribevirusTacaribevirusl lGuanaritovirusGuanaritovirusl lSabiavirusSabiavirusl lLCMVLCMVl lChikungunyavirusChikungunyavirus l lDenguevirusgroupDenguevirusgroupl lBorrelia burgdorferiBorrelia burgdorferil lHerpesSimplexvirus(1,2)HerpesSimplexvirus(1,2)l lHIV-1,-2HIV-1,-2l lNeisseria meningitidisNeisseria meningitidisl lRickettsiaSpottedFeverGroupRickettsiaSpottedFeverGroupl lPlasmodiumspPlasmodiumspCurrentPanelInProgress. .ACBLabNetworkEpidemiology Microbiology research service traininginfectiousagentssamplesclinical dataGLOBAL SURVEILLANCE NETWORK Animal modelsdrugsvaccinesDrosten,HamburgLipkin,NewYorkMackenzie,PerthPauli,BerlinPeiris,HongKongQian,BeijingPerez-Brena,MadridSwanepoel,SouthAfricaWebster,MemphisWen,Shanghai. .MultiplexPCR-XMAP多重PCR-液芯联用技术. .DiagramLUMINEXXMAP技技术：多：多指指标并行并行检测系系统（流式（流式荧光技光技术或液芯技或液芯技术）技技术GENOCATemplexPCR技技术:多指多指标并行并行扩增增. .SuperPrimerTemplexPCR技技术原理原理. .TemplexPCR技技术原理原理. .l l巢示巢示PCRPCR引物提高了引物引物提高了引物间间的相容性的相容性l l低低浓浓度的特异性引物降低了反度的特异性引物降低了反应过应过程中的程中的背景背景值值. .l l仅仅有的一条生物素有的一条生物素标记标记的引物使得更容易的引物使得更容易扩扩大生大生产产以及以及质质量控制量控制. . .流式流式荧光技光技术（液芯）原理（液芯）原理XMAP荧光编码微球技术. .每种微球的地址由两每种微球的地址由两种种红色色荧光光颜料的料的掺入比例唯一决定入比例唯一决定颜色色编码的微球的微球. .共价交共价交联联技技术术CONH. .反反应应模式模式. .Multiplex Assays with Color Separetion. .Luminex100多功能流式点多功能流式点阵仪流式流式荧光光检测仪. .呼吸道感染型11种DNA基因组的病原体. .呼吸道感染型13种RNA基因组病毒型病原体. .蛋白质芯片MASATM液相芯片液相芯片. .一. 基本原理微小的乳胶颗粒（Beads,微球）分别染成不同的荧光色，然后再把针对不同检测物的蛋白（如抗原抗体）以共价方式结合到特定颜色的微球上。应用时，先把针对不同检测物的、用不同颜色编码的微球混合，再加入被检测物（被测物可以是血清中的抗原、抗体、或酶等）。. .固定生物分子的微球. .悬悬浮点浮点阵阵多分析物多分析物组组合灵活合灵活. .The Red Laser is Used to Identify the Bead CodeThe Green Laser is Used to Identify the Reporter Signal. .液相芯片的特点：液相芯片的特点：液相芯片的独特液相芯片的独特设计使得它使得它拥有常有常规的蛋白的蛋白质检测方法所不具方法所不具备的特点：的特点：1.重复性好重复性好2.通量大通量大可可对同一同一样本中的多种不同目的分本中的多种不同目的分子同子同时进行分析在行分析在35-60分分钟内可内可对96个个不同不同样本本进行行检测。. .3.灵活性好4.灵敏度高5.信噪比好6.操作简便，不需洗涤，耗时短 7.液相环境更有利于保持蛋白质的 天然构象，也更有利于探针和被 检测物的反应. .HybridizationTime% of MaximumMinutesMinutes. . MASAMASATM和ELISA灵敏度的比较. .基因芯片（基因芯片（Gene ChipGene Chip） 何何谓基因芯片：基因芯片：基因芯片（或DNA Chip,或Microarray）又称DNA微阵列，是指固定在固相载体上的高密度DNA微点阵。即将大量靶基因或寡核苷酸片段有序地，高密度地（点与点间距一般小于500m） 排列在玻璃、硅等载体上，称之为基因芯片。基因芯片的种基因芯片的种类： 按应用，基因芯片主要可分为3类：1、表达谱基因芯片：主要用于基因功能研究；2、诊断基因芯片：如肝癌诊断芯片、糖尿病诊断芯片、病原体多基因诊断芯片等：3、检测芯片：如商品检疫芯片、病原体检测芯片等。. .ViralPathogenCustomMicroarray病原体诊断基因芯片. . .HighSensitivityScannerl l0.050.05CPSMCPSMl lCPSM-whatdoesitmean?CPSM-whatdoesitmean?l lChromphorespersquaremicronChromphorespersquaremicronl l0.05cpsmor5moleculesofdyeper100.05cpsmor5moleculesofdyeper10micronpixel.micronpixel.l lCompetitorsbestis10moleculesofdyeCompetitorsbestis10moleculesofdyeper10micronpixel.per10micronpixel.l lToachievehighsensitivity:Toachievehighsensitivity:l lDynamicAutofocusDynamicAutofocusl lLaserstabilityControlLaserstabilityControll lHighresolutionscanningHighresolutionscanning0.05CPSMDetect5dyemoleculesin10umpixel0.1CPSMDetect10dyemoleculesin10umpixel. .eArrayDeliveringCustomContentandFormatsBackNameYourDesignSelectArrayFormat. .ProkaryoticArrayCustomDesignsAgrobacteriumAnopheles(AG)andPlasmodium(PB).ie.malariamicroarrayArchaeon,Halobacteriumsp.BacilluscereusBacterialpathogensBifidobacteriumlongumBordetellaPertussisChlamydophilaabortusCulexpipiensCyanobacteriumSynechocystisE.ColiErwiniacarotovoraatroseptica/SolanumtuberosumLactobacillusplantarumMethylobacteriumextorquensAM1PlasmodiumfalciparumPseudomonasaeruginosaS.aureus;N.meningococcus;E.coliSalmonellatyphimuriumStaphylococcusaureus. .SARS Coronavirus. .Human Coronavirus OC43. .Human Coronavirus 229E. .GreeneChip 1.1CATCTCATCTGGTGGGTGTGGATGGAAGCCAGCCTTATCTTATCGGAAGGAACAAGCAAGGACCGACCAGAGAGAGCCACCCACCTGGCTGGGCTGGCTGAGAAAGAACATCTCATCTA ASample:WNVNY99100,000RNAcopies/ml32/45tophitsareWNV-specific;remainderareJEVgrouporotherflavivirus-genusprobesCollaborationbetweentheGreeneLaboratoryofColumbiaUniversity,ICTV,NortheastBiodefenseCenter,andAgilentCorporation. .CATCTCATCTGGTGGGTGTGGATGGAAGCCAGCCTTATCTTATCGGAAGGAACAAGCAAGGACCGACCAGAGAGAGCCACCCACCTGGCTGGGCTGGCTGAGAAAGAACATCTCATCTA ASample:SARS-CoV100,000RNAcopies/mlGreeneChip 1.1Columbia(Briese,Lipkin,Liu,LussierPalacios),ICTV(Bchen-Osmond),andAgilent(Hirschberg)251,000sequencedatabase,1710vertebrateviruses. .未知新病原体的发现. .发现新病毒的主要技术路线表达表达cDNAcDNA文文库筛选库筛选技技术术宽宽范范围围PCRPCR（基于保守序列的（基于保守序列的PCRPCR）差异差异显显示技示技术术： 代表性差异分析（代表性差异分析（RDARDA） 抑制性消减抑制性消减杂杂交（交（SSHSSH）序列非依序列非依赖赖的的扩扩增：增： 随机随机PCRPCR（randome PCRrandome PCR） 序列非依序列非依赖赖的的单单引物引物扩扩增（增（SISPASISPA）. . .cDNA文库筛选ppcDNAcDNA文文库筛选库筛选常被用来常被用来检检出出RNARNA病毒的核酸。病毒的核酸。pp收集病毒收集病毒颗颗粒（感染粒（感染组织组织匀匀浆过滤浆过滤，或者血，或者血浆浆超速超速离心以收集病毒离心以收集病毒颗颗粒），提取粒），提取RNARNA，逆，逆转录转录成成ccDNA,DNA,构成构成cDNAcDNA表达文表达文库库。pp最常用的表达型最常用的表达型载载体是体是gt11,gt11,插入的插入的cDNAcDNA片断可片断可以融合蛋白形式表达，保留抗原性。以融合蛋白形式表达，保留抗原性。pp病毒在感染病毒在感染过过程刺激机体程刺激机体产产生特异性抗体，因而常生特异性抗体，因而常用患者恢复期的血清用患者恢复期的血清对对cDNAcDNA库进库进行免疫学行免疫学筛选筛选。. .HCV的发现pp19891989年年ChooChoo等小等小组组pp从被感染的黑猩猩的血从被感染的黑猩猩的血浆浆中用超离心的方法收集病毒中用超离心的方法收集病毒颗颗粒，粒，提取核酸（包括提取核酸（包括RNARNA和和DNADNA），充分），充分变变性后逆性后逆转录转录cDNAcDNA，构建，构建gt11cDNAgt11cDNA表达文表达文库库。pp用慢性非甲非乙肝炎患者的血清用慢性非甲非乙肝炎患者的血清筛选库筛选库，结结果得到一个反果得到一个反应应性克隆。性克隆。pp该该cDNAcDNA克隆与正常人的克隆与正常人的DNADNA不不杂杂交，交，说说明他来源于外源明他来源于外源基因基因组组。pp与被感染黑猩猩的肝与被感染黑猩猩的肝组织组织RNARNA杂杂交，与未感染黑猩猩的肝交，与未感染黑猩猩的肝组织组织RNARNA不不杂杂交，提示交，提示该该因子可能就是因子可能就是输输血相关肝炎的一血相关肝炎的一种致病因子。种致病因子。pp发现该发现该cDNAcDNA克隆克隆仅仅与被感染黑猩猩的肝与被感染黑猩猩的肝组织组织RNARNA杂杂交，交，而与而与DNADNA不不杂杂交，提示交，提示该该因子是一种因子是一种RNARNA病毒。序列分析病毒。序列分析表明属于黄病毒科，命名表明属于黄病毒科，命名为为HCVHCV。. .基于保守序列的聚合酶链式反应（ConsensusSequenceBasedPCR）l l基本原理：基于保守序列的聚合基本原理：基于保守序列的聚合酶链酶链式反式反应应（以（以下下简简称保守序列称保守序列PCRPCR）就是通）就是通过过已知的一种生物已知的一种生物和另一种生物之和另一种生物之间间高度保守的高度保守的DNADNA序列序列设计设计引物，引物，用用PCRPCR的方法去的方法去扩扩增另一种生物的未知增另一种生物的未知DNADNA序列。序列。当一种未知病毒与可能与另一种已知的病毒相似当一种未知病毒与可能与另一种已知的病毒相似时时，可以根据已知病毒的保守序列，可以根据已知病毒的保守序列设计设计引物，然引物，然后用后用PCRPCR方法方法扩扩增出未知病毒的相增出未知病毒的相应应序列。序列。. .新型汉坦病毒的发现l l19931993年年5 5月，在美国西南部爆月，在美国西南部爆发发了一了一场场高死亡率高死亡率的急性呼吸道疾病。血清学的急性呼吸道疾病。血清学试验试验中中发现发现。病人的。病人的血清能与一些已知的血清能与一些已知的汉汉坦病毒抗原起交叉反坦病毒抗原起交叉反应应，提示提示该该病的病原体有可能是一种以前未能病的病原体有可能是一种以前未能发现发现的的新新汉汉坦病毒。坦病毒。l l19931993年年NicholNichol等根据已知的等根据已知的汉汉坦病毒基因坦病毒基因组组MM片片断的包膜糖蛋白断的包膜糖蛋白G2G2编码编码区的保守部位区的保守部位设计设计了了PCRPCR引物，引物，扩扩增出一个增出一个278bp278bp的的DNADNA片断。序列分析片断。序列分析表明，与其他个血清型的表明，与其他个血清型的汉汉坦病毒至少有坦病毒至少有30%30%的的不同源性，在系不同源性，在系统发统发生上与生上与IVIV型希望山病毒型希望山病毒（ProspectHillvirus,PHProspectHillvirus,PH）最）最为为接近，接近，说说明明该该病病毒是一种新的毒是一种新的汉汉坦病毒。坦病毒。. .基于保守序列的PCRl l技技术术要点要点-引物引物设计设计一种是一种是简简并并PCRPCR，其所用的是一个混合的引物，其所用的是一个混合的引物库库，包含了已知某种病毒高度保守氨基酸区域的所有包含了已知某种病毒高度保守氨基酸区域的所有可能的核苷酸序列可能的核苷酸序列 （设计设计引物之前，列出引物之前，列出该该病毒病毒家族所有成家族所有成员员的的对对比比图图 ），但），但简简并度很高并度很高时时有效有效引物的引物的浓浓度不足。度不足。另一种是根据密另一种是根据密码码子的子的偏向性偏向性设计设计单单一的引物一的引物：依照高度保守的氨基酸序列，依照高度保守的氨基酸序列，选择选择每个氨基酸最每个氨基酸最常用的密常用的密码码子子组组成一条完整的引物。适用于分离成一条完整的引物。适用于分离亲缘亲缘关系关系较较近的相关序列，但近的相关序列，但对亲缘对亲缘关系关系较远较远的的序列序列则则不能不能检检出。出。 . .简并引物设计l l目前已经可以有计算机软件来设计，常用的软件有:PrimoDegenerate3.4GenefisherCODEHOPSimpledegenerateprimer(U:Oregon). .差异显示技术（differentialdisplay)l l最先是Liang和Pardee等提出用于比较两种细胞或同种细胞在不同状态下mRNA表达差异的技术;l l现在已经发展了多种分离和鉴定差别表达基因的技术，其中代表性差异技术(RDA)和抑制消减杂交技术(SSH)以其灵敏度高、假阳性率低和重复性好而相对更受欢迎. .代表性差异分析（RepresentationalDifferenceAnalysis,RDA）l l基本原理：病原微生物感染靶器官或组织时，同时带入自己的基因组，这样病理组织就比正常组织多出了病原体基因组。RDA可以把单拷贝的外源基因组从高度复杂的人染色体DNA本底中检测出来。. .RDA流程分分别别提取提取实验组实验组(Tester)(Tester)和和对对照照组组(Driver(Driver或或驱动驱动子子) )的的总总RNARNA或者或者DNADNA用四碱基内切用四碱基内切酶酶充分充分酶酶切，分切，分别连别连上上寡核苷酸接寡核苷酸接头头，并用特异性的接，并用特异性的接头头引引物物扩扩增增扩扩增增产产物去除接物去除接头头，再在，再在实验组扩实验组扩增增子上子上连连上新接上新接头头，将两份，将两份扩扩增子增子杂杂交，交，以新接以新接头为头为引物引物进进行行扩扩增增只有那些未能与只有那些未能与驱动扩驱动扩增子增子杂杂交而自交而自身退火的身退火的样样品品DNADNA的两端因都能与引的两端因都能与引物配物配对对才以指数形式才以指数形式扩扩增，而待增，而待检样检样品品单链单链DNADNA和和驱动样驱动样品品DNADNA只有一端只有一端与引物配与引物配对对而而线线性性扩扩增增 . .GBV病毒的发现ppGBGB肝炎是肝炎是DeinhardtDeinhardt等在等在19701970年首先年首先报报道。后研道。后研究表明究表明GBGB肝炎因子不同于甲肝炎因子不同于甲- -戊型肝炎病毒。戊型肝炎病毒。pp19951995年年SimonsSimons等用等用GBGB肝炎因子感染肝炎因子感染狨狨猴取同一猴取同一狨狨猴感染前和感染后急性期的血猴感染前和感染后急性期的血浆浆，分，分别别提取提取总总RNARNA，逆，逆转录转录成成cDNAcDNA作作RDARDA分析，分析，7 7个个cDNAcDNA克克隆序列分析表明，属于两种黄病毒，与隆序列分析表明，属于两种黄病毒，与HCVHCV有一有一定同源性命名定同源性命名为为GBV-AGBV-A和和GBV-BGBV-B。. .RDA的缺点其本身不能消除不同mRNA分子丰度的差异,因而往往需要进行多轮杂交而每轮杂交都涉及到接头的连接和去除效率问题以及绿豆核酸酶消化去除单链等操作. .抑制性消减杂交技术（SSH）l l19961996年年DiatchenkoDiatchenko等将抑制性等将抑制性PCRPCR和减法和减法杂杂交交结结合起来，合起来，创创立了立了SSHSSH技技术术。l l该该技技术术通通过过接接头头特异性的引物特异性的引物选择选择性地性地扩扩增差异增差异表达基因片段的同表达基因片段的同时时，可以抑制非靶片段的，可以抑制非靶片段的扩扩增。增。l l利用利用杂杂交二交二级动级动力学原理巧妙地在减法力学原理巧妙地在减法杂杂交交过过程程中消除了不同中消除了不同mRNAmRNA分子分子间间丰度的差异，因而通丰度的差异，因而通过过一次减法一次减法杂杂交可将差异片段富集交可将差异片段富集10001000倍以上。倍以上。一般只需两一般只需两轮杂轮杂交，交，3-43-4天即可得到几十或上百个天即可得到几十或上百个差异片段差异片段 . .SSH的基本步骤. .RDA与SSHl l原理相似：都是建立在PCR技术和减法杂交的基础上。RDA是先对样品的cDNA进行扩增再杂交，而SSH则是先减法杂交再扩增。两者都具有高效、重复性好、阳性率高等优点。l l共同的缺点：由于驱赶子和待检测的标本的背景往往不完全相同，富集的差异片段可能不是微生物学鉴别的有用标记。. .最新的技术序列非依赖的扩增法：l l随机PCR(randomPCR)技术l l序列非依赖的单引物扩增(SISPA:sequenceindependentsingleprimeramplification）. .RandomPCRl l基本原理：在合成随机引物基本原理：在合成随机引物时时在其加上一个相同的接在其加上一个相同的接头头，这这个接个接头头含有一个限制性的含有一个限制性的酶酶切位点可以便于随切位点可以便于随后的片断克隆后的片断克隆进载进载体，然后体，然后对对插入序列插入序列测测序并序并进进行行BLASTBLAST比比对对即可初步即可初步获获得未知病毒的种系来源信息。得未知病毒的种系来源信息。这这种随机种随机PCRPCR法不法不仅仅可以可以检检出出DNADNA病毒也可以病毒也可以检检出出RNARNA病毒。病毒。l l利用利用这这种方法种方法AllanderAllander等在等在20052005年在呼吸道感染的年在呼吸道感染的标标本中本中发现发现了一种人的了一种人的parvovirusparvovirus；l lStangAStangA等也在等也在20052005年使用年使用这这种方法在慢性疲种方法在慢性疲劳综劳综合合症的病人漱口液中意外症的病人漱口液中意外检测检测出了出了HSV-1HSV-1型病毒。型病毒。 . .SISPAl lSISPASISPA是是单单引物引物扩扩增法中最常用的一种方法，用于增法中最常用的一种方法，用于鉴鉴定低定低浓浓度的未知序列的病毒核酸。度的未知序列的病毒核酸。l l基本原理：基本原理：对对基因基因组组DNADNA常用常用识别识别四个碱基的四个碱基的酶酶先切割，先切割，然后在双然后在双链链核酸片段的两端核酸片段的两端连连接上一个相同序列的接接上一个相同序列的接头头（adaptoradaptor），），这这个接个接头头可作可作为为随后随后PCRPCR反反应应的引物，的引物，进进行行单单引物引物扩扩增。通增。通过过将将这这些些产产物克隆即可物克隆即可进进行行测测序。序。l lSISPASISPA有很多的衍生方法，主要是通有很多的衍生方法，主要是通过对过对引物引物进进行修行修饰饰如如引入引入酶酶切位点、切位点、单链单链接接头头或者平或者平头头、粘性末端；或者是未、粘性末端；或者是未知的病原的核酸通知的病原的核酸通过过不同的不同的酶进酶进行切割，所得片断的两端行切割，所得片断的两端引入不同的接引入不同的接头头以提高以提高扩扩增的特异性。增的特异性。l lSISPASISPA的的检测检测低限是低限是10106 6个拷个拷贝贝/ml/ml，而它的灵敏度取决于，而它的灵敏度取决于临临床床标标本的种本的种类类以及未知病毒的属性。以及未知病毒的属性。 . .RDA和SISPApp随机随机PCRPCR方法和方法和SISPASISPA是未知病毒是未知病毒检测检测中操作相中操作相对对比比较简单较简单的方法，通的方法，通过过序列非依序列非依赖赖的的扩扩增即可增即可扩扩增出大量的病毒基因片段，增出大量的病毒基因片段，pp但但实际实际操作操作过过程中会有很多的假阳性，主要是因程中会有很多的假阳性，主要是因为为接接头头或随机引物的可以非特异性或随机引物的可以非特异性结结合合试剂试剂中存中存在的一些核酸（在的一些核酸（污污染源）。染源）。ppSISPASISPA相相对对于随机于随机PCRPCR存在接存在接头连头连接效率的接效率的问题问题。ppSISPASISPA和随机和随机PCRPCR方法的缺点是都很耗精力，因方法的缺点是都很耗精力，因为为必必须须分析很多个克隆，才可能找到所需要的病分析很多个克隆，才可能找到所需要的病原体基因。原体基因。. .方法关键环节优点缺点cDNA文库筛选构建文库适用范围广过程繁琐，工作量大，需筛选大量的克隆基于保守序列的PCR引物的选择简便高效局限于检测同源性相近的未知病毒代表性差异分析基于PCR技术的消减杂交非常灵敏不能消除不同mRNA丰度的差异，需多轮杂交，涉及接头连接和去除的效率，技术难抑制性消减杂交差异杂交的cDNA消减重复性高灵敏度低，不易检测低丰度基因SISPA接头与片断的连接、克隆筛选适用范围广易受试剂中的核酸污染，工作量大，需筛选大量的克隆随机PCR法克隆筛选、减少污染适用范围广、简便易受试剂中的核酸污染，工作量大，需筛选大量的克隆芯片芯片的设计通量大成本高，无法克服保守的同源序列及重序对杂交信息的干扰滚环扩增法滚环复制高效只适合于环状病毒. .实战举例传统病原学检测方法与最新技术的联合应用. .A Novel Coronavirus AssociatedA Novel Coronavirus Associatedwith Severe Acute Respiratory Syndromewith Severe Acute Respiratory Syndromevirus-isolation techniques electron-microscopical histologic studiesMolecular and serologic assays. . . .Primer pair IN-2 (+) 5GGGTTGGGACTATCCTAAGTGTGA3IN-4 () 5TAACACACAACICCATCATCA3conserved regions of open reading frame 1bA 405-nucleotide segment. .The Genome sequence of the SARS-associated coronavirus Science 300 (5624), 1399-1404 (2003) Virus isolation ( bronchoalveolar lavage specimen)Viral particles were purified,genetic material (RNA) was extractedRNA was converted to cDNA by random-priming and oligo(dT) primings trategy Size-selected cDNA products were cloned single sequence reads Sequences were assembledRapid amplification of cDNA ends RACE to capture the 5 end of the viral genome. .病毒性感染样本（咽拭子，痰，肺泡灌洗液，脑脊液）保存活病毒样本核酸抽提、逆转录多重PCR扩增和质谱分析阳性阴性部分样品进行病毒培养阴性阳性部分样品进行基因芯片检测阴性阳性病毒扩增，电子显微镜观察，病毒核酸的分子克隆，序列的比对，进化分析以及基因功能的初步探讨。DNaseI处理-Random PCR克隆扩增DNA，大规模测序，核酸序列比对，进化树分析。不明原因感染的病原体不明原因感染的病原体筛查系系统. .谢谢！. .