核磁共振新技术及其应用核磁共振新技术及其应用核磁共振概述核磁共振新技术及应用概述核磁共振的方法与技术作为分析物质的手段，由于其可深入物质内部而不破坏样品，并具有迅速、准确、分辨率高等优点而得以迅速发展和广泛应用，已经从物理学渗透到化学、生物、地质、医疗以及材料等学科，在科研和生产中发挥了巨大作用。核磁共振是1946年由美国斯坦福大学布洛赫(F.Bloch)和哈佛大学珀赛尔(E.M.Purcell)各自独立发现的，两人因此获得1952年诺贝尔物理学奖。60多年来，核磁共振已形成为一门有完整理论的新学科。12位因对核磁共振的杰出贡献而获得诺贝尔奖科学家1944年I.Rabi1952年F.Block1952年E.M.Purcell1955年W.E.Lamb1955年P.Kusch1964年C.H.Townes1966年A.Kastler1977年J.H.VanVleck1981年N.Bloembergen1983年H.Taube1989年N.F.Ramsey1991年R.R.Ernst核磁共振光谱：核磁共振光谱：以频率为兆赫级、波长很长、能量很低的电磁波照射分子，电磁波能与暴露在强磁场中的磁性核相互作用，引起磁性核在外磁场中发生磁能级的共振跃迁而产生吸收信号。与其他光谱方法一样，属于波谱分析。11 原子核的磁性1、原子核的自旋原子核由质子和中子组成，与核外电子一样存在自旋。原子核绕轴自身作旋转运动，产生自旋角动量P。由量子力学计算，P的绝对值由核自旋量子数I决定。核磁共振原理核磁共振原理式中：h是普朗克常数,6.62410-34J/S I是核的自旋量子数, I = 0， P P=0=0， 无自旋，不能产生自旋角动量，不无自旋，不能产生自旋角动量，不会产生共振信号。会产生共振信号。只有当只有当I 0时，才能发生共振吸收，产生共振信号。时，才能发生共振吸收，产生共振信号。 说说 明：明：I为核自旋量子数也简称核自旋核自旋，其数值随核而异。（1）核内质子数和中子数都为偶数时，I=0，观察不到核磁共振现象（2）核内质子数和中子数均为奇数时，I为正整数。（3）核内质子数中子数一奇一偶时，I为半整数。后两类是核磁共振研究的主要对象。后两类是核磁共振研究的主要对象。I 的取值可用下面关系判断：的取值可用下面关系判断： 质量数质量数（A） 原子序数原子序数（Z） 自旋量子数（自旋量子数（I） 奇奇 数数 奇数奇数或或偶数偶数 半整数半整数 n + 1/2。n = 0,1,2, 奇奇 数数 整整 数数 偶偶 数数 偶偶 数数 0例如：例如：半数以上的原子核具有自旋，旋转时产生一小磁场。当加一外磁场，这些原子核的能级发生分裂，这一物理现象称为塞曼效应塞曼效应。在外磁场B B0中塞曼分裂图：2、原子核的核磁矩核自旋产生磁场，其方向由右手定则确定，如图所示。核磁矩由下式确定：式中：为磁旋比。不同的核，其值不同；为核磁矩；P为自旋角动量图1核磁产生磁场的方向将式代入：得到：3、核磁在外磁场中的行为、核磁在外磁场中的行为1）核磁）核磁 与外磁场与外磁场H0之间的作用能之间的作用能P是空间量子化的空间量子化的，在坐标Z轴上的分量Pz取分立的值：式中：m是原子核的磁量子数，其值等于I,I+1,I-1,I。故能取(2I+1)个值Pz的各个值相相差的整数倍，因此是不连续的，是空间量子化的。H0Mi=Mi=EE2=H0E1=H0E图21H在外磁场中的取向能级以1H核为例，无外磁场H0作用，排列是随机的，磁性相互抵消；加上外磁场H0时，1H有序排列。排列方式有(2I+1,I=1/2)种，即两种取向，分别对应两个自旋量子数Mi=1/2。外磁场H0与核的作用能:E=H0两种取向对应两个能级：当与H0同向时，E=-H0；当与H0反向时，E=H0核磁矩在外磁场中的核磁矩在外磁场中的能级分布能级分布两能级差为：E=E2-E1=2H0将式代入得：2)、拉摩进动、拉摩进动(Lamor)在外磁场旋转的原子核，其自旋轴与外磁场方向之间有一倾角。外磁场的作用使核磁受到一个垂直核磁矩的扭力，这样原子核就围绕外磁场的方向回旋，犹如在重力场中运动的陀螺。这种运动方式称为拉摩进动。图3、(a)自旋陀螺在重力场中的进动工(b)自旋原子核在外磁场中的进动进动角频率：，进动线频率：将式代入得：3）核磁共振的条件）核磁共振的条件量子力学选律可知，只有m=1的跃迁，才是允许跃迁，所以相邻两能级之间的能量差： E=E2-E1=2H0如果在磁场的垂直方向加一个射频场，当射频场的能量满足条件：即核子从射频场中吸收能量hv从低能级跃迁到高能级，发生核磁共振吸收。原子核在外磁场中吸收特定频率电磁波的现象称为核磁共振。原子核在外磁场中吸收特定频率电磁波的现象称为核磁共振。公式的意义：公式的意义：1)对于不同的原子核，由于磁旋比不同，发生共振的条件不同。2)对于同一种原子核来说，值一定，共振频率随外磁场H0而改变。从式中可知道，观察核磁共振吸收的方法有两种两种：固定磁场强度H0而改变频率，称为扫频法；固定电磁波频率而改变磁场强度H0，称之为扫场法。4 4、弛豫过程、弛豫过程、弛豫过程、弛豫过程1H的磁性核在电磁波的作用下，能级分裂为二。根据Boltzmann分配定律，处在低能级的原子核数目占有微弱的优势。如在外磁场（60MHz),温度为27时，两个能级上氢核数目N之比为：即每一百万个氢核中低能级氢核数比高能级的多十个左右。虽然这种微弱的优势，使低能级的核在强磁场作用下吸收能量由低能级跃迁到高能级。随着低能级的核数目的减少，吸收信号减弱直至消失，此为饱和。实际应用中，只要合理地选用照射制度，就可以连续观察到NMR信号。使低能级上的核始终保持微弱多数的。因此必然存在使低能级的磁核始终保持微弱多数的内在因素，即高能级的核必须放出能量回到低能级，从而使低能级的核始终占优势。弛豫过程弛豫过程（Relaxation）:是高能态的核以非辐射的形式放出能量回到低能态重建Boltzmann分布的过程。如果没有弛豫过程，饱和现象容易发生。弛豫过程分为两类：1）自旋晶格弛豫（纵向弛豫）(Spin-latticeRelaxation）自旋核与周围分子交换能量的过程。核周围的许多小分子相当于许多的小磁体，这些小磁体的快速运动产生瞬息万变的小磁场波动磁场。某个波动磁场的频率与核自旋产生的磁场频率一致时，自旋核与波动磁场发生能量交换，将能量传递给周围分子而跳回低能级，从而使低能级的核数目占有微弱的优势。因此总的结果是降低高能级的核数目。弛豫过程经历的时间愈短，自旋晶格弛豫过程的效率愈高。气体和液体样品的t1很短，仅几秒种。固体样品因分子热运动受到限制，T1很大，因此NMR常采用液体样品。2）自旋自旋驰豫(Spin-spinRelaxation)核与核之间的能量交换。l高能态核把能量传给同类低能态的自旋核，本身回到低能态，维持Boltzmann分布。结果是高低能态自旋核总数不变。l自旋-自旋弛豫过程的半衰期用T2表示。l液体T21s，固体或粘度大的液体，T2很小，10-410-5s22 核磁共振谱线特征核磁共振谱线特征1、谱线的宽度1)自然宽度核磁并非静止地固定在某个能级上，而是在两个能级间跃迁，即在某个能级上的寿命是有限的，根据量子力学测不准关系：可知和。即越小，则越大，即谱线越宽。2）偶极加宽样品中含有大量的磁核，并在其周围产生磁场，从而被测原子核除受磁场的作用外，还受相邻核所产生的磁场的作用，而有一分布，从而使谱线变宽。3）非均匀加宽实际上在样品体积范围内的外磁场并非均匀分布，而是在某个数值范围内有微小差别，从而在样品体积范围内各部分原子核的共振频率值也不同，导致谱线变宽。4）驰豫加宽和调制加宽自旋晶格驰豫过程使原子核在给定的能级中的平均寿命减少，当然谱线加宽。用连续波测定NMR吸收时，往往改变磁场，相当于加了一个调制，从而产生一定的频谱，也使谱线变宽。2谱线的线型谱线的线型溶液中的NMR谱线的线形为罗伦兹型；固态中的NMR谱线的线形为高斯型。3谱线的强度谱线的强度在1HNMR谱中，一般谱线的强度正比于产生此峰的数目，据此可以进行定量测定。如CH3CH2OH中CH3、CH2、OH基团质子峰的相对强度比为3：2：1，恰好是这些基团所含质子数之比。但在C13NMR中，因分子中各个C13核所受影响的各因素各不相同，从而使谱峰的强度一般不与产生各谱线的C13核数成正比。4 4、化学位移的基本原理、化学位移的基本原理1）化学位移的产生由核磁共振条件，从理论上讲，某种原子核的共振频率只决定这种原子核的磁旋比和外磁场强度，同类核应有相同的共振频率。如果是这样，核磁共振对研究分子结构就没有意义。1950年发现：磁性核的共振频率不仅取决于核的磁旋比和外部磁场强度，而且受到核周围的分子环境的影响，从而使各种不同类的氢原子所吸收的频率有所不同如图所示图各种不同氢的化学位移图各种不同氢的化学位移产生这种差别在于被测原子核周围的化学环境，化学环境是由于氢核外围电子云对核的屏蔽作用引起的。电子屏蔽效应化学位移是由核外电子的屏蔽效应引化学位移是由核外电子的屏蔽效应引起的。起的。 原子核原子核在分子中不是完全裸露的，而是被价电子所包围的。核外电子在与外磁场垂直的平面上绕核旋转的同时，会产生与外磁场方向相反的感生磁场。感生磁场的大小用 表示。 为屏蔽常数，与核外电子云的密度有关。核实际感受到的磁场强度（有效磁场Hi） 核的共振频率为： 同一分子内同类核的化学环境不同，不同，因此化学位移不同核外电子对H核产生的这种作用，称为屏蔽效应(又称抗磁屏蔽效应)。 显然，核外电子云密度越大，屏蔽效应越强，要发生共振吸收就势必增加外加磁场强度，共振信号将移向高场区；反之，共振信号将移向低场区。因此，因此，H核磁共振的条件核磁共振的条件是：是：2)化学位移表示方法不同环境中的质子的共振频率虽有差异，但差异差异很小很小，约为百万分之十。在测定共振频率时，常常要求几个赫兹的准确度，目前还不能精确测定。因此，采用相对数值。测定样品与标准物质的吸收频率之差，此差值为化学位移。常以四甲基硅（TMS）为标准物质，规定：它的化学位移为零，然后，根据其它吸收峰与零点的相对距离来确定它们的化学位移值。零零点点-1-2-31234566789 TMS低场低场高场高场常用的标准物质：四甲基硅(TMS)：2,2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸钠(DSS)：TMS作为标准物的优点：TMS分子有12个相同化学环境的氢，NMR信号为单一尖峰，少量的TMS即可测出NMR信号。Si电负性比C低，TMS质子处在高电子密度区，产生较大的屏蔽效应。TMS的化学性质不活泼，与样品不发生化学反应和分子间的缔合。TMS容易溶于有机溶剂，沸点低，样品容易回收。TMS不溶于重水，用重水测谱时，用其他标准物如2,2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸钠(DSS)（1）用赫兹表示化学位移CH3CCl2CH2Cl的H1NMR(60MHZ,100MHz)谱说明，同一质子在不同仪器上，用赫兹表示的化学位移是不同的，不容易进行比较。因此，该法须注明所用仪器的射频值。CH3CCl2CH2Cl的H1NMR(60MHZ,100MHz)谱（2）用位移常数表示化学位移固定磁场，改变频率样品和标准的共振频率：频率差：化学位移：频率固定，磁场改变(扫场法)样品和标准的共振磁场：因此位移可表示为：化学位移用化学位移用 表示，以前也用表示，以前也用 表示，表示， 与与 的关系为：的关系为： = 10 - 单位为ppm。3) 影响化学位移的因素l诱导效应l化学键的各向异性l共轭效应l浓度、温度、溶剂对值的影响l溶剂对值的影响同一化合物在不同溶剂中的化学位移会有所差别，这同一化合物在不同溶剂中的化学位移会有所差别，这种由于溶质分子受到不同溶剂影响而引起的化学位移种由于溶质分子受到不同溶剂影响而引起的化学位移变化称为溶剂效应。变化称为溶剂效应。溶剂效应主要是因溶剂的各向异性效应或溶剂与溶质溶剂效应主要是因溶剂的各向异性效应或溶剂与溶质之间形成氢键而产生的。之间形成氢键而产生的。由于存在溶剂效应，在查阅或报道化合物的核磁共振由于存在溶剂效应，在查阅或报道化合物的核磁共振数据时应该注意标明测试时所用的溶剂。如果使用的数据时应该注意标明测试时所用的溶剂。如果使用的是混合溶剂，则还应说明两种溶剂的比例。是混合溶剂，则还应说明两种溶剂的比例。溶剂效应溶剂效应活泼氢的化学位移活泼氢的化学位移 化合物类型 （PPM)化合物类型 （PPM)醇0.5-5.5Ar-SH3-4酚(分子内缔合)10.5-16RSO3H11-12其它酚4-8RNH2,R2NH0.4-3.5烯醇(分子内缔合）15-19ArNH2,Ar2NH,ArNHR2.9-4.8羧酸10-13RCONH2,ArCONH25-6.5RC=NOH7.4-10.2RCONHR,ArCONHR6-8.2R-SH0.9-2.5RCONHAr,ArCONHAr7.8-9.4氢谱化学位移数值已有较完善总结氢谱化学位移数值已有较完善总结经验公式经验公式计算机预测计算机预测化学位移图表和计算公式化学位移图表和计算公式核磁共振谱仪简介核磁共振谱仪简介核磁共振谱仪发展过程核磁共振谱仪发展过程图为核磁共振谱仪示意图。它主要由以下部分组成：磁铁：永久磁铁和电磁铁只能产生100MH以下磁场强度，更高磁场强度用超导磁体。射频振荡器：其线圈垂直于磁场，能产生频率与磁场强度相应的射频振荡。1H常用的60,90,100MH的电磁波。射频接受器：与振荡器线圈垂直，并与扫场线圈垂直。探头和样品管座：探头中有射频振荡线圈、射频接受线圈，样品管插于探头内。核磁共振波谱仪原理核磁共振波谱仪原理1永久磁铁永久磁铁：提供外磁场，要求稳定性好，均匀，不均匀性小于六千万分之一。扫场线圈。2 射频振荡器射频振荡器：线圈垂直于外磁场，发射一定频率的电磁辐射信号。3 射频信号接受器射频信号接受器（检测器）：当质子的进动频率与辐射频率相匹配时，发生能级跃迁，吸收能量，在感应线圈中产生毫伏级信号。4样品管样品管：外径5mm的玻璃管,测量过程中旋转,磁场作用均匀从最初的NMR谱仪，经历了三次大的革命，由不同类型的NMR波谱仪，可按不同的方式进行分类。a.按激发和接收方式可分为：连续波发射，分时发射和脉冲发射谱仪；b.按磁体的性质分为：永磁、电磁和超导波谱仪；连续波永磁谱仪结构简单，易于操作，但灵敏度太低，70年代初发展了电磁体NMR谱仪使磁场强度一直加大，高时可达100兆，磁体重2.7吨，而且耗电量也很大。c.随着超导技术、电子技术和计算机技术的发展，脉冲付里叶变换高分辩超导NMR仪在近二十年来发展很快。场强由88年的600兆，94年的750兆，98年的800兆至2000年10月900兆。1.1.核磁共振仪器核磁共振仪器从NMR实验技术看经历了四个过程a、维1H谱，连续波检测小分子结构；b、脉冲付里叶变换实验，检测1H，13C和一些多核谱图，如31P，15N等等（场强较高下完成）；c、二维、三维和多维谱的发展随着超导磁体的引入，计算机及电子技术的进一步发展，使得二维和多维核磁共振技术在80年代末，90年代初发展很快，各种多脉冲实验层出不穷，NMR技术变得更完善，更多样化和更有针对性的研究分析样品。d、梯度场的发展脉冲梯度场技术是90年代初用于NMR谱仪分析研究的，一经应用于NMR分析，其优点很快的体现出来了，如利用梯度脉冲探头可以在3分钟之内测试一个H-HCOSY。匀场是做好NMR谱图的关键，也是每个NMR操作者的基本功，以前为了匀场有时需要几十分钟或更长时间，现在只需40多秒。实验技术的新进展1、谱仪向高场发展、谱仪向高场发展2、实验方法的最新进展、实验方法的最新进展3、探头的改进、探头的改进 1）魔角MASNano探头2）超低温探头利用高温超导薄膜材料而制成的超导低温探头，当样品温度由温控单元维持时，采用闭环或开环制冷系统使超导线圈冷到25K，消除了谱图的电噪声，提高了检测灵敏度。是常规探头的四倍。相对常规5mm探头而言，其潜在灵敏度可以提高810倍。国内已有此类探头使用，500兆信噪比可达到3200：1，可达到800兆水平。4、LC-NMR联用技术及其应用联用技术及其应用 核磁共振新技术核磁共振新技术 核磁双共振核磁双共振 二维核磁共振二维核磁共振 NMR成像技术成像技术 极化转移技术极化转移技术 魔角旋转技术魔角旋转技术 高效液相色谱与核磁共振联用技术高效液相色谱与核磁共振联用技术 （LC-NMR）核磁双共振核磁双共振双核自旋系统检测器2扰动1脉冲双共振是同时用两种频率的射频场作用在两种核组成的系统上，第一射频场B1使某种核共振，第二射频场B2使另外一种核共振，这样两个原子核同时发生共振。复杂分子的NMR谱由于同类核及不同核的偶合作用，使被测核的峰分裂为多重峰，不仅降低了谱线的强度而且各多重分裂峰彼此重合在一起给谱的解释带来很多困难。因此在测定NMR谱时，使自旋体系样品同时受到两个不同频率的射频场作用，分别用于被测核A的共振吸收以及与被测核A有偶合作用的核B去偶合，使观察到的NMR谱如同未发生偶合作用一样。第二射频场为干扰场，通常用一个强射频场干扰图谱中某条谱线，另一个射频场观察其他谱线的强度、形状和精细结构的变化，从而确定各条谱线之间的关系，区分相互重叠的谱线。 二维核磁共振二维核磁共振及多维核磁共振及多维核磁共振 二维核磁共振使NMR技术产生了一次革命性的变化，它将挤在一维谱中的谱线在二维空间展开（二维谱）,从而较清晰地提供了更多的信息。核磁共振成像术是80年代发展起来的一种全新的影像检查技术。它的全称是：核磁共振电子计算机断层扫描术(简称MRI-CT或者MRl)。1971年，美国人达曼迪恩提出，将核磁共振用于医学的诊断，当时，未能被科学界所接受。然而，仅仅10年的时间，到1981年，就取得了人体全身核磁共振的图像。使人们长期以来，设想用无损伤的方法，既能取得活体器官和组织的详细诊断图像，又能监测活体器官和组织中的化学成分和反应的梦想终于得以实现。核磁共振完全不同于传统的X线和CT，它是一种生物磁自旋成像技术，利用人体中的遍布全身的氢原子在外加的强磁场内受到射频脉冲的激发，产生核磁共振现象，经过空间编码技术，用探测器检测并接受以电磁形式放出的核磁共振信号，输入计算机，经过数据处理转换，最后将人体各组织的形态形成图像，以作诊断。核磁共振所获得的图像异常清晰、精细、分辨率高，对比度好，信息量大，特别对软组织层次显示得好。使医生如同直接看到了人体内部组织那样清晰、明了，大大提高了诊断效率。避免了许多以往因手术前诊断不明而不得不进行的开颅、开胸、开腹探查及其他的一些探查诊断性手术，使病人避免了不必要的手术痛苦以及探查性手术所带来的副损伤及并发症。所以它一出现就受到影像工作者和临床医生的欢迎，目前已普遍的应用于临床，对一些疾病的诊断成为必不可少的检查手段。核磁共振提供的信息量不但大于医学影像学中的其他许多成像术，而且不同于已有的成像术，它是一项革命性的影像诊断技术。因此，它对疾病的诊断具有很大的潜在优越性。极化转移技术极化转移技术灵敏核非灵敏核检测（非灵敏核）J脉冲序列1脉冲序列2 极化转移(PT)是一种非常实技术，它用二种特殊的脉冲序列分别作用于非灵敏核和灵敏核两种不同的自旋体系上。通过两体系间极化强度的转移，从而提高非灵敏核的观测灵敏度，基本的技巧是从高灵敏度的富核处“借”到了极化强度。在NMR测定中，为取得高质量的谱图，要求磁场均匀，样品的填充因子高，磁化率均匀，前两个因素可以通过硬件研制不断改善，而磁化率均匀与否则与样品性质、数量及周围环境直接相关，这样，当样品量有限时,就必须考虑磁化率的均匀性。1982年，魔角旋转（MAS）开始用于高分辨工作，此后，将MAS用于小体积微量样品引起了兴趣，实验表明运用MAS可以消除固体及非均相溶液中磁化率不同而造成的谱线加宽。样品应以相当或大于1.8kHz转速下旋转，可使边带得到有效抑制，根据这些结果，成功地设计了新型的超微量探头。超微量探头的发展概况超微量探头的发展概况魔角旋转技术魔角旋转技术在固体中自旋之间的耦合较强，共振谱较宽，掩盖了其他精细的谱线结构，耦合能大小与核的相对位置在磁场中的取向有关，其因子是(3cos2-1)，如果有一种方法使=54.440（魔角），则3cos-1=0，相互作用减小，达到了窄化谱线的目的。魔角旋转技术就是通过样品的旋转来达到减小相互作用的，当样品高速旋转时与的差别就会平均掉。90年代中，一种与常规高分辨液相探头设计完全不同的超微量探头（目前称之为NanoNMRProbe，下同）问世了，这种探头与常规固体高分辨探头也不尽相同，后者为高功率，高速魔角旋转用于消除化学位移各向异性和使偶极偶合平均化，对于磁化率的不连续性是不考虑的。另外，常规MAS探头对线宽要求仅为5Hz（甚至50Hz），而1H微量探头因为1H核本身总的谱宽窄，要求线宽0.5Hz（CDCl3在丙酮-d6）中，特殊设计的NanoNMRprobe，其成功之处在于将体积很小的样品（40L），能100%地保持在检测线圈内，并确保填充因子高，和均匀的磁化率，以得到最高灵敏度，构成探头的物料也必须使磁化率的不连续性达到最小，才能达到最小的线宽。NanoNMRProbe超微量探头的结构原理超微量探头的结构原理NanoNMRProbe内腔长28mm，魔角（54.7），转速在1.52.0kHz之间，为保持长期稳定性，带有2H锁线圈，并有变温功能，探头种类有直接检测用的1H和13C1H和间接检测用的1H13C探头，样品体积最大为40L，可取得线形好，灵敏度高和分辨率最佳的谱图，若样品量很少，溶剂量可相应减少，保持样品有一定浓度，溶剂杂质及伪峰不会增加，还可提高动态范围，只要氘代试剂的量能保证场一频联锁，即使样品溶液体积未充满整个样品管（40l），也不会使匀场变坏，或使谱线变宽，确保取得高质量的谱图。NanoNMRProbe的应用1、超微量样品的测定样品量不同的薄荷醇,分别为为40g，4g和400ng，溶于CD2C12中,采样次数分别为4次,400次和32240次.2、Nano探头在组合化学中的应用组合化学是近二十年发展起来的一种快速合成与筛选大量化合物的新方法，其在发现和优化药物先导化合物的过程中发挥了重要作用。组合化学包括了组合合成、群集筛选和对感兴趣化合物结构解析的三大步骤。因而有“平行”合成技术、“混-分”合成技术、编码-解码技术、“一珠一化合物”技术、“位置扫描”技术、天然寡聚物的生物组合合成及筛选技术、“动态化学库”技术、“多样性”导向的组合合成技术、“Microarray”技术、组合配基装配、“非天然”天然组合化学库合成技术等等。在多种合成方法中，“一珠一化合物”技术最大的优点是化学库的空间可分离性，亦即化学库中所有的化合物同时并存且相互独立，因而，这种树脂珠-化学库的方式可直接用于固相筛选法。利用该技术在短时间内迅速合成并筛选的化合物可以达到几千万这样的天文数字，大大加快了发现药物先导化合物的步伐。但是在产物分析中，由于树脂引起磁场的不均匀，常规的NMR技术受到了限制。较早的做法是将反应的中间体或最终产物从树脂上切落下来，再利用常规方法进行分析和鉴定。这种方法费时，费样，而且经常破坏化合物的结构，得出错误的信息。九十年代初发展的高分辨魔角核磁共振技术(Highresolutionmagicanglespinning(HR/MAS)NMR)可以克服树脂引起的磁场不均匀性,得到最高灵敏度和最小线宽的NMR谱图。该技术不破坏样品，可灵敏、直接地提供偶联在树脂上化合物的结构信息。顶部谱图用常规5mm液体高分辨探头911mg干树脂，扫描一次中部谱图：用常规5rnm固体CPMAS探头，树脂样品为20.2mg转速为3.8kHz，扫描8次底部谱图：用Nano探头，树脂用量仅为5.4mg，魔角转速为2kHz，扫描8次目前，广泛用于：监测固相合成反应；指导反应条件的优化;鉴定固载在单一树脂珠上化合物的结构；以及分析树脂上固载化合物的构象等等。高分辨魔角核磁共振是组合化学中有用的分析工具，可以跟踪固相有机合成反应，快速直接地提供连在树脂上的化合物的结构信息，指导反应条件的优化，它能直接简便地定量反应的产率，而这种分析方法恰恰在常规NMR中很难实现。高效液相色谱与核磁共振联用技术高效液相色谱与核磁共振联用技术（LC-NMR）1、LC-NMR技术发展概况技术发展概况 NMR谱仪的灵敏度较低；谱仪的灵敏度较低；系统无法应付较大的动力学范围；流动检测池和探头没有商品化以及溶剂峰压制效果不理想。2、LC-NMR联用技术的软硬件及原理联用技术的软硬件及原理1）计算机软件支持）计算机软件支持2）LC-NMR联用的相关硬件 a. NMR流动探头流动探头b.HPLC系统c.峰敏技术d.在线/离线组份收集器 3、技术问题及解决措施、技术问题及解决措施动力学范围不够宽色谱分辨率的丧失HPLC-NMR通信NMR灵敏度解决方法：1）流速、检测池及探头2）溶剂峰压制不同的溶剂峰压制技术大都是基于化学位移和驰豫时间的不同而设计的，理想的峰压制技术应满足以下几点要求：（1）消除溶剂峰而不干扰所要的信号（2）不影响峰压制区域以外的信号强度（3）能同时压制多个溶剂峰（4）易于实现以避免损失测试信号（5）在梯度HPLC体系中能跟随溶剂信号位置改变而改变WET序列，已经可以成功地完成HPLC-NMR中使用普通试剂而必需的峰压制4、LC-NMR的操作模式及其应用的操作模式及其应用1）操作模式a连续流动：在洗脱过程中，溶剂组成不断变化，给峰压制造成一定困难，另外样品停留时间短，灵敏度低，一般只适用于1H和19F测试。b停止流动：顾名思义即使溶液停留于检测池中进行测试。当组分的保留时间已知，或者HPLC-NMR采用灵敏的在线检测器时，可以采用这种方法。c分时止流：按一定的时间间隔暂停流动相，来检测NMR谱。这种方法在被检组分没有UV发色团时尤其适用。通过HPLC-NMR谱，也可以估计色谱峰的纯度。d收集分析：色谱洗脱峰被预先收集到一个样品池中，然后进行离线NMR检测。e紫外激发：这种方法主要是利用软件技术，在UV检测到组分峰时，经过计算将样品组分准确地滞留于检测池中，并通过NMR进行采样。2）应用范围a在药物代谢研究中应用b食品化学c高聚物分析d在天然产物化学中的作用e环境化学中的应用藤黄酸大鼠胆汁代谢产物结构确证研究藤黄酸大鼠胆汁代谢产物结构确证研究藤黄酸是从中药藤黄中分离得到的化合物，其抗癌作用与一般的化疗抗癌药物有所区别，实验研究结果表明，藤黄酸对多种肿瘤显示较强的抗肿瘤活性，并在有效计量范围内毒副作用比较小，对肿瘤细胞的抑制有非常高的选择性，能选择性的杀死癌细胞，而对正常动物造血系统和免疫功能没有影响，这是目前肿瘤化疗药物所不具备的。药代动力学研究已显示，藤黄酸在肿瘤组织中有较高的分布和较长的持续时间。藤黄酸HPLC分析的色谱条件A 空白胆汁色谱图 B II 代谢物分析色谱图 C I相代谢物分析色谱图 D 藤黄酸色谱图藤黄酸在大鼠胆汁中可检测到2个主要代谢产物，即代谢物1（MT1，Rt=17.996min）和代谢物2（MT2, Rt=19.557min）。LC-NMR的分析条件的分析条件采用Varian公司的Prostar-230高效液相色谱仪，分析柱为Inertsil ODS-3柱(1504.6mm)。流动相为D2O:CH3OH=85:15。流速为1ml/min，检测器为Varian Prostar-330二极管阵列检测器，紫外检测波长为280nm。将服药胆汁样品溶于200l甲醇和水的混合溶剂中。在INOVA-500LC-NMR上，用停止流动的方法分别采集LC-1HNMR谱。进样量为25l，采用WET方式压制溶剂峰。谱宽7500Hz，1H谱采样时间为1.5s，驰豫时间为1s，采样数据点16K，累加次数为256。MS图谱MT1的ESI-MS给出M-1-为m/z 645，故其分子量为646，与藤黄酸（628）相比，质量数多18，可能为藤黄酸的羟基化物。代谢产物2的LC-MS谱给出MT2的M-H-峰为m/z 643，故其分子量为644。比藤黄酸质量数(628)多16。MT1(上图)，MT2(中图)和藤黄酸(下图)LC-1HNMR低场区信号比较代谢物1(MT1)的结构分析（1）高场区：MT1的1H-NMR谱高场区示有多个甲基信号(1.73 (6H, s), 1.66, 1.65, 1.63, 1.56, 1.36, 1.35 (each 3H,s)，与藤黄酸类化合物的1HNMR谱特征相符。（2）低场区藤黄酸的10位烯质子的信号(7.56 (1H, d, J=6.9Hz)在MT1的1HNMR谱中消失，而MT1在4.65 (1H, br.d, J=4.0Hz)处显示一个含氧取代基的偕位质子信号，据此推断MT1为藤黄酸的10位羟基化产物。 (3) MT1氢谱的低场区的27,32,37-H的信号也与藤黄酸有明显不同，藤黄酸中27-H(5.96(1H, t, J1=J2=7.2Hz)的信号在MT1中向低场位移至6.52(1H, t, J1=J2=7.2Hz)，而原本重叠在一起的32,37-H (5.25 (2H,m)也分成为两个多重峰（5.05 and 5.25 (each 1H, m)。这与10位有含氧取代基的化合物的氢谱特征相吻合（见表3-1），故断定MT1为10-羟基-藤黄酸。代谢物2(MT2)的结构分析MT2的LC-1H NMR谱符合藤黄酸类化合物的氢谱特征。在其氢谱上，7.4左右没有双峰出现，因此藤黄酸结构中的9，在MT2的结构中消失。MT2的氢谱上在4.4ppm出现一个质子的d峰信号，偶合常数约为4Hz,这与MT1的10-H信号非常相似，因此判断MT2的10位亦存在含氧取代基。由于MT2仅比藤黄酸多一个氧，因此推测MT2可能为藤黄酸的9,10-环氧衍生物. 在景洪哥纳香提取混合物中的应用研究景洪哥纳香(GroniothalamusCheliensis)为番茄科哥纳香属植物，据文献报道，哥纳香属植物中富含苯乙稀比喃类化合物，该类化合物具有抗癌用目前已从自然界中分离得到70余种该类化合物。仪器及实验条件景哥洪纳香(20kg)用95的酒精提取3次，所得浸膏(1300g)在索式提取器中，先后用石油醚，氯仿、乙酸乙酯萃取氯仿部分(315g)用硅胶柱层析，以CHCL3：乙酸乙酯梯度洗脱，得到105mg混合物采用Varian公司的Prostar一230高效液相色谱仪，分析柱为InertsilODS一3柱(25046mm)流动相为D2O，CH2CN，采用梯度洗脱，01min时其洗脱比例为D2O：CH3CN=68：32，逐渐增加乙腈的比例至25min时达到D2O：CH3CN=40：60，至45min时达到D2O：CH3CN=20：60流速为1mLmin，检测器为VarianProstar一330二极管振列检测器，紫外检测波长为254nm将5mg混合物样品溶于200L乙腈和水的混合溶剂中结果与讨论苯乙稀吡喃类化合物在6.007.00为双键上的稀质子，4.005.00为环上连氧环质子，7.007.80为单取代的苯质子通过对HPLC-NMR得到的HNMR谱分析,得到各谱均符合苯乙稀吡喃类化合物的特征4，5，6色谱峰有两套双键上的稀质子信号，如果为双倍体，每对6.007.00双键上的稀质子比例应相同，但现在比例不同，4，5，6色谱峰的HNMR谱为混合物HNMR其中5号色谱蜂HNMR谱有两套双键上的稀质子信号7.033，6.080和7033，6210;两套乙酰基取代质子5492，5370，10个苯质子7.007.80两套,4.005.00有2个质子,也是两套.这两套质子比例均为2:1.，认为该结构为哥纳香三醇或类似物6号峰HNMR谱中含有5号峰所有信号及另一套双键上的稀质子信号70336080，5734有一个质子信号二者比例为1：4因此认为该物质可能为苯乙烯或类似物.4号峰HNMR谱所含信号与5号色谱蜂HNMR谱类似，但是不含乙酰基取代质子，在较低场(400以下)含质子信号认为该结构为哥纳香二醇或类似物核磁共振技术在新药筛选中的作用1.合理性药物设计合理性药物设计是以了解生物大分子（如蛋白质）的三维结构及其相关的分子识别为基础的。然而，小分子配体和蛋白质进行分子识别形成复合物的过程并非象钥匙和锁的模型那样简单，而是一个双重诱导契合（double-inducedfit）的过程蛋白质-配体双重诱导契合模型示意图2.非合理性药物设计快速筛选方法(高通量筛选:HTS)(high-throughoutscreening)优点：无需知道蛋白质的三维结构缺点：需要花费大量的时间和精力去建立针对一个或一类蛋白的检定方法；所能检测到的都是亲和力相对较高的分子；要直接针对一个很大的化合物库进行筛选；多种官能团的结构多样性问题以及酰胺和酯键限制药物的生物利用度的问题也需要进一步解决SAR-by-NMR（Structure-activityrelationshipbyNMR）通过NMR将上述合理性药物设计和非合理性药物设计（组合化学）巧妙地结合起来，产生了一种极为有效的发现药物靶分子高亲和性配体的方法，称为SAR-by-NMR。这种新方法结合了合理性设计中的配体设计和优化方法（如LUDI）和非合理性设计(如组合化学)的合理因素，大大地提高了先导化合物发现的速度和有效性。该方法利用15N标记的蛋白质，和15N-1HHSQC实验。由于小分子和蛋白质结合后，会改变蛋白质结合位点的局部化学环境，因此通过二维15N-HSQC谱中15N或1H的化学位移的变化可以检测到是否有小分子域蛋白质结合。同时配体和蛋白质的结合常数可以通过化学位移的变化和配体浓度的关系测得。结合位点也可以由发生化学位移变化的原核子来确定。SAR-by-NMR原理示意图SAR-by-NMR成功之处：1、使用了NMR实验方法来辨别小分子和靶蛋白的结合，能够很快地从小分子化合物库中发现结合于靶蛋白亚活性位点的低亲和性配体。2、可以通过蛋白质特定酰胺信号的变化直接得到配体结合位点的结构信息。这一点首先对辨别小分子是结合在靶蛋白的不同亚位点上非常重要，同时，通过比较结合在同一亚位点的小分子的结构，可以得到哪些官能团对结合有主要贡献的信息，然后通过结构与活性的关系对小分子进行优化3、可以直接研究“变构效应”即第一个亚位点配体存在下进行筛选时可能发现那些只有在第一个配体存在下才能和靶蛋白的其他亚位点结合的配体第二个配体(三角形)只有在另一个配体(椭圆形)存在的情况下才能和靶蛋白稳定地结合“连接模式”策略GAB=GA+GB+Glink所谓“连接模式”，就是把亲和性比较弱的单个分子片段通过连接桥连接起来，这样得到的新的分子和靶蛋白结合时，将不仅仅是单个片段结合自由能的简单相加这个策略成功的关键还在于所设计的连接桥的长度及其性质（如刚性等）能否使Glink达到最优亲和性为mM和M数量级的小分子经连接可得到nM甚至pM数量级的先导化合物在LUDI中完全是用从头设计的方法选择小分子片段并把它们连接起来，而在SAR-by-NMR中小分子片段是用NMR直接筛选得到的。和传统的合理性设计相比，可以说，这是真正的合理性设计SAR-by-NMR与组合化学相比：相同：两者都须经过筛选大量化合物，都充分利用了有机化合物结构多样性的特点，从中获得高活性的先导化合物。不同：组合化学是先制备由大量化合物组成的化合物库，然后对这些化合物库进行直接筛选；而SAR-by-NMR筛选的是未经“组合”（连接）的小分子化合物库，得到结合于靶蛋白亚活性位点的低亲和性配体，经优化后再“组装”成高亲和性的配体。优越之处：在组合化学中，要合成所有分子片段和不同连接桥“组合”起来的分子(分子片段1)(分子片段2)(不同连接桥)。而在SAR-by-NMR中，由于和蛋白结合的分子片段在连接之前先已被辨别出来，而且连接桥是基于结构信息选择的，所以只需进行少量的合成。应用实例1、FK506结合蛋白（FKBP）的高亲和性配体的发现发现第二个配体Kd=0.8 mM优化第二个配体“连接桥”的选择2、溶基质素的非肽抑制剂的发现选择乙酰氧肟酸（CH3CONHOH)作为第一个配体Kd=17mMR1R2nIC50（M）HH13.9HH20.31HH3110HH4100HCN10.26HCN20.025HCN33.4HCN43.5CH2CNH20.015CH2CNH31.9CH2CNH43.5SAR-by-NMR发现溶基质素抑制剂示意图SAR-by-NMR方法的展望SAR-by-NMR在发现高亲和性配体具有巨大潜力.限制:需要知道靶蛋白的确切NMR三维结构需要大量15N标记的蛋白样品受NMR技术本身解析蛋白质三维结构能力限制展望:随着生物技术的发展和后人类基因组时代(或称为蛋白组时代)的到来,越来越多和生理、病理相关的蛋白质将被发现和表达，SAR-by-NMR在发现生物大分子的高亲和性配体以及药物设计中将发挥越来越巨大的作用。核磁共振技术在代谢组学中的应用核磁共振技术在代谢组学中的应用代谢组学代谢组学代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后发展代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的一种研究生物系统的组学方法。它是英起来的一种研究生物系统的组学方法。它是英国国Nicholson教授及其同事于教授及其同事于1999年正式提出的。年正式提出的。代谢组指的是代谢组指的是“一个细胞、组织或器官中，所有一个细胞、组织或器官中，所有代谢组分的集合，尤其指小分子物质代谢组分的集合，尤其指小分子物质”，而代谢，而代谢组学则是一门组学则是一门“在新陈代谢的动态过程中，系统在新陈代谢的动态过程中，系统研究代谢产物的变化规律，揭示机体生命活动研究代谢产物的变化规律，揭示机体生命活动代谢本质代谢本质”的科学，它所关注的是相对分子质量的科学，它所关注的是相对分子质量为为1 000以下的小分子。近年来代谢组研究已引以下的小分子。近年来代谢组研究已引起众多研究者的注意起众多研究者的注意。核磁共振光谱分析法是目前代谢组学研究应用最广泛的方法，NMR的优势在于对样品无破坏性，样品处理简单，无需分离过程；缺点是灵敏度低，很难同时测定生物体系中共存的浓度相差较大的代谢产物。分析技术分析技术谱峰的预处理NMR谱峰的预处理包括背景扣除、滤噪、归一化或标准化等。数据分析常用的分析方法有PCA、t检验和方差分析等。核核 磁磁 共共 振振 在在 代代 谢谢 组组 学学 中中 的的 应应 用用1一维核磁共振技术在代谢组学中的应用一维核磁共振技术在代谢组学中的应用2 （1） 核磁共振氢谱在代谢组学中的应用核磁共振氢谱在代谢组学中的应用1H NMR光谱是一种非靶点的方法。光谱是一种非靶点的方法。氢的氢的NMR技术有固有的灵敏性。技术有固有的灵敏性。随着核磁共振成像技术的发展，利用核磁共振光谱随着核磁共振成像技术的发展，利用核磁共振光谱对于人在体研究，可采用非入侵形式。对于人在体研究，可采用非入侵形式。核磁共振氢谱广泛的应用于代谢组学中核磁共振氢谱广泛的应用于代谢组学中。H.C.Bertram et al.用用1H NMR光光谱谱法法测测定定牛牛血血浆浆中中挥挥发性脂肪酸。发性脂肪酸。（2） 13C NMR 在代谢组学中的应用在代谢组学中的应用 13C NMR的灵敏度很低。碳谱的灵敏度只有氢谱的灵敏度很低。碳谱的灵敏度只有氢谱的的1/5800。 但是，碳谱化学位移广，分辨率较氢谱高；而且，但是，碳谱化学位移广，分辨率较氢谱高；而且，可得到分子骨架信息；可得到羰基，氰基，季碳等可得到分子骨架信息；可得到羰基，氰基，季碳等氢谱无法得到的信息。科学家们尝试用各种方法提氢谱无法得到的信息。科学家们尝试用各种方法提高碳谱的灵敏度。高碳谱的灵敏度。 Hector C.Keun等应用低温探针等应用低温探针13C NMR技术通过技术通过研究大鼠尿液中的代谢物考察了肼的毒性研究大鼠尿液中的代谢物考察了肼的毒性 核磁实验中应注意的问题1）样品准备）样品准备 人们往往把注意力集中在谱仪操作上，而忽视样品准备。作为样品提供者来说所关心的是得到一个信噪比好、分辩力高的谱图。所以，花几分钟把样品准备好，可以节省几小时的谱仪的时间，同样，处理好的纯样品可以得到可靠，准确的结构信息。2）溶剂选择）溶剂选择 选择溶剂首先要考虑溶解性；要避免溶剂峰遮盖谱峰；含活泼氢溶剂妨碍样品中活泼氢观察，在无活泼氢有机溶剂中观察活泼氢，再用D2O交换确证；样品是否需要回收；氘代试剂的价格。3）样品管及样品用量）样品管及样品用量样品管必需清洗干净、无残留溶剂和杂质，以免影响测试结果；样品溶剂的体积和样品量均有要求。4）样品的处理）样品的处理要得到高分辩的谱图，溶液中绝不能有悬浮的灰尘和纤维。一般情况下用棉花和滤纸把样品直接过滤到样品管中。THEENDTHANKS