天津大学生物化学04第四章课件蛋白质化学Stillwatersrundeep.流静水深流静水深,人静心深人静心深Wherethereislife,thereishope。有生命必有希望。有生命必有希望蛋白质化学蛋白质化学1 1( (分类）分类） 蛋蛋白白质质功能功能 形状形状球蛋白：球形、易溶解。球蛋白：球形、易溶解。组成组成溶解性溶解性 纤维蛋白纤维蛋白：形似纤维、不溶于水。形似纤维、不溶于水。单纯蛋白：只有单纯蛋白：只有氨基酸，多数蛋白。氨基酸，多数蛋白。清蛋白（白蛋白）：溶于水。清蛋白（白蛋白）：溶于水。球蛋白：微溶于水，溶于稀盐。球蛋白：微溶于水，溶于稀盐。醇蛋白：不溶于水，溶于乙醇。醇蛋白：不溶于水，溶于乙醇。缀合蛋白：与非蛋白质物质结合，如核、缀合蛋白：与非蛋白质物质结合，如核、糖、脂蛋白。糖、脂蛋白。活性蛋白：如酶、激素，受体、膜蛋白。活性蛋白：如酶、激素，受体、膜蛋白。非活性蛋白：胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白。非活性蛋白：胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白。一、蛋白质的元素组成一、蛋白质的元素组成二二、组成蛋白质分子的基本单位、组成蛋白质分子的基本单位氨基酸氨基酸三、肽键与肽三、肽键与肽第一节第一节 蛋白质的分子组成蛋白质的分子组成多数蛋白质含多数蛋白质含: : 碳碳(C)50(C)5056% 56% 氢氢(H)6(H)68%8% 氧氧(O)19(O)1924% 24% 氮氮(N)13(N)1319%19% 硫硫(S)0(S)04%4%有些蛋白质含有磷有些蛋白质含有磷少数含铁、铜、锰、锌、钴、钼等少数含铁、铜、锰、锌、钴、钼等个别还含有碘个别还含有碘一、蛋白质的元素组成一、蛋白质的元素组成1 1凯氏凯氏(Kjedahl)(Kjedahl)定氮法定氮法一、蛋白质的元素组成一、蛋白质的元素组成2 2 每克样品含氮的克数每克样品含氮的克数 6.25100 6.25100 =100 =100克样品中蛋白质的含量克样品中蛋白质的含量( (克克%)%)（一）蛋白质的水解（一）蛋白质的水解（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类（三）不常见的氨基酸（三）不常见的氨基酸（四）氨基酸的一般理化性质（四）氨基酸的一般理化性质二、氨基酸二、氨基酸（五）氨基酸的化学反应（五）氨基酸的化学反应1 1酸水解酸水解2 2碱水解碱水解3 3酶水解酶水解（一）蛋白质的水解（一）蛋白质的水解（一）蛋白质的水解（一）蛋白质的水解1 1（酸水解）（酸水解） 常用方法：常用方法：硫酸或盐酸处理硫酸或盐酸处理 浓度浓度: :盐酸为盐酸为6mol/L 硫酸为硫酸为4mol/L 条件条件: :回流煮沸回流煮沸20小时左右小时左右 优点优点: :不引起消旋作用，得到不引起消旋作用，得到L-氨基酸氨基酸 缺点缺点: :色氨酸完全被沸酸所破坏色氨酸完全被沸酸所破坏 羟基氨基酸（丝羟基氨基酸（丝,苏）部分被水解苏）部分被水解 天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被 水解下来。水解下来。 （一）蛋白质的水解（一）蛋白质的水解1 1（碱水解）（碱水解）常用方法：常用方法：用氢氧化钠处理用氢氧化钠处理浓度浓度: : 5mol/L条件条件: :共煮共煮1020h优点优点: :色氨酸稳定色氨酸稳定缺点缺点: :多数氨基酸遭到不同程度的破坏，多数氨基酸遭到不同程度的破坏， 并且产生消旋现象；所得为并且产生消旋现象；所得为D型和型和 L型混合氨基酸；碱水解引起精氨型混合氨基酸；碱水解引起精氨 酸脱氨，生成鸟氨酸和尿素。酸脱氨，生成鸟氨酸和尿素。（一）蛋白质的水解（一）蛋白质的水解1 1（酶水解（酶水解1 1）优点优点: :不产生消旋作用，也不破坏氨基酸。不产生消旋作用，也不破坏氨基酸。缺点缺点: :需要几种酶协同作用，酶水解所需时需要几种酶协同作用，酶水解所需时 间较长。间较长。 （一）蛋白质的水解（一）蛋白质的水解1 1（酶水解（酶水解2 2）（牛胰蛋白酶）（牛胰蛋白酶）胰胰蛋蛋白白酶酶1 1（一）蛋白质的水解（一）蛋白质的水解1 1（酶水解（酶水解2 2）NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位点水解位点R1R1：赖氨酸（赖氨酸（Lys） 精氨酸（精氨酸（Arg）特点：特点：专一性较强，水解速度快专一性较强，水解速度快胰胰蛋蛋白白酶酶2 2（一）蛋白质的水解（一）蛋白质的水解1 1（酶水解（酶水解3 3）糜糜蛋蛋白白酶酶1 1（一）蛋白质的水解（一）蛋白质的水解1 1（酶水解（酶水解3 3）糜糜蛋蛋白白酶酶2 2NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位点水解位点R1R1：苯丙氨酸苯丙氨酸(Phe) 色氨酸（色氨酸（Trp） 苏氨酸苏氨酸(Thr) 亮氨酸亮氨酸(Leu)特点：特点：水解稍慢水解稍慢（一）蛋白质的水解（一）蛋白质的水解1 1（酶水解（酶水解4 4）胃胃蛋蛋白白酶酶1 1（一）蛋白质的水解（一）蛋白质的水解1 1（酶水解（酶水解4 4）胃胃蛋蛋白白酶酶2 2NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位点水解位点R1R1、R2R2：苯丙氨酸苯丙氨酸(Phe) 色氨酸色氨酸（Trp）苏氨酸）苏氨酸(Thr) 亮氨酸亮氨酸(Leu)特点：特点：水解速度较快水解速度较快 氨基酸是含有氨基的酸氨基酸是含有氨基的酸CHRCOOH3N+ ( (甘油醛的甘油醛的D D型、型、L L型型) )D-D-甘油醛甘油醛L-L-甘油醛甘油醛透视式透视式投影式投影式氨基酸的构型氨基酸的构型L氨基酸氨基酸D氨基酸氨基酸（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（三种分类法）（三种分类法）1 1根据其化学结构分为：根据其化学结构分为： （1）脂肪族氨基酸）脂肪族氨基酸 （2）芳香族氨基酸）芳香族氨基酸 （3）杂环氨基酸）杂环氨基酸2 2根据酸碱性质根据酸碱性质 （1）酸性氨基酸）酸性氨基酸 （2）碱性氨基酸）碱性氨基酸 （3）中性氨基酸）中性氨基酸3 3根据根据R R基团的极性基团的极性 （1）非极性）非极性R基氨基酸基氨基酸 （2）极性）极性R基氨基酸基氨基酸 （不带电荷的、带正电荷的、带负电荷的）（不带电荷的、带正电荷的、带负电荷的）（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸1 1一氨基一羧基氨基酸一氨基一羧基氨基酸1 1普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号甘氨酸甘氨酸氨基乙酸氨基乙酸 GlycineGly(G)甘甘（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸2 2一氨基一羧基氨基酸一氨基一羧基氨基酸2 2普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号丙氨酸丙氨酸 - -氨基丙氨基丙酸酸AlanineAlanineAlaAla( (A A) )丙丙（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸3 3一氨基一羧基氨基酸一氨基一羧基氨基酸3 3普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号缬氨酸缬氨酸 - -氨基异氨基异戊酸戊酸ValineValineValVal(V)(V)缬缬（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸4 4一氨基一羧基氨基酸一氨基一羧基氨基酸4 4普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号亮氨酸亮氨酸 - -氨基异氨基异己酸己酸LeucineLeucineLeuLeu( (L L) )亮亮（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸5 5一氨基一羧基氨基酸一氨基一羧基氨基酸5 5普通名称普通名称 化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号异亮氨酸异亮氨酸 - -氨基氨基- - - -甲基戊酸甲基戊酸IleucineIleucine IleIle( (I I) )异亮异亮（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸6 6一氨基二羧基氨基酸一氨基二羧基氨基酸1 1普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号天冬氨酸天冬氨酸 - -氨基氨基丁二酸丁二酸AspartateAspartateAspAsp( (D)D)天天（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸7 7一氨基二羧基氨基酸一氨基二羧基氨基酸2 2普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号谷氨酸谷氨酸 - -氨基氨基戊二酸戊二酸GlutamateGlutamate GluGlu(E)(E)谷谷（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸7 7含酰胺基氨基酸含酰胺基氨基酸1 1普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号天冬酰胺天冬酰胺AsparagineAsnAsn( (N)N)（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸9 9含酰胺基氨基酸含酰胺基氨基酸2 2普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号谷氨酰胺谷氨酰胺GlutamineGlutamine GlnGln(Q)(Q)（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸1010二氨基一羧基氨基酸二氨基一羧基氨基酸1 1普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号精氨酸精氨酸 - -氨基氨基- - - -胍基戊胍基戊酸酸ArginineArginineArgArg(R)(R)精精（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸1111二氨基一羧基氨基酸二氨基一羧基氨基酸2 2普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代代号号鸟氨酸鸟氨酸 - - 二氨二氨基戊基戊酸酸Ornithine Orn鸟鸟（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸1212二氨基一羧基氨基酸二氨基一羧基氨基酸3 3普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号赖氨酸赖氨酸 ， - -二氨二氨基己酸基己酸LysineLysineLysLys(K)(K)赖赖（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸1313羟基氨基酸羟基氨基酸1 1普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号丝氨酸丝氨酸 - -氨基氨基- - - -羟羟基丙基丙酸酸SerineSerineSerSer(S)(S)丝丝 （二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸1414羟基氨基酸羟基氨基酸2 2普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号苏氨酸苏氨酸 - -氨基氨基- - - -羟基丁羟基丁酸酸ThreonineThreonine ThrThr(T)(T)苏苏（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸1515含硫基氨基酸含硫基氨基酸1 1普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号半胱氨酸半胱氨酸 - -氨基氨基- - - -巯基丙巯基丙酸酸CysteineCysteine CysCys(C)(C)半胱半胱（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸1616含硫基氨基酸含硫基氨基酸2 2普通名称普通名称化学名化学名英文名英文名代号代号 代号代号胱氨酸胱氨酸二二( ( - -氨基氨基- - - -巯基丙巯基丙酸酸) )CysteineCysteineCysCys-Cys-Cys胱胱（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构1 1）脂脂肪肪族族氨氨基基酸酸1717含硫基氨基酸含硫基氨基酸3 3普通名称普通名称 化学名化学名英文名英文名代号代号 代号代号甲硫氨酸甲硫氨酸( (蛋氨酸蛋氨酸) ) - -氨基氨基- - - -甲甲硫基丁酸硫基丁酸MethionineMethionine Met Met ( (M M) )甲硫甲硫（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构2 2）芳芳香香族族氨氨基基酸酸1 1普通名称普通名称 化学名化学名英文名英文名代号代号代号代号苯丙氨酸苯丙氨酸 - -氨基氨基- - - -苯苯基丙基丙酸酸PhenylalaPhenylalanineninePhePhe(F)(F)苯丙苯丙（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构2 2）芳芳香香族族氨氨基基酸酸2 2普通名称普通名称 化学名化学名英文名英文名代号代号 代号代号酪氨酸酪氨酸 - -氨基氨基- - - -对对羟苯基丙羟苯基丙酸酸TyrosineTyrosineTyrTyr(Y)(Y)酪酪（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构3 3）杂杂环环氨氨基基酸酸1 1普通名称普通名称 化学名化学名英文名英文名代号代号 代号代号组氨酸组氨酸 - -氨基氨基- - - -咪咪唑基丙唑基丙酸酸HistidineHistidineHisHis(H)(H)组组（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构3 3）杂杂环环氨氨基基酸酸2 2普通名称普通名称 化学名化学名英文名英文名代号代号 代号代号色氨酸色氨酸 - -氨基氨基- - - -吲吲哚基丙哚基丙酸酸TryptophanTryptophan TrpTrp(W)(W)色色（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构3 3）杂杂环环氨氨基基酸酸3 3普通名称普通名称 化学名化学名英文名英文名代号代号 代号代号脯氨酸脯氨酸四氢四氢吡咯吡咯-2-2- -羧酸羧酸ProlineProlineProPro(P)(P)脯脯亚氨基酸亚氨基酸（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1 1（据化学结构（据化学结构3 3）杂杂环环氨氨基基酸酸4 4普通名称普通名称 化学名化学名英文名英文名代号代号 代号代号羟脯氨酸羟脯氨酸 4 4- -羟基吡咯烷羟基吡咯烷- -2 2- -羧酸羧酸HydroxprolHydroxprolineineHypHyp羟羟（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类2 2（据酸碱性质）（据酸碱性质）酸酸性性氨氨基基酸酸天冬氨酸天冬氨酸谷氨酸谷氨酸（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类2 2（据酸碱性质）（据酸碱性质）碱碱性性氨氨基基酸酸赖氨酸赖氨酸精氨酸精氨酸组氨酸组氨酸（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类2 2（据酸碱性质）（据酸碱性质）中中性性氨氨基基酸酸 含一氨基一羧基的氨含一氨基一羧基的氨基酸，包括两种酸性氨基基酸，包括两种酸性氨基酸产生的酰胺（谷氨酰胺酸产生的酰胺（谷氨酰胺和天冬酰胺）。和天冬酰胺）。（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类3 3（据（据R R基因极性）基因极性）非非极极性性氨氨基基酸酸1 1苯丙氨酸苯丙氨酸胱氨酸胱氨酸蛋氨酸蛋氨酸甘氨酸甘氨酸丙氨酸丙氨酸缬氨酸缬氨酸亮氨酸亮氨酸异亮氨酸异亮氨酸脯氨酸脯氨酸色氨酸色氨酸（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类3 3（据（据R R基团极性）基团极性）非非极极性性氨氨基基酸酸2 2 甘氨酸按理属于极性甘氨酸按理属于极性的，但因其的，但因其-碳上的氢碳上的氢受到易解离的受到易解离的-氨基和氨基和-羧基的影响，因此不羧基的影响，因此不体现极性。体现极性。（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类3 3（据（据R R基团极性）基团极性）极极性性氨氨基基酸酸1 1不带电荷的不带电荷的酪氨酸酪氨酸半胱氨酸半胱氨酸丝氨酸丝氨酸苏氨酸苏氨酸天冬酰胺天冬酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类3 3（据（据R R基团极性）基团极性）极极性性氨氨基基酸酸2 2带正电荷的带正电荷的(碱性氨基酸碱性氨基酸)赖氨酸赖氨酸精氨酸精氨酸组氨酸组氨酸（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类3 3（据（据R R基团极性）基团极性）极极性性氨氨基基酸酸3 3带负电荷的带负电荷的(酸性氨基酸酸性氨基酸)天冬氨酸天冬氨酸谷氨酸谷氨酸（三）不常见的氨基酸（三）不常见的氨基酸 - -丙氨酸丙氨酸 - -氨基丁酸氨基丁酸其他见：南大其他见：南大P75P75 工科工科P45 P45 表表4-24-2H H2 2N-CHN-CH2 2-CH-CH2 2-COOH-COOHH H2 2N-CHN-CH2 2-CH-CH2 2-CH-CH2 2-COOH-COOH（四）氨基酸的一般理化性质（四）氨基酸的一般理化性质1 1物物理理性性质质物理性状：无色结晶物。物理性状：无色结晶物。熔点：熔点高，一般在熔点：熔点高，一般在200200以上。以上。溶解性：通常能溶于极性溶剂溶解性：通常能溶于极性溶剂, , 而而不溶于非极性溶剂不溶于非极性溶剂; ;各种氨基酸在水各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中。稀酸或稀碱中。（四）氨基酸的一般理化性质（四）氨基酸的一般理化性质2 2两两性性解解离离和和等等电电点点1 1 氨基酸在溶液中主要以兼性氨基酸在溶液中主要以兼性离子形式存在离子形式存在CHRCOOH3N+（四）氨基酸的一般理化性质（四）氨基酸的一般理化性质2 2两两性性解解离离和和等等电电点点2 2加酸时加酸时CHRCOOHH3N+H+H+总电荷总电荷 “+”（四）氨基酸的一般理化性质（四）氨基酸的一般理化性质2 2两两性性解解离离和和等等电电点点3 3加碱时加碱时CHRCOO-H2N总电荷总电荷 “”OHOH（四）氨基酸的一般理化性质（四）氨基酸的一般理化性质2 2两两性性解解离离和和等等电电点点5 5 当溶液为某一当溶液为某一pHpH值，氨基酸值，氨基酸分子中所含的分子中所含的-NH-NH3 3+ +和和-COO-COO- -数目正数目正好相等时好相等时( (净电荷为净电荷为0),0),这一这一pHpH值值即为氨基酸的等电点，简称即为氨基酸的等电点，简称pIpI。在等电点时，氨基酸既不向正极在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。两性离子状态。（四）氨基酸的一般理化性质（四）氨基酸的一般理化性质2 2两两性性解解离离和和等等电电点点4 4COOCHH3N+R+OH+H+COOCHH2NR+OH+H+在酸性溶在酸性溶液中液中（pH pI）在晶体状态或在晶体状态或水溶液中水溶液中（pH=pI）在碱性溶在碱性溶液中液中（pHpI）（四）氨基酸的一般理化性质（四）氨基酸的一般理化性质2 2两两性性解解离离和和等等电电点点7 7丙氨酸丙氨酸pIpI的计算的计算COOCH+H+H3N+CH3 K1COOHCHH3N+CH3COOCHH2NCH3 K2Ala+Ala AlaK1=AlaH+/ Ala+ Ala+= Ala H +/ K1K2=AlaH+/ Ala Ala=Ala K2/ H +到达等电点时，到达等电点时， Ala+= AlaAla H +/ K1 = Ala K2/ H +，即：，即： K1 K2 = H +2两边取负对数：两边取负对数：lg H +2= lg K1lg K2 lg H + =pH lg K1 = pK1 lg K1 = pK2 2pH = pK1 pK2 令令pI为等电点时的为等电点时的pH，则则： pI （pK1 pK2）/2（四）氨基酸的一般理化性质（四）氨基酸的一般理化性质2 2两两性性解解离离和和等等电电点点8 8天冬氨酸天冬氨酸pIpI的计算的计算Asp+Asp Asp COOHC HH3N+CH2COOHCOOCHH3N+CH2COOHCOOCHH2NCH2COOH K1 KR K2Asp =COOCHH2NCH2COO等电点时为等电点时为Asp pI （pK1 pKR）/2（四）氨基酸的一般理化性质（四）氨基酸的一般理化性质2 2两两性性解解离离和和等等电电点点9 9赖氨酸赖氨酸pIpI的计算的计算Lys+ +Lys +Lys COOHC HH3N+(CH2)4NH3+COOCHH3N+(CH2)4NH3+COOCHH2N(CH2)4NH3+ K1 K2 KRLys COOCHH2NCH2NH2等电点时为等电点时为Lys pI （pK2 pKR）/2（四）氨基酸的一般理化性质（四）氨基酸的一般理化性质2 2两两性性解解离离和和等等电电点点6 6l侧链不含解离基团的中性氨基酸，其等电侧链不含解离基团的中性氨基酸，其等电点是它的点是它的pKpK1 1和和pKpK2 2的算术平均值：的算术平均值：pI = pI = (pK(pK1 1 + pK + pK2 2 )/2 )/2 l同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其其pIpI值也决定于两性离子两边的值也决定于两性离子两边的pKpK值的算值的算术平均值。术平均值。l酸性氨基酸：酸性氨基酸：pI = (pKpI = (pK1 1 + pK + pKR R)/2 )/2 l碱性氨基酸：碱性氨基酸：pI = (pKpI = (pK2 2 + pK + pKR R)/2)/2 （四）氨基酸的一般理化性质（四）氨基酸的一般理化性质3 3芳芳香香族族氨氨基基酸酸的的紫紫外外吸吸收收光光谱谱1 1构成蛋白质的构成蛋白质的2020种氨基酸在可见光区种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)(97%97%以上）。以上）。2.2.知道蛋白质的分子量。知道蛋白质的分子量。3.3.知道蛋白质由几个亚基组成。知道蛋白质由几个亚基组成。4.4.测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。计算每种氨基酸的个数。5.5.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。测定蛋白质的一级结构的要求测定蛋白质的一级结构的要求二、一级结构的研究方法二、一级结构的研究方法2 2（一）测定氨基酸的组成（一）测定氨基酸的组成（二）蛋白质的（二）蛋白质的N-N-末端和末端和C-C-末端的测定末端的测定（三）二硫键的拆开和肽链的分离（三）二硫键的拆开和肽链的分离（四）肽链的部分水解和肽段的分离（四）肽链的部分水解和肽段的分离（五）肽段的氨基酸顺序的测定（五）肽段的氨基酸顺序的测定（六）二硫键位置的确定（六）二硫键位置的确定（二）蛋白质（二）蛋白质N-N-末端和末端和C-C-末端测定末端测定1 1N-N-末末端端残残基基的的分分析析1 1二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB）法（）法（-氨基反应）氨基反应）SangerSanger法。法。2,4-2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-N-端的游离端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNPDNP）。）。在酸性条件下水解，得到黄色在酸性条件下水解，得到黄色DNP-DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的分离。不同的DNP-DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。氨基酸可以用色谱法进行鉴定。（二）蛋白质（二）蛋白质N-N-末端和末端和C-C-末端测定末端测定1 1N-N-末末端端残残基基的的分分析析2 2二甲基氨基萘磺酰氯（称丹磺酰氯）法二甲基氨基萘磺酰氯（称丹磺酰氯）法在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-N-端氨基酸的端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰游离氨基作用，得到丹磺酰- -氨基酸。氨基酸。此法的优点是丹磺酰此法的优点是丹磺酰- -氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到1 1 1010-9-9molmol。（二）蛋白质（二）蛋白质N-N-末端和末端和C-C-末端测定末端测定1 1N-N-末末端端残残基基的的分分析析3 3异硫氰酸苯酯（异硫氰酸苯酯（PITCPITC）法）法 此法最大优点是除去此法最大优点是除去N N末端氨基酸后剩下的肽链部分仍是完整的。末端氨基酸后剩下的肽链部分仍是完整的。因此，可以用来一步步地测定多肽链因此，可以用来一步步地测定多肽链N N末端的氨基酸顺序。氨基酸分析末端的氨基酸顺序。氨基酸分析仪就是根据此原理制成的。仪就是根据此原理制成的。NH2CHCOR2NCSNHCHCOR2NCHCOR1HHNHS:CCH COR1HNNH CH COR2SNHCNHOCR1CHNCOCHNHSCR1（二）蛋白质（二）蛋白质N-N-末端和末端和C-C-末端测定末端测定1 1N-N-末末端端残残基基的的分分析析4 4氨肽酶法氨肽酶法氨肽酶是从胰腺中提取是一种肽链外切酶，它氨肽酶是从胰腺中提取是一种肽链外切酶，它能从多肽链的能从多肽链的N-N-端逐个的向里水解。端逐个的向里水解。根据根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-N-末端末端残基顺序。残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为酸残基为N-N-末端的肽键速度最大。末端的肽键速度最大。（二）蛋白质（二）蛋白质N-N-末端和末端和C-C-末端测定末端测定2 2C-C-末末端端残残基基的的分分析析1 1硼氢化锂还原法硼氢化锂还原法(-(-羧基反应羧基反应) )RCHCOOHNH2LiBH4 还原还原RCHCH2OHNH2-氨基醇氨基醇可以用层析法加以鉴定可以用层析法加以鉴定（二）蛋白质（二）蛋白质N-N-末端和末端和C-C-末端测定末端测定2 2C-C-末末端端残残基基的的分分析析2 2肼解法肼解法(-(-羧基反应羧基反应) ) 多肽与肼在无水条件下加热，多肽与肼在无水条件下加热，C-C-端氨基酸即从端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-C-端端氨基酸分离。氨基酸分离。（二）蛋白质（二）蛋白质N-N-末端和末端和C-C-末端测定末端测定2 2C-C-末末端端残残基基的的分分析析3 3羧肽酶法羧肽酶法1 1羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-C-端端逐个的水解。根据不同的反应时间测出酶水解所逐个的水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-C-末端残基顺序。末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：目前常用的羧肽酶有四种：A,B,CA,B,C和和Y Y。A A和和B B来自来自胰脏；胰脏；C C来自柑桔叶；来自柑桔叶；Y Y来自面包酵母。来自面包酵母。羧肽酶羧肽酶A A能水解除能水解除Pro,ArgPro,Arg和和LysLys以外的所有以外的所有C-C-末端末端氨基酸残基；氨基酸残基；B B只能水解只能水解ArgArg和和LysLys为为C-C-末端残基的末端残基的肽键。肽键。但实际有时相连的氨基酸以相近的速度释放，结但实际有时相连的氨基酸以相近的速度释放，结果不好分析。果不好分析。（二）蛋白质（二）蛋白质N-N-末端和末端和C-C-末端测定末端测定2 2C-C-末末端端残残基基的的分分析析3 3羧肽酶法羧肽酶法2 2氨氨基基酸酸的的释释放放量量（摩摩尔尔数数）反应时间反应时间GlySerVal判断序列判断序列 -Val-Ser-Gly-COOH（三）二硫键的拆开和肽链的分离（三）二硫键的拆开和肽链的分离1 1如果肽链之间是以二硫键交连的，或者虽如果肽链之间是以二硫键交连的，或者虽然蛋白质分子由一条肽链构成，有链内的二然蛋白质分子由一条肽链构成，有链内的二硫键，则必须采取一些方法将二硫键拆开。硫键，则必须采取一些方法将二硫键拆开。最普遍的方法是用过量的巯基乙醇处理，最普遍的方法是用过量的巯基乙醇处理，然后用碘乙酸保护还原时生成的半胱氨酸巯然后用碘乙酸保护还原时生成的半胱氨酸巯基，以防它重新被氧化。基，以防它重新被氧化。二硫键拆开后形成的个别肽链，可能用纸二硫键拆开后形成的个别肽链，可能用纸层析、离子交换柱层析、逆流分溶、区带电层析、离子交换柱层析、逆流分溶、区带电泳等方法进行分离。泳等方法进行分离。（三）二硫键的拆开和肽链的分离（三）二硫键的拆开和肽链的分离2 2SH +SHS SHOCH2CH2SHICH2COOH 涉及反应涉及反应pH8.09.0,室温室温S CH2COO（四）肽链部分水解和肽段分离（四）肽链部分水解和肽段分离此步骤是测定氨基酸顺序工作中的一个关键步骤。此步骤是测定氨基酸顺序工作中的一个关键步骤。通通常常是是选选择择了了专专一一性性很很强强的的蛋蛋白白酶酶来来完完成成的的。最最理理想想的的酶酶是是胰胰蛋蛋白白酶酶，它它很很容容易易得得到到结结晶晶纯纯品品。胰胰蛋蛋白白酶酶专专门门水水解解由由碱碱性性氨氨基基酸酸（赖赖氨氨酸酸或或精精氨氨酸酸）的的羧羧基基参参加加形形成成肽肽键键。所所以以水水解解后后的的产产物物C-C-端端为为赖赖氨酸或精氨酸。氨酸或精氨酸。经经常常使使用用的的还还有有糜糜蛋蛋白白酶酶、胃胃蛋蛋白白酶酶及及专专一一性性较较差差的的嗜嗜热热菌菌蛋蛋白白酶酶、溴溴化化氰氰等等。各各种种酶酶的的作作用用位位点点参见参见北大北大P122P122。多多肽肽链链经经部部分分水水解解后后，即即降降解解成成长长短短不不一一的的较较小小肽肽段段，这这些些肽肽段段可可以以应应用用层层析析和和电电泳泳加加以以分分离离和和提提纯。纯。（五）肽段的氨基酸顺序的测定（五）肽段的氨基酸顺序的测定1 1 测定多肽链中分离出来的各个小测定多肽链中分离出来的各个小肽段，可以应用化学方法或酶学方法肽段，可以应用化学方法或酶学方法测出其中的氨基酸顺序。然后比较用测出其中的氨基酸顺序。然后比较用不同方法获得的几套肽段的氨基酸顺不同方法获得的几套肽段的氨基酸顺序，根据它们彼此有重叠的部分，确序，根据它们彼此有重叠的部分，确定每个肽段的适当位置。拼凑出整个定每个肽段的适当位置。拼凑出整个肽链的氨基酸顺序。肽链的氨基酸顺序。 （五）肽段的氨基酸顺序的测定（五）肽段的氨基酸顺序的测定2 2 肽肽顺序顺序A A1 1 B B1 1A A2 2B B2 2 A A3 3B B3 3 A A4 4Ala.Phe(Ala.Phe(丙丙- -苯丙苯丙) )Ala.Phe.Gly.Lys(Ala.Phe.Gly.Lys(甘甘- -赖赖) ) Gly.Lys.Asn.Tyr(- Gly.Lys.Asn.Tyr(-天冬酰天冬酰- -酪酪) ) Asn.Tyr.Arg(- Asn.Tyr.Arg(-精精) ) Arg.Tyr(- Arg.Tyr(-酪酪) ) Tyr.His(- Tyr.His(-组组) ) His.Val(- His.Val(-缬缬) )十肽十肽顺序顺序Ala.Phe.Gly.Lys.Asn.Tyr.Arg.Tyr.His.Val Ala.Phe.Gly.Lys.Asn.Tyr.Arg.Tyr.His.Val （六）二硫键位置的确定（六）二硫键位置的确定1 1 一一般般可可用用蛋蛋白白酶酶或或酸酸直直接接水水解解原原来来的的蛋蛋白白质质，从从部部分分水水解解产产物物中中分分离离出出含含有有二二硫硫键键的的肽肽段段，所所得得到到的的肽肽段段混混合合物物可可用用BrownBrown及及HarltayHarltay的的对对角角线线电电泳泳技技术进行分离，确定二硫键位置。术进行分离，确定二硫键位置。确确定定二二硫硫键键位位置置一一般般用用胃胃蛋蛋白白酶酶水水解解原原来来的的含含二二硫硫链链的的蛋蛋白白质质。因因为为胃胃蛋蛋白白酶酶专专一一性性较较低低，切切点点多多，这这样样生生成成的的肽肽段段（包包括括含含有有二二硫硫桥桥的的肽肽段段）都都比比较较小小，后后面面的的分分离离、鉴鉴定定工工作作均均比比较较容容易易进进行行。其其次次是是胃胃蛋蛋白白酶酶的的pHpH在在酸酸性性范范围围（2 2），有有利利于于防防止止二二硫键发生交换反应而造成麻烦。硫键发生交换反应而造成麻烦。（六）二硫键位置的确定（六）二硫键位置的确定2 2 BrownBrown和和HartlayHartlay对角线电泳图解对角线电泳图解+ +- -+ +- -第第二二向向第一向第一向a ab bpH6.5pH6.5图中图中a a、b b两个斑点是两个斑点是由一个二硫键断裂产由一个二硫键断裂产生的肽段生的肽段三、肽的人工合成原理三、肽的人工合成原理1 1（总合成步骤）（总合成步骤）1 1加加保保护护基基Y Y，保保护护氨氨基基酸酸甲甲的的自自由由氨氨基基（-NH-NH2 2）。）。2 2加加保保护护基基Z Z，保保护护氨氨基基酸酸乙乙的的自自由由羧羧基基(-(-COOH)(COOH)(此反应同时活化了氨基）。此反应同时活化了氨基）。3 3加加活活化化基基X X，使使加加保保护护基基Y Y的的氨氨基基酸酸甲甲的的羧基活化。羧基活化。4 4使使-NH-NH2 2被被保保护护羧羧基基被被活活化化的的氨氨基基酸酸甲甲，同同羧羧基基被被保保护护氨氨基基被被活活化化的的氨氨基基酸酸乙乙结结合合成成肽。肽。5 5脱保护基脱保护基Y Y和和Z Z。 三、肽的人工合成原理三、肽的人工合成原理2 2（分合成步骤）（分合成步骤） 1 1加加保保护护基基Y Y来来保保护护氨氨基基酸酸甲甲的的自自由由氨基（氨基（-NH-NH2 2）。）。R1CHCOOYNH3R1CHCOO Y.NH三、肽的人工合成原理三、肽的人工合成原理2 2（分合成步骤）（分合成步骤） 2 2加加保保护护基基Z Z来来保保护护氨氨基基酸酸乙乙的的自自由由羧羧基基(-COOH)(-COOH)(此反应同时活化了氨基）。此反应同时活化了氨基）。R1CHCOOZNH3R1CHCOOZNH2三、肽的人工合成原理三、肽的人工合成原理2 2（分合成步骤）（分合成步骤） 3 3加加活活化化基基X X使使加加保保护护基基Y Y的的氨氨基基酸酸甲甲的羧基活化。的羧基活化。R2CHCOO+X Y.NHR2CHCOX Y.NH三、肽的人工合成原理三、肽的人工合成原理2 2（分合成步骤）（分合成步骤） 4 4使使-NH-NH2 2被被保保护护羧羧基基被被活活化化了了的的氨氨基基酸酸甲甲, ,同同羧羧基基被被保保护护氨氨基基被被活活化化了了的的氨氨基酸乙结合成肽。基酸乙结合成肽。R2CHCOOZNH2R1CHCOX Y.NHR1CHCO Y.NHR2CHCOOZ HXNH三、肽的人工合成原理三、肽的人工合成原理2 2（分合成步骤）（分合成步骤） 5 5脱保护基脱保护基Y Y和和Z Z。 R1CHCO Y.NHR2CHCOOZ HXNH 脱保护基剂脱保护基剂R1CHCO NH3+R2CHCOONH三、肽的人工合成原理三、肽的人工合成原理3 3（肽链的延长（肽链的延长) ) 如如果果欲欲再再延延长长肽肽链链，可可将将保保护护基基Y Y或或Z Z去去掉掉一一个个，所所得得含含自自由由氨氨基基或或自自由由羧羧基基的的肽肽，按按照照上上述述3,43,4步进行即可。步进行即可。三、肽的人工合成原理三、肽的人工合成原理4 4（常用（常用X,Y,Z)X,Y,Z)常常见见的的氨氨基基保保护护基基Y Y：对对甲甲苯苯磺磺酰酰基基（tosyltosyl或或TosTos基基）、苄苄氧氧羰羰基基(C(C6 6H H5 5CHCH2 2OCO-OCO-，CbZCbZ基基) )。 叔叔丁丁氧氧羰羰基基(CCH(CCH3 3)3CO-CO-)3CO-CO-，BocBoc基基）或或三三苯苯甲甲基基（C C6 6H H5 5）3-C3-C即即lrityllrityl基。基。羧羧基基活活化化基基X X：可可用用PClPCl5 5使使氨氨基基酸酸酰酰氯氯化化，即即将将羧羧基基变变为为COClCOCl基基。也也可可用用联联氨氨和和HNOHNO2 2使使羧羧基基叠叠氮化成氮化成-CON-CON3 3。羧羧基基保保护护基基Z Z：可可用用酯酯化化或或皂皂化化使使羧羧基基变变为为- -COOCCOOC2 2H H5 5或或-COONa-COONa，此反应同时亦活化了氨基。，此反应同时亦活化了氨基。三、肽的人工合成原理三、肽的人工合成原理5 5（合成方法（合成方法) )液液相相合合成成法法：合合成成在在溶溶液液中中进进行行，这这种种方法费力，目前不被采用。方法费力，目前不被采用。固固相相合合成成法法：采采用用固固相相支支持持物物，反反应应在在支支持持物物上上进进行行。常常用用的的支支持持物物如如：苯苯乙乙烯烯与与二二乙乙烯烯基基苯苯的的共共聚聚物物，再再经经氯氯甲甲基基化化而而成成，简简称称氯氯甲甲基基聚聚乙乙烯烯树树脂脂。（利利用用树树脂脂合成肽的流程见南大合成肽的流程见南大P P100100）。）。多肽的合成多肽的合成1 1多肽的合成多肽的合成2 2四、蛋白质的三维构象四、蛋白质的三维构象1 1( (目录）目录）( (一一) )研究构象的方法研究构象的方法 ( (二二) )蛋白质分子的二级结构蛋白质分子的二级结构 ( (三三) )蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构 ( (四四) )蛋白质分子的四级结构蛋白质分子的四级结构 四、蛋白质的三维构象四、蛋白质的三维构象2 2 ( (定义）定义） 蛋白质分子的三维构象也称空蛋白质分子的三维构象也称空间结构或高级结构。指的是蛋白质间结构或高级结构。指的是蛋白质分子中原子基团在三维空间上的排分子中原子基团在三维空间上的排列、分布及肽链的走向。列、分布及肽链的走向。 四、蛋白质的三维构象四、蛋白质的三维构象3 3 ( (示例示例1 1蛋白酶蛋白酶抑制剂）抑制剂）四、蛋白质的三维构象四、蛋白质的三维构象3 3 ( (示例示例2 2虾红素）虾红素）四、蛋白质的三维构象四、蛋白质的三维构象3 3 ( (示例示例3 3木瓜及木瓜及组织蛋白酶）组织蛋白酶）四、蛋白质的三维构象四、蛋白质的三维构象3 3 ( (示例示例4 4鸡半胱鸡半胱氨酸抑制剂）氨酸抑制剂）四、蛋白质的三维构象四、蛋白质的三维构象3 3 ( (示例示例5 5）( (一一) )研究构象的方法研究构象的方法 1 1 其原理与光学显微镜或电子显微镜的其原理与光学显微镜或电子显微镜的原理基本相似，但光源波长很短。原理基本相似，但光源波长很短。 =0.154nm=0.154nm，为一衍射波，得到一张衍射，为一衍射波，得到一张衍射图。经数学方法重组，绘出电子密度图，图。经数学方法重组，绘出电子密度图，从中构建出三维分子图象从中构建出三维分子图象分子结构模分子结构模型。型。 1 1X-X-射线衍射法：射线衍射法：( (一一) )研究构象的方法研究构象的方法 2 22 2重氢交换法和旋光色散法：重氢交换法和旋光色散法：测定测定蛋白质分子中蛋白质分子中-螺旋体的含量。螺旋体的含量。3 3核磁共振光谱法：核磁共振光谱法：测定蛋白质分测定蛋白质分子中哪个氨基酸残基发生构象变化子中哪个氨基酸残基发生构象变化。4 4园二色法：园二色法：测定测定-螺旋和螺旋和-折折叠片的含量。叠片的含量。5 5荧光、荧光偏振法等荧光、荧光偏振法等 （二）蛋白质分子的二级结构（二）蛋白质分子的二级结构1 1定义：定义：蛋白质的二级结构是指蛋白蛋白质的二级结构是指蛋白质多肽链（一级结构）本身的折叠和质多肽链（一级结构）本身的折叠和盘绕的方式。盘绕的方式。类型：类型：天然蛋白质一般均含有天然蛋白质一般均含有-螺螺旋、旋、-折叠和折叠和-转角的结构。转角的结构。 （二）蛋白质分子的二级结构（二）蛋白质分子的二级结构2 2维持维持蛋白蛋白质分质分子构子构象的象的化学化学键键1 1（1 1）氢氢键键：一一个个氢氢原原子子连连接接两两个个电电负负性性强强的的原原子子（如如氧氧、氮氮等等）。其其中中一一个个为为共共价价键键，另另一一个个即即为为氢氢键键。在在-螺螺旋旋和和-折折叠叠中中占占有有极极重重要要的的地地位位，对对蛋蛋白白质质分分子子三维构象的维护也很重要。三维构象的维护也很重要。（2 2）静静电电引引力力：正正负负带带电电基基团团之之间间的的吸吸引引力力，如如NHNH4 4+ +与与COOCOO- -。静静电电引引力力较较强强，但但对对蛋蛋白白质质分分子子三三维维构构象象的的稳稳定定贡贡献献不不是是很很大，有时也称为离子键或盐键。大，有时也称为离子键或盐键。（二）蛋白质分子的二级结构（二）蛋白质分子的二级结构2 2维持维持蛋白蛋白质分质分子构子构象的象的化学化学键键2 2（3 3）范范德德华华力力：是是分分子子间间的的吸吸引引力力，是是原原子子团团相相互互接接近近时时诱诱导导产产生生的的。它它变变化化多多样样，对对维维持持蛋蛋白白质质活活性性中中心心的的构构象象影响很大。影响很大。（4 4）疏疏水水相相互互作作用用：是是非非极极性性基基团团为为了了避避开开水水相相而而群群集集在在一一起起的的作作用用力力。疏疏水水作作用用是是维维持持蛋蛋白白质质高高级级结结构构的的重重要要因因素。素。（二）蛋白质分子的二级结构（二）蛋白质分子的二级结构2 2维持维持蛋白蛋白质分质分子构子构象的象的化学化学键键3 3（5 5）二二硫硫键键（二二硫硫桥桥）：两两个个硫硫原原子子之之间间形形成成的的共共价价键键。此此键键作作用用很很强强，可可把把不不同同肽肽链链或或同同一一条条肽肽链链的的不不同同部部分分连连在在一一起起，对对稳稳定定蛋蛋白白质质构构象象起起重重要要作作用用。大大多多数数蛋蛋白白质质分分子由于二硫键的断裂其生物学活性随即丧失。子由于二硫键的断裂其生物学活性随即丧失。维维持持蛋蛋白白质质构构象象的的化化学学键键主主要要是是次次级级键键（氢氢键键、离离子子键键、疏疏水水作作用用和和范范德德华华力力）。这这些些次级键是非共价键。次级键是非共价键。肽键、二硫键、酯键等被称之为共价键。肽键、二硫键、酯键等被称之为共价键。（二）蛋白质分子的二级结构（二）蛋白质分子的二级结构2 2二二级级结结构构的的类类型型1 1（1 1） - -螺旋螺旋最常见的二级结构形式。最常见的二级结构形式。（二）蛋白质分子的二级结构（二）蛋白质分子的二级结构2 2二二级级结结构构的的类类型型1 1（1 1） - -螺旋螺旋特点特点1 1每每隔隔3.63.6个个氨氨基基酸酸残残基基，螺螺旋旋上上升升一一圈圈。上上升升一一圈圈相相当当 于于 向向 上上 平平 移移0.54nm0.54nm，即即每每个个氨氨基基 酸酸 残残 基基 上上 升升0.15nm0.15nm，每每个个残残基基沿轴旋转沿轴旋转1001000 0。（二）蛋白质分子的二级结构（二）蛋白质分子的二级结构2 2二二级级结结构构的的类类型型1 1（1 1） - -螺旋螺旋特点特点2 2氨氨基基酸酸残残基基侧侧链链伸伸向向外外侧侧，相相邻邻螺螺圈圈之之间间形形成成链链内内氢氢键。键。氢氢键键是是由由每每个个氨氨基基酸酸残残基基的的N-HN-H与与前前面面隔隔三三个个氨氨基基酸酸残残基基的的C=0C=0形成的。形成的。（二）蛋白质分子的二级结构（二）蛋白质分子的二级结构2 2二二级级结结构构的的类类型型1 1（1 1） - -螺旋螺旋特点特点3 3一般为右手螺旋。一般为右手螺旋。（二）蛋白质分子的二级结构（二）蛋白质分子的二级结构2 2二二级级结结构构的的类类型型1 1（1 1） - -螺旋螺旋特点特点4 4链链中中如如有有脯脯氨氨酸酸，则则螺螺旋旋被被中中断断，产产生生一一个个“结结节节”，这这是是因因为为脯脯氨氨酸酸的的亚亚氨氨基基上上的的氢氢参参与与肽肽键键形形成成后后没没有有多多余余的的氢氢原原子子形形成成氢氢键键，这这样样肽肽链链拐拐弯弯不不再再形形成成-螺旋。螺旋。脯氨酸脯氨酸（二）蛋白质分子的二级结构（二）蛋白质分子的二级结构2 2二二级级结结构构的的类类型型1 1（1 1） - -螺旋螺旋特点特点5 5另另外外，甘甘氨氨酸酸由由于于没没有有侧侧链链的的约约束束，难难以以形形成成-螺螺旋旋所所需需的的二面角。二面角。其其次次，如如肽肽链链中中连连续续存存在在带带相相同同电电荷荷的的氨氨基基酸酸，由由于于同同性性电电荷荷相相斥斥也也会会影影响响-螺螺旋旋不稳定。不稳定。甘氨酸甘氨酸（二）蛋白质分子的二级结构（二）蛋白质分子的二级结构2 2二二级级结结构构的的类类型型1 1（1 1） - -螺旋螺旋（二）蛋白质分子的二级结构（二）蛋白质分子的二级结构2 2二二级级结结构构的的类类型型2 2（2 2）-折叠结构折叠结构 当将当将- - 角蛋白（角蛋白（- - 螺旋）螺旋）用热水和稀碱等方法处理或用力用热水和稀碱等方法处理或用力拉直，拉直，-角蛋白就变成角蛋白就变成 - -角角蛋白，此时蛋白，此时-螺旋被伸展，氢键螺旋被伸展，氢键被破坏，而形成被破坏，而形成-折叠。折叠。 （二）蛋白质分子的二级结构（二）蛋白质分子的二级结构2 2二二级级结结构构的的类类型型2 2（2 2）-折叠结构特点折叠结构特点1 1 - -折叠是由两条或多条几乎完全伸展折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿状折叠构象。形成的。肽链的主链呈锯齿状折叠构象。（二）蛋白质分子的二级结构（二）蛋白质分子的二级结构2 2二二级级结结构构的的类类型型2 2（2 2）-折叠结构特点折叠结构特点2 2 在在 - -折叠中，折叠中， - -碳原子总是处于折叠碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的的角上，氨基酸的R R基团处于折叠的棱角基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为距为0.350.35nmnm。（二）蛋白质分子的二级结构（二）蛋白质分子的二级结构2 2二二级级结结构构的的类类型型2 2（2 2）-折叠结构特点折叠结构特点3 3 - -折叠结构折叠结构的氢键主要是由的氢键主要是由两条肽链之间形两条肽链之间形成的；也可以在成的；也可以在同一肽链的不同同一肽链的不同部分之间形成。部分之间形成。几乎所有肽键都几乎所有肽键都参与链内氢键的参与链内氢键的交联，氢键与链交联，氢键与链的长轴接近垂直。的长轴接近垂直。（二）蛋白质分子的二级结构（二）蛋白质分子的二级结构2 2二二级级结结构构的的类类型型2 2（2 2）-折叠结构特点折叠结构特点4 4 平平行行式式反反平平行行式式所有肽所有肽链的链的N-N-端都在端都在同一边同一边相邻两相邻两条肽链条肽链的方向的方向相反相反（二）蛋白质分子的二级结构（二）蛋白质分子的二级结构2 2二二级级结结构构的的类类型型2 2（2 2）-折叠结构折叠结构 侧面观侧面观（二）蛋白质分子的二级结构（二）蛋白质分子的二级结构2 2二二级级结结构构的的类类型型3 3（3 3）-转角结构转角结构1 1这类结构主要存在于球状蛋白分子中。这类结构主要存在于球状蛋白分子中。 - -转角部分，由四个氨基酸残基组成转角部分，由四个氨基酸残基组成弯曲处的第一个氨基酸残基的弯曲处的第一个氨基酸残基的 -C=O -C=O 和第四个残基的和第四个残基的 N-H N-H 之间形成氢键，之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。形成一个不很稳定的环状结构。（二）蛋白质分子的二级结构（二）蛋白质分子的二级结构2 2二二级级结结构构的的类类型型3 3（3 3）-转角结构转角结构2 2 -转角转角（二）蛋白质分子的二级结构（二）蛋白质分子的二级结构2 2二二级级结结构构的的类类型型3 3 螺旋螺旋折折叠片叠片转角转角自由自由回转回转（三）蛋白质的三级结构（三）蛋白质的三级结构1 1 定义：定义：蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构( (Tertiary Structure) )是蛋白质在各种二级结构单元是蛋白质在各种二级结构单元的基础上，还能进一步盘曲而成特定格的基础上，还能进一步盘曲而成特定格式的三级结构。式的三级结构。维系力：维系力：主要有氢键、疏水键、离子键主要有氢键、疏水键、离子键和范德华力等。尤其是疏水键，在蛋白和范德华力等。尤其是疏水键，在蛋白质三级结构中起着重要作用。质三级结构中起着重要作用。（三）蛋白质的三级结构（三）蛋白质的三级结构2 2三级结构的维系因素三级结构的维系因素决决定定多多肽肽链链盘盘曲曲方方式式（高高级级结结构构）的的因因素素，首首先先是是氨基酸残基的序列（一级结构）。氨基酸残基的序列（一级结构）。盐盐键键: :残残基基上上氨氨基基酸酸有有的的带带正正电电（赖赖、精精），与与带带负电的氨基酸（谷、天冬）的相互吸引。负电的氨基酸（谷、天冬）的相互吸引。范德华力：范德华力：因基团之间的紧密靠近而产生。因基团之间的紧密靠近而产生。氢键：氢键：侧链之间可形成氢键。侧链之间可形成氢键。二二硫硫键键: :可可把把两两条条肽肽段段连连起起来来，是是维维持持蛋蛋白白质质的的三三级结构的重要因素。级结构的重要因素。多多肽肽链链经经过过如如此此盘盘曲曲后后，在在分分子子表表面面形形成成了了某某些些发发挥挥生生物物学学功功能能的的特特定定区区域域（微微环环境境），如如酶酶的的活活性性中中心等。心等。（三）蛋白质的三级结构（三）蛋白质的三级结构3 3维持三级结构的作用力维持三级结构的作用力1 1（三）蛋白质的三级结构（三）蛋白质的三级结构3 3维持三级结构的作用力维持三级结构的作用力2 2无三级无三级结构结构形成三形成三级结构级结构（三）蛋白质的三级结构（三）蛋白质的三级结构3 3维持三级结构的作用力维持三级结构的作用力3 3 肽键肽键 二硫键二硫键离子键 氢键氢键疏水键疏水键 范德华力范德华力 3kcal/mol1kcal/mol1kcal/mol0.1kcal/mol这四种键能远小于共价键，称这四种键能远小于共价键，称次级键。次级键。次级键微弱但却是维持蛋白质三级结构中主要的次级键微弱但却是维持蛋白质三级结构中主要的作用力作用力, ,原因是因为其数量巨大。原因是因为其数量巨大。（三）蛋白质的三级结构（三）蛋白质的三级结构4 4 （三）蛋白质的三级结构（三）蛋白质的三级结构5 5 肌红蛋白的三级结构肌红蛋白的三级结构（四）蛋白质分子的四级结构（四）蛋白质分子的四级结构1 1 很多蛋白质分子是由两个或两个以上独立很多蛋白质分子是由两个或两个以上独立的、具有三级结构的多肽链组成的。的、具有三级结构的多肽链组成的。这些多肽链之间并没有共价键的联系，只这些多肽链之间并没有共价键的联系，只是借次级键缔合在一起，这就形成了四级结是借次级键缔合在一起，这就形成了四级结构。构。一般分子量超过几十一百万的蛋白质均一般分子量超过几十一百万的蛋白质均有四级结构。有四级结构。在四级结构的蛋白质分子中，每个具有三在四级结构的蛋白质分子中，每个具有三级结构的多肽链单位称为亚基，亚基多无生级结构的多肽链单位称为亚基，亚基多无生物学活性，具有完整四级结构的蛋白质分子物学活性，具有完整四级结构的蛋白质分子才有生物活性。才有生物活性。（四）蛋白质分子的四级结构（四）蛋白质分子的四级结构2 2 （四）蛋白质分子的四级结构（四）蛋白质分子的四级结构3 3 血红蛋白中四亚基两两相同，血红蛋白中四亚基两两相同，分别称为分别称为1 、2、1、2血红细胞血红细胞（四）蛋白质分子的四级结构（四）蛋白质分子的四级结构4 4血红蛋白中的二聚血红蛋白中的二聚体之一体之一2与与2第三节第三节 蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质一、蛋白质的分子量一、蛋白质的分子量 二、两性游离和等电点二、两性游离和等电点 三、蛋白质的胶体性质三、蛋白质的胶体性质 四、蛋白质的沉淀反应四、蛋白质的沉淀反应 五、蛋白质的变性和复性五、蛋白质的变性和复性 六、蛋白质的颜色反应六、蛋白质的颜色反应 一、蛋白质的分子量一、蛋白质的分子量蛋白质的分子量一般在蛋白质的分子量一般在1 1万万100100万道万道尔顿尔顿由于是生物大分子，因此在溶液中极由于是生物大分子，因此在溶液中极不稳定，不能用测定小分子物质的方法不稳定，不能用测定小分子物质的方法（如冰点降低、沸点升高）来测定（如冰点降低、沸点升高）来测定一般以渗透压法、凝胶过滤、聚丙烯一般以渗透压法、凝胶过滤、聚丙烯酰胺凝胶电泳及超离心法来测定其分子酰胺凝胶电泳及超离心法来测定其分子量。超离心法较准确，但实验条件要求量。超离心法较准确，但实验条件要求很高很高二、两性游离和等电点二、两性游离和等电点1 1+OH+H+OH+H+COOHPrH3N+COOPrH3N+COOPrH2NpH pI 4 7pH = pI 7 =7pH pI 9 7 由于蛋白质是由氨基酸组成，氨基酸由于蛋白质是由氨基酸组成，氨基酸所具有的两性游离性质，蛋白质也同样具所具有的两性游离性质，蛋白质也同样具有有 二、两性游离和等电点二、两性游离和等电点2 2肽与氨基酸都有肽与氨基酸都有 COOHCOOH， NH NH2 2，但肽还，但肽还含有侧链含有侧链R R基上的可解离基团，且其为主要解离基上的可解离基团，且其为主要解离基团。基团。肽链中的肽链中的COOHCOOH与与NHNH2 2相距较远，因此它相距较远，因此它们之间的静电引力较弱，可离子化程度较低。们之间的静电引力较弱，可离子化程度较低。大的肽比小肽的离子化程度低，即大肽完全质大的肽比小肽的离子化程度低，即大肽完全质子化所需子化所需pHpH比小肽低。比小肽低。N N端端NHNH2 2的的pKpK，值比游离氨基酸的小，值比游离氨基酸的小，C C端端的的COOHCOOH的的pKpK，值比游离氨基酸的大，侧链值比游离氨基酸的大，侧链R R基基的的pKpK，值在两者之间。值在两者之间。 蛋白质两性游离的特点蛋白质两性游离的特点二、两性游离和等电点二、两性游离和等电点3 3在同一在同一pHpH溶液中，由于各种蛋白质所带电溶液中，由于各种蛋白质所带电荷的性质和数量以及分子大小不同，因此荷的性质和数量以及分子大小不同，因此它们在电场中的移动速度也有差别，可以它们在电场中的移动速度也有差别，可以利用这种性质来分离和分析蛋白质，称为利用这种性质来分离和分析蛋白质，称为蛋白质电泳分析法。蛋白质电泳分析法。常用的有纸上电泳、醋酸纤维膜电泳、聚常用的有纸上电泳、醋酸纤维膜电泳、聚丙烯纤维的凝胶电泳丙烯纤维的凝胶电泳蛋白质两性游离的应用蛋白质两性游离的应用1 1二、两性游离和等电点二、两性游离和等电点3 3蛋白质两性游离的应用蛋白质两性游离的应用2 2电泳电泳三、蛋白质的胶体性质三、蛋白质的胶体性质1 1 由于蛋白质分由于蛋白质分子大，且球状蛋白子大，且球状蛋白质分子中亲水的氨质分子中亲水的氨基酸残基多位于颗基酸残基多位于颗粒表面，故在水溶粒表面，故在水溶液中能与水起水合液中能与水起水合作用。因此，蛋白作用。因此，蛋白质的水溶液具有亲质的水溶液具有亲水胶体的性质水胶体的性质为什么蛋白质具有胶体性质为什么蛋白质具有胶体性质三、蛋白质的胶体性质三、蛋白质的胶体性质2 2蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有二个稳蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有二个稳定因素，即颗粒表面的水化层和电荷。若定因素，即颗粒表面的水化层和电荷。若无外力条件作用，不致互相凝集。无外力条件作用，不致互相凝集。如除掉这两个稳定因素，蛋白质便容易凝如除掉这两个稳定因素，蛋白质便容易凝集析出。因此，可用此原理提取蛋白质，集析出。因此，可用此原理提取蛋白质，如常用中性盐硫酸胺来竞争水而使水化膜如常用中性盐硫酸胺来竞争水而使水化膜破裂，产生沉淀。破裂，产生沉淀。蛋白质胶体稳定的原因蛋白质胶体稳定的原因三、蛋白质的胶体性质三、蛋白质的胶体性质3 3蛋白质具有许多高分子溶液的性质。如蛋白质具有许多高分子溶液的性质。如扩散、粘度大、不能透过半透膜。扩散、粘度大、不能透过半透膜。利用不能透过半透膜的性质可以将蛋白利用不能透过半透膜的性质可以将蛋白质和其他一些小分子分开，常用方法有渗质和其他一些小分子分开，常用方法有渗析和超滤。析和超滤。三、蛋白质的胶体性质三、蛋白质的胶体性质4 4渗析渗析血液透析血液透析小分子溶出小分子被小分子被带出带出透析机透析机透析液透析液血液血液加加压压三、蛋白质的胶体性质三、蛋白质的胶体性质4 4超滤超滤四、蛋白质的沉淀反应四、蛋白质的沉淀反应1 1( (概述概述) )定义定义: :使蛋白质从溶液中析出的现象。使蛋白质从溶液中析出的现象。原理原理: :蛋白质稳定因素有水化层和带电层蛋白质稳定因素有水化层和带电层, ,水化层水化层是蛋白质分子表面的许多亲水基团与水分子结合是蛋白质分子表面的许多亲水基团与水分子结合形成的一层水膜，它使蛋白质颗粒不能相互接触形成的一层水膜，它使蛋白质颗粒不能相互接触聚集成大颗粒；带电层是蛋白质分子表面的可解聚集成大颗粒；带电层是蛋白质分子表面的可解离基团在一定离基团在一定pHpH环境下解离产生的。由于带同性环境下解离产生的。由于带同性电荷的蛋白质颗粒相互排斥，也使蛋白质颗粒不电荷的蛋白质颗粒相互排斥，也使蛋白质颗粒不能聚集，当改变这些稳定因素，蛋白质分子相聚能聚集，当改变这些稳定因素，蛋白质分子相聚集而从溶液中析出。集而从溶液中析出。 特点特点: :一般沉淀出的蛋白质是变性的。如果控制一般沉淀出的蛋白质是变性的。如果控制实验条件（如低温、温和沉淀剂），便可得到不实验条件（如低温、温和沉淀剂），便可得到不变性的蛋白质。变性的蛋白质。四、蛋白质的沉淀反应四、蛋白质的沉淀反应2 2( (方式方式1)1)定定义义: :加加入入大大量量中中性性盐盐( (硫硫酸酸胺胺) )以以破破坏坏蛋蛋白白质的胶体性质而使蛋白质从水溶液沉淀析出。质的胶体性质而使蛋白质从水溶液沉淀析出。盐析时若溶液盐析时若溶液pHpH在蛋白质的等电点在蛋白质的等电点( (溶解度溶解度最小，易沉淀最小，易沉淀) )则效果最好。各种蛋白质分子则效果最好。各种蛋白质分子的颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐的颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。因此，调节混合蛋白质的溶液浓度也不一样。因此，调节混合蛋白质的溶液中的中性盐的浓度，可使各种蛋白质分段沉淀。中的中性盐的浓度，可使各种蛋白质分段沉淀。 1 1盐析盐析1 1四、蛋白质的沉淀反应四、蛋白质的沉淀反应2 2( (方式方式1)1)1 1盐析盐析2 2蛋白质分子表面的蛋白质分子表面的疏水区域疏水区域，聚集了许多水分子，盐浓度，聚集了许多水分子，盐浓度高时，它们被盐抽出，暴露出的疏水区域相互结合，沉淀高时，它们被盐抽出，暴露出的疏水区域相互结合，沉淀四、蛋白质的沉淀反应四、蛋白质的沉淀反应2 2( (方式方式2)2)pHpH稍大于等电点为宜，因为此时蛋白质稍大于等电点为宜，因为此时蛋白质带负电，易与金属离子结合成盐。带负电，易与金属离子结合成盐。通常这种沉淀为变性的，如控制温度通常这种沉淀为变性的，如控制温度（低温）并控制重金属离子浓度，则可（低温）并控制重金属离子浓度，则可用于分离制备不变性的蛋白质。用于分离制备不变性的蛋白质。 2 2重金属盐沉淀蛋白质重金属盐沉淀蛋白质四、蛋白质的沉淀反应四、蛋白质的沉淀反应2 2( (方式方式3)3)某些生物碱试剂（如苦味酸、钨酸、某些生物碱试剂（如苦味酸、钨酸、鞣酸、碘化钾等）及某些酸（三氯乙酸、鞣酸、碘化钾等）及某些酸（三氯乙酸、水杨磺酸、硝酸等）与蛋白质结合成不水杨磺酸、硝酸等）与蛋白质结合成不溶性的盐沉淀。溶性的盐沉淀。沉淀条件应当是沉淀条件应当是pHpH小于等于电点，这小于等于电点，这样蛋白质带正电，易与酸根负离子结合样蛋白质带正电，易与酸根负离子结合成盐。成盐。3 3生物碱试剂与某些酸类沉淀蛋白质生物碱试剂与某些酸类沉淀蛋白质四、蛋白质的沉淀反应四、蛋白质的沉淀反应2 2( (方式方式4)4)可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等能破坏蛋白质的胶体性质而使蛋丙酮等能破坏蛋白质的胶体性质而使蛋白质沉淀。如酒精的消毒作用。白质沉淀。如酒精的消毒作用。在低温条件下，变性进行较缓慢，可以在低温条件下，变性进行较缓慢，可以用来制备蛋白质。其优点在于：不像盐用来制备蛋白质。其优点在于：不像盐析那样存在有大量盐类，必须经透析除析那样存在有大量盐类，必须经透析除去，而且有机溶剂很易通过稀释透析及去，而且有机溶剂很易通过稀释透析及蒸发等方法除去。蒸发等方法除去。4 4有机溶剂沉淀蛋白质有机溶剂沉淀蛋白质四、蛋白质的沉淀反应四、蛋白质的沉淀反应2 2( (方式方式5)5)将接近于等电点附近的蛋白质溶液加将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热可使蛋白质发生凝固而沉下。热可使蛋白质发生凝固而沉下。鸡蛋煮熟后，本来流动的蛋清、蛋黄鸡蛋煮熟后，本来流动的蛋清、蛋黄都变成固体样的东西了。这是蛋白质凝都变成固体样的东西了。这是蛋白质凝固作用应用于食品加工的典型例子。固作用应用于食品加工的典型例子。 5 5加热凝固加热凝固五、蛋白质的变性和复性五、蛋白质的变性和复性（变性（变性1 1）定定义义: :以以某某些些物物理理或或化化学学因因素素的的作作用用，使使蛋蛋白白质质严严格格的的空空间间构构象象破破坏坏（不不包包括括肽肽键键的的断断裂裂），而而引起蛋白质若干理化和生物学性质的改变。引起蛋白质若干理化和生物学性质的改变。影影响响蛋蛋白白质质变变性性的的因因素素: :紫紫外外线线照照射射、加加热热煮煮沸沸、强酸、强碱、重金属盐和有机溶剂处理等。强酸、强碱、重金属盐和有机溶剂处理等。原原理理: :维维持持蛋蛋白白质质二二级级、三三级级和和四四级级结结构构的的严严格格构构象象的的力力只只是是一一些些弱弱的的次次级级键键，它它们们很很容容易易被被破破坏。坏。特特点点: :天天然然构构象象被被破破坏坏，蛋蛋白白质质失失去去了了生生物物学学活活性。性。五、蛋白质的变性和复性五、蛋白质的变性和复性（变性（变性2 2）五、蛋白质的变性和复性五、蛋白质的变性和复性（变性（变性3 3）五、蛋白质的变性和复性五、蛋白质的变性和复性（复性）（复性）复性复性: :某些变性蛋白质，再除去变性因素某些变性蛋白质，再除去变性因素后，可以重新获得其天然结构和生物活性，后，可以重新获得其天然结构和生物活性，称为蛋白质的称为蛋白质的“复性复性”。 如有一些球蛋白被热或极端如有一些球蛋白被热或极端pHpH变性后，若变性后，若缓慢冷却或缓慢恢复到正常缓慢冷却或缓慢恢复到正常pHpH时，将重新时，将重新获得其天然结构和生物活性。获得其天然结构和生物活性。这种复性现象，即蛋白质折叠研究中的所这种复性现象，即蛋白质折叠研究中的所谓谓“折叠折叠”。 六、蛋白质的颜色反应六、蛋白质的颜色反应1 11.1.双缩脲反应双缩脲反应1 1原原理理: :蛋蛋白白质质分分子子中中含含有有许许多多和和双双缩缩脲脲结结构构相相似似的的肽肽键键，因因此此也也能能起起双双缩缩脲脲反反应应，形形成红紫色混合物。成红紫色混合物。应应用用: :可可以以用用此此反反应应来来定定性性测测定定蛋蛋白白质质；也可在也可在540nm540nm处比色，定量测定蛋白质。处比色，定量测定蛋白质。六、蛋白质的颜色反应六、蛋白质的颜色反应1 12H2NC NH2H2NCNCNH2NH31320COOHO尿素尿素双缩脲双缩脲双缩脲双缩脲CuSO4+NaOH紫红色物质紫红色物质1.1.双缩脲反应双缩脲反应2 2六、蛋白质的颜色反应六、蛋白质的颜色反应2 22.2.酚试剂（福林试剂）反应酚试剂（福林试剂）反应原理原理: :蛋白质分子一般都含蛋白质分子一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能将福林试剂中的磷钼酸基能将福林试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物及磷钨酸还原成蓝色化合物（钼蓝和钨蓝的混合物）（钼蓝和钨蓝的混合物）应用应用: :常用此反应来定量测常用此反应来定量测定蛋白质含量。最近普遍使定蛋白质含量。最近普遍使用的用的BrodfordBrodford法法, ,（考马思（考马思亮兰亮兰G-250G-250法）将会在以后法）将会在以后的实验接触。的实验接触。六、蛋白质的颜色反应六、蛋白质的颜色反应3 3含有芳香族氨基酸，特别是含有酪氨酸含有芳香族氨基酸，特别是含有酪氨酸和色氨酸的蛋白质所特有的呈色反应。和色氨酸的蛋白质所特有的呈色反应。蛋白质溶液遇硝酸后先产生白色沉淀，蛋白质溶液遇硝酸后先产生白色沉淀，加盐则白色沉淀变成黄色，再加碱呈橙黄加盐则白色沉淀变成黄色，再加碱呈橙黄色。因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，色。因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生了黄色硝基苯衍生物产生了黄色硝基苯衍生物3 3蛋白质的黄色反应蛋白质的黄色反应1 1六、蛋白质的颜色反应六、蛋白质的颜色反应3 33 3蛋白质的黄色反应蛋白质的黄色反应2 2 硝基酚硝基酚（黄色）（黄色） 邻硝醌酸钠邻硝醌酸钠（橙黄色）（橙黄色）六、蛋白质的颜色反应六、蛋白质的颜色反应4 44 4米伦化反应米伦化反应米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合液。亚硝酸的混合液。当蛋白溶液中加入米伦试剂后即产生白当蛋白溶液中加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。色沉淀，加热后沉淀变成红色。由于酚类化合物有此反应，酪氨酸含有由于酚类化合物有此反应，酪氨酸含有酚基，故有此反应。酚基，故有此反应。六、蛋白质的颜色反应六、蛋白质的颜色反应5 5乙醛酸反应乙醛酸反应1 1在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两液层之间就管壁慢慢注入浓硫酸，在两液层之间就会出现紫色环。会出现紫色环。凡含有吲哚基的化合物都有此反应，凡含有吲哚基的化合物都有此反应，由于色氨酸含有类似结构，因此含有色由于色氨酸含有类似结构，因此含有色氨酸或含色氨酸的蛋白质都有此反应。氨酸或含色氨酸的蛋白质都有此反应。六、蛋白质的颜色反应六、蛋白质的颜色反应5 5乙醛酸反应乙醛酸反应2 2六、蛋白质的颜色反应六、蛋白质的颜色反应6 66 6坂口反应坂口反应1 1原理原理: :精氨酸分子中的胍基，能与次精氨酸分子中的胍基，能与次氯酸钠、或次溴酸钠及氯酸钠、或次溴酸钠及萘酚在氢萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色产物。氧化钠溶液中产生红色产物。应用应用: :此反应可以用来鉴定含有精氨此反应可以用来鉴定含有精氨酸的蛋白质，也可用来测定精氨酸的酸的蛋白质，也可用来测定精氨酸的含量。含量。六、蛋白质的颜色反应六、蛋白质的颜色反应6 66 6坂口反应坂口反应2 2红色红色六、蛋白质的颜色反应六、蛋白质的颜色反应6 66 6坂口反应坂口反应3 3第四节第四节 氨基酸及蛋白质分离提纯氨基酸及蛋白质分离提纯1 1无无论论是是对对蛋蛋白白质质结结构构与与功功能能的的研研究究，或或是是生生产产人人们们所所需需要要的的蛋蛋白白质质产产品品，都都涉涉及及蛋蛋白白质的分离纯化。质的分离纯化。目目前前对对蛋蛋白白质质的的制制备备，主主要要是是从从生生物物组组织织中提取分离。中提取分离。一般的程序为：一般的程序为： 前处理：组织、细胞破碎等。前处理：组织、细胞破碎等。 粗分级：盐析、沉淀等。粗分级：盐析、沉淀等。 细分级：层析、电泳等。细分级：层析、电泳等。 第四节第四节 氨基酸及蛋白质分离提纯氨基酸及蛋白质分离提纯2 2一、氨基酸的分析分离一、氨基酸的分析分离 二、蛋白质混合物的分离方法二、蛋白质混合物的分离方法 三、蛋白质的鉴定三、蛋白质的鉴定 一、氨基酸的分析分离一、氨基酸的分析分离1 1类类型型：分分配配层层析析法法( (包包括括柱柱层层析析、纸纸层层析和薄层层析析和薄层层析) )基基本本原原理理：所所有有的的层层析析系系统统通通常常都都由由两两个个相相组组成成，一一个个为为固固定定相相的的或或静静相相；一一个为流动相或动相。个为流动相或动相。一、氨基酸的分析分离一、氨基酸的分析分离2 2分分配配系系数数KdKd ：混混合合物物在在层层析析系系统统中中的的分分离离，决决定定于于该该混混合合物物的的组组分分在在两两相相中中的的分分配配情情况况，即分配系数：即分配系数： Kd=CKd=CA A/C/CB BCACA，CBCB分分别别代代表表某某一一物物质质在在互互不不相相溶溶的的两两相相 A A，B B 中的浓度。中的浓度。一、氨基酸的分析分离一、氨基酸的分析分离2 2分分配配系系数数KeffKeff：某某一一物物质质在在层层析析系系统统中中的的行行为为并并不不直直接接决决定定于于它它们们的的分分配配系系数数Kd,Kd,而而是取决于有效分配系数是取决于有效分配系数KeffKeff。KeffKeff某物质在某物质在A A相中的总量相中的总量/ /某物质在某物质在B B相中的相中的 总量总量对于液相对于液相- -液相层析系统来说液相层析系统来说, ,KeffKeff(CAVA)/ (CBVB)(CAVA)/ (CBVB)KdRVKdRV这这里里的的VA,VBVA,VB分分别别为为A A相相和和B B相相的的体体积积，RVRV为为A A，B B两两相相的的体体积积比比。由由此此可可见见，KeffKeff是是RVRV的的函函数数，溶溶质质的的有有效效分分配配系系数数可可以以调调整整两两相相的体积比而加以改变。的体积比而加以改变。一、氨基酸的分析分离一、氨基酸的分析分离3 3 利用层析法分离混合物（例如氨基酸利用层析法分离混合物（例如氨基酸混合物），其先决条件是各种氨基酸成混合物），其先决条件是各种氨基酸成分的分配系数要有差异，哪怕是很小的分的分配系数要有差异，哪怕是很小的差异，一般差异越大，越容易分开。差异，一般差异越大，越容易分开。 一、氨基酸的分析分离一、氨基酸的分析分离4 41 1分配柱层析分配柱层析2 2滤纸层析滤纸层析3 3薄层分析薄层分析4 4离子交换层析离子交换层析5 5气相色谱气相色谱6 6高效液相色谱（高效液相色谱（HPLCHPLC）1 1分配柱层析分配柱层析1 1柱层析中的填充物或称支持剂，都是一些具有亲柱层析中的填充物或称支持剂，都是一些具有亲水性的不溶物质，如纤维素、淀粉、硅胶等。以水性的不溶物质，如纤维素、淀粉、硅胶等。以它们作为固定相（静相）。它们作为固定相（静相）。用各种缓冲液（流动相）来溶出。用各种缓冲液（流动相）来溶出。在柱上端加上氨基酸混合物样品，那么此样品就在柱上端加上氨基酸混合物样品，那么此样品就会在两相之间发生连续分配会在两相之间发生连续分配, ,混合物中具有不同分混合物中具有不同分配系数的各种成分沿柱以不同的速度向下移动。配系数的各种成分沿柱以不同的速度向下移动。分步收集柱下端的洗出液，用茚三酮显色定量。分步收集柱下端的洗出液，用茚三酮显色定量。以氨基酸对洗出液体积作图，得洗脱曲线，曲线以氨基酸对洗出液体积作图，得洗脱曲线，曲线中的每个峰相当于某一种氨基酸中的每个峰相当于某一种氨基酸 。1 1分配柱层析分配柱层析2 2洗脱剂洗脱剂样品样品填充物填充物玻璃柱玻璃柱分步收集分步收集设想的板层设想的板层S=固定相固定相M=流动相流动相1 1分配柱层析分配柱层析3 3ABC D E 32161681684124122881221 2 3 4 5 阶阶 段段1 1分配柱层析分配柱层析4 4分溶曲线与转移次数（理论板数）分溶曲线与转移次数（理论板数）n的依赖关系的依赖关系00.250.50.751.0相相对对浓浓度度n=6n=100n=10002 2滤纸层析滤纸层析1 1滤纸上，水被吸附在纤维素的纤维之间，形成滤纸上，水被吸附在纤维素的纤维之间，形成固定相，展层用的溶剂是流动相。固定相，展层用的溶剂是流动相。层析时，混合氨基酸在这两相中不断分配，使层析时，混合氨基酸在这两相中不断分配，使它们分布在滤纸的不同位置，然后用茚三酮显色。它们分布在滤纸的不同位置，然后用茚三酮显色。此层析可以进行二向层析。第一向层析完成后，此层析可以进行二向层析。第一向层析完成后，烘干滤纸再用另一溶剂层析（与第一向层析相垂烘干滤纸再用另一溶剂层析（与第一向层析相垂直）。直）。这种方法不仅可用于氨基酸分析，还可用于糖这种方法不仅可用于氨基酸分析，还可用于糖的分析和核苷酸的分析，是一个非常有用的方法。的分析和核苷酸的分析，是一个非常有用的方法。 2 2滤纸层析滤纸层析2 2AA1AA2AA3AA4abc标准标准样品样品原点原点原点原点（ 2 2 ）酚酚甲甲酸酸水水（1 1）丁醇醋酸）丁醇醋酸氨基酸单向纸层析图谱氨基酸单向纸层析图谱氨基酸双向纸层析图谱氨基酸双向纸层析图谱DADS 2 2滤纸层析滤纸层析3 3氨氨基基酸酸在在纸纸上上移移动动的的速速度度称称比比移移值值或或迁迁移移率率，以以符符号号RfRf代代表表。也也就就是是原原点点到到溶溶剂剂前前沿沿的的距距离离（DsDs）同同原原点点到到层层析析斑斑点点（即即原原色色点点）中中心的距离心的距离(DA)(DA)的比值的比值 Rf RfDA/ DSDA/ DS同一氨基酸对一定溶剂系统的同一氨基酸对一定溶剂系统的RfRf值是常数，值是常数，因而可用来鉴别氨基酸。因而可用来鉴别氨基酸。 3 3薄层分析薄层分析这这是是近近十十几几年年发发展展起起来来的的一一种种微微量量而而快快速速的的层层析析法法。不不仅仅适适于于氨氨基基酸酸的的分分离离鉴鉴定定，而而且且可可用用于于许许多多其其他他的的天天然然物物质质的的定定性性、定定量量测测定以及小量样品的分离提纯。定以及小量样品的分离提纯。大大体体步步骤骤：把把支支持持剂剂（硅硅胶胶粉粉、纤纤维维素素粉粉）涂涂布布于于玻玻璃璃板板上上，使使之之成成一一个个薄薄层层；把把要要分分析析的的样样品品，滴滴加加在在薄薄层层的的一一端端，然然后后用用合合适适的的溶溶剂剂进进行行展展层层，使使样样品品中中各各个个成成分分分分离离；最后进行鉴定和定量测定。最后进行鉴定和定量测定。 4 4离子交换层析离子交换层析1 1 就就是是用用离离子子交交换换树树脂脂作作支支持持剂剂的的一一种种层层析析法法。离离子子交交换换树树脂脂是是具具有有酸酸性性或或碱碱性性基基团团的的人人工工合合成成聚聚苯苯乙乙烯烯酸酸等等不不溶溶性高分子化合物。性高分子化合物。4 4离子交换层析离子交换层析2 2 阳阳离离子子交交换换树树脂脂含含有有的的酸酸性性基基团团如如S0S03 3H(H(强强酸酸型型) )或或COOHCOOH（弱弱酸酸型型）可可解解离离出出H H+ +，当当溶溶液液中中含含有有其其他他阳阳离离子子时时，例例如如在在酸酸性性环环境境中中的的氨氨基基酸酸阳阳离离子子，它它们们可可以以和和H H+ +发发生生交交换换而而“结结合合”在在树树脂脂 ；相相反反，阴阴离离子子交交换换树树脂脂，可可解解离离出出OHOH，能能和和溶溶液液里里的的阴阴离离子子（如如碱碱性性环环境境中中的的带带负负电电的的氨氨基基酸酸）发发生生交交换换而而结结合合在在树树脂脂上上。为为了了使使氨氨基基酸酸从从树树脂脂柱柱上上洗洗脱脱下下来来，需需要要降降低低氨氨基基酸酸与与树树脂脂间间的的亲亲和和力力（静静电电吸吸引引及及氨氨基基酸酸侧侧链链与与树树脂脂基基质质聚聚苯苯乙乙烯烯之之间间的的疏疏水水相相互互作作用用）。有有效效的的方方法法是是逐逐步步提提高高洗洗脱脱剂剂的的pHpH和和盐盐浓浓度度（离离子子强强度度），这这样样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来。各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来。4 4离子交换层析离子交换层析3 3RCHCOOHNH3+M1A+RCHCOOHNH3M1+A+ 氨基酸（在酸氨基酸（在酸性溶液中）性溶液中）阳离子交阳离子交换剂换剂 氨基酸盐氨基酸盐RCHCOONH2+M2B RCHCOO M2NH2+ B 氨基酸（在碱氨基酸（在碱性溶液中）性溶液中）阴离子交阴离子交换剂换剂 氨基酸盐氨基酸盐M1为酸性基团，M2为碱性基团5 5气相色谱气相色谱定定义义：层层析析系系统统的的流流动动相相为为气气体体，固固定定相相为为涂涂渍渍在在固固体体颗颗粒粒表表面面的的液液体体，因因此此也也叫叫气气液色谱。液色谱。优点：优点：气相色谱法具有微量快速的优点。气相色谱法具有微量快速的优点。缺缺点点：但但在在分分析析生生物物成成分分方方面面存存在在一一个个限限制制，它它要要求求样样品品能能气气化化，且且对对热热的的稳稳定定性性高高。而而氨氨基基酸酸由由于于含含有有各各种种极极性性基基团团，气气化化十十分分困困难难，必必须须把把它它转转变变成成容容易易挥挥发发的的化化合合物物才才能能进行气相层析。进行气相层析。6 6高效液相色谱（高效液相色谱（HPLCHPLC）这这是是近近十十几几年年内内发发展展起起来来的的一一项项快快速速、灵敏、高效的分析分离技术。灵敏、高效的分析分离技术。其其特特点点是是使使用用的的固固定定相相支支持持剂剂颗颗粒粒很很细细，因因而而表表面面积积很很大大。溶溶剂剂系系统统采采取取高高压压，因因此此洗洗脱脱速速度度增增大大。许许多多层层析析如如离离子子交交换换层层析析、吸吸附附层层析析及及凝凝胶胶过过滤滤层层析析等等多多种类型的柱层析都可用种类型的柱层析都可用HPLCHPLC来代替。来代替。 二、蛋白质混合物的分离方法二、蛋白质混合物的分离方法1 1根据分子大小不同的分离方法根据分子大小不同的分离方法2 2根据蛋白质溶解度不同的分离方法根据蛋白质溶解度不同的分离方法3 3根据蛋白质带电性的分离方法根据蛋白质带电性的分离方法4 4根根据据配配体体特特异异性性的的分分离离方方法法亲亲和和层析法层析法 1 1根据分子大小不同的分离方法根据分子大小不同的分离方法（1 1）透析和超滤）透析和超滤（2 2）密度梯度（区带）离心）密度梯度（区带）离心（3 3）凝胶过滤（分子筛层析）凝胶过滤（分子筛层析）（1 1）透析和超滤）透析和超滤1 1 利利用用蛋蛋白白质质分分子子不不能能通通过过半半透透膜膜的的性性质质，使使蛋蛋白白质质和和其其他他小小分分子子物物质质如如无无机机盐、单糖、水等分开。盐、单糖、水等分开。常常用用的的半半透透膜膜是是玻玻璃璃纸纸、火火棉棉纸纸和和其其他合成材料。他合成材料。（1 1）透析和超滤）透析和超滤2 2小分子溶出小分子被小分子被带出带出透析透析（1 1）透析和超滤）透析和超滤3 3 超滤超滤（2 2）密度梯度（区带）离心）密度梯度（区带）离心1 1蛋蛋白白质质颗颗粒粒和和沉沉降降不不仅仅决决定定于于它它的的大大小小，而而且且也也取取决决于于它它的的密密度度，常常用用的的密密度度梯梯度度为为蔗糖梯度。蔗糖梯度。蛋蛋白白质质颗颗粒粒在在具具有有密密度度梯梯度度的的介介质质中中离离心心时时，质质量量和和密密度度大大的的颗颗粒粒比比质质量量和和密密度度小小的的颗颗粒粒沉沉降降得得快快，并并且且每每种种蛋蛋白白质质颗颗粒粒沉沉降降到到与与自自身身密密度度相相等等的的介介质质梯梯度度时时，即即停停止止不不前前，最最后后各各种种蛋蛋白白质质在在离离心心管管中中被被分分离离成成各各自自独独立的区带。立的区带。 （2 2）密度梯度（区带）离心）密度梯度（区带）离心2 2蔗糖浓度蔗糖浓度48121620塑塑料料离离心心管管滴加样品滴加样品（3 3）凝胶过滤（分子筛层析）凝胶过滤（分子筛层析）1 1 这这是是根根据据分分子子大大小小分分离离蛋蛋白白质质混混合合物物最最有有效效的的方方法法之之一一。凝凝胶胶珠珠是是多多孔孔的的网网状状结结构构，凝凝胶胶的的交交联联度度或或孔孔度度（网网孔孔大大小小）决决定定了了凝凝胶胶的的分分级级范范围围，即即能能被被该该凝凝胶胶分分离离开开来来的的蛋蛋白白质质混混合合物的分子量范围。物的分子量范围。（3 3）凝胶过滤（分子筛层析）凝胶过滤（分子筛层析）2 2主主要要原原理理：当当不不同同分分子子大大小小的的蛋蛋白白质质混混合合物物流流经经凝凝胶胶层层析析柱柱时时，比比凝凝胶胶网网孔孔大大的的分分子子不不能能进进入入珠珠内内网网状状结结构构而而被被排排阻阻在在凝凝胶胶珠珠外外，随随着着溶溶液液在在凝凝胶胶珠珠之之间间的的孔孔隙隙向向下下移移动动，并并最最先先流流出出柱柱外外；比比网网孔孔小小的的分分子子能能不不同同程程度度地地自自由由出出入入凝凝胶胶珠珠的的内内外外，这这样样由由于于不不同同大大小小的的分分子子所所经经的的路路径径不不同同而而得得到到分分离离。大大分分子子物物质质先先被被洗洗脱脱出出来来，小小分分子子物物质质后后被被洗洗脱脱出来。出来。常常用用的的凝凝胶胶: :葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶（sephadexsephadex）、琼琼脂脂 糖糖 凝凝 胶胶 (sepharose)(sepharose)聚聚 丙丙 烯烯 酰酰 胺胺 凝凝 胶胶（BiogelBiogel）（3 3）凝胶过滤（分子筛层析）凝胶过滤（分子筛层析）3 3蛋白质混合样蛋白质混合样2 2据蛋白质溶解度不同的分离方法据蛋白质溶解度不同的分离方法（1 1）蛋白质的盐溶与盐析）蛋白质的盐溶与盐析（2 2）等电点沉淀法）等电点沉淀法（3 3）低温有机溶剂沉淀法）低温有机溶剂沉淀法 蛋白质溶解度的主要影响因素：蛋白质溶解度的主要影响因素：1 1，溶液的，溶液的pHpH；2 2，离子强度；，离子强度；3 3，介电常数；，介电常数；4 4，温度，温度（1 1）蛋白质的盐溶与盐析）蛋白质的盐溶与盐析1 1( (盐溶盐溶1)1)盐盐溶溶：中中性性盐盐对对球球状状蛋蛋白白质质的的溶溶解解度度有有显显著著的的影影响响。低低浓浓度度时时，中中性性盐盐可可以以增增加加蛋蛋白白质质的溶解度，这种现象称为盐溶。的溶解度，这种现象称为盐溶。机机理理：主主要要是是蛋蛋白白质质吸吸附附某某种种盐盐类类离离子子后后，带带电电表表层层使使蛋蛋白白质质分分子子彼彼此此排排斥斥，而而且且蛋蛋白白质质分分子子与与水水分分子子间间的的相相互互作作用用加加强强，因因而而溶溶解解度度提提高高。在在透透析析过过程程中中，球球蛋蛋白白分分子子沉沉淀淀析析出出，是是因因为为除除去去了了盐盐离离子子，使使蛋蛋白白质质之之间间相互吸引，引起蛋白质聚集。相互吸引，引起蛋白质聚集。（1 1）蛋白质的盐溶与盐析）蛋白质的盐溶与盐析1 1( (盐溶盐溶2)2)等电点时，疏水基团相互吸引，聚合沉淀，加入少量盐离等电点时，疏水基团相互吸引，聚合沉淀，加入少量盐离子后破坏了这种疏水作用力，使分子分散，溶于水中子后破坏了这种疏水作用力，使分子分散，溶于水中（1 1）蛋白质的盐溶与盐析）蛋白质的盐溶与盐析2 2( (盐析盐析1)1)盐盐析析：一一般般盐盐浓浓度度增增大大时时，蛋蛋白白质质的的溶溶解解度度趋趋于于减减低低，当当盐盐浓浓度度足足够够大大时时，蛋蛋白白质质可可从从溶溶液液中中完完全全沉沉淀淀出出来来，称称为为盐盐析析。以以硫硫酸酸铵铵（中中性性盐盐）最最常常应应用用。因因其其溶溶解解度度大大，且且不不易易伤伤害害蛋蛋白白质质。另另外外常常用用的的盐盐还还有有硫硫酸酸钠钠、硫酸镁及氯化钠等。硫酸镁及氯化钠等。（1 1）蛋白质的盐溶与盐析）蛋白质的盐溶与盐析2 2( (盐析盐析2)2) 蛋白质分子表面的疏水区域，聚集了许多水分蛋白质分子表面的疏水区域，聚集了许多水分子，盐浓度高时，它们被盐抽出，暴露出的疏水区子，盐浓度高时，它们被盐抽出，暴露出的疏水区域相互结合、沉淀。域相互结合、沉淀。（2 2）等电点沉淀法）等电点沉淀法 蛋蛋白白质质在在等等电电状状态态时时颗颗粒粒之之间间的的静静电电斥斥力力最最小小，因因而而溶溶解解度度也也最最小小（2 2）等电点沉淀法）等电点沉淀法溶溶解解度度m mg gN N/ /m ml lpHpH4.85.05.25.45.612305mM1mM10mM20mMpHpH和盐浓度对和盐浓度对乳球蛋白溶解度的曲线乳球蛋白溶解度的曲线 曲线上的数值为曲线上的数值为NaClNaCl的浓度的浓度（3 3）低温有机溶剂沉淀法）低温有机溶剂沉淀法 加加入入与与水水可可混混溶溶的的中中性性有有机机溶溶剂剂，特特别别是是甲甲醇醇、乙乙醇醇、丙丙酮酮可可降降低多数蛋白质的溶解度并使之沉淀。低多数蛋白质的溶解度并使之沉淀。3 3根据蛋白质带电性的分离方法根据蛋白质带电性的分离方法（1 1）电泳法）电泳法（2 2）离子交换层析法）离子交换层析法 （1 1）电泳法）电泳法1 1原原理理：由由于于各各种种蛋蛋白白质质在在同同一一pHpH条条件件下下因因分子量及荷电量不同使其电泳迁移率就不同。分子量及荷电量不同使其电泳迁移率就不同。常常用用的的是是区区带带电电泳泳：所所用用支支持持物物有有滤滤纸纸、醋醋酸酸纤纤维维素素薄薄膜膜、琼琼脂脂、淀淀粉粉、聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝胶等。凝胶等。目目前前还还有有SDSSDS聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺平平板板电电泳泳、盘盘状状电电泳泳。这这种种电电泳泳有有三三个个物物理理效效应应：样样品品的的浓浓缩缩效效应应；胶胶对对分分子子的的筛筛选选效效应应；一一般般电电泳泳分分离离的的电电荷荷效效应应。因因此此使使样样品品分分离离效效果果好好，分辨率高。分辨率高。（1 1）电泳法）电泳法2 2新新近近发发展展的的等等电电聚聚集集区区带带电电泳泳。是是利利用用一一种种两两性性电电解解质质作作为为载载体体放放入入电电解解槽槽中中，通通以以直直流流电电，两两性性电电解解质质即即形形成成一一个个由由正正极极到到负负极极的的逐逐渐渐增增加加的的pHpH梯梯度度。当当把把蛋蛋白白质质样样品品加加入入此此系系统统时时，带带正正电电的的蛋蛋白白质质向向负负极极移移动动，带带负负电电的的向向正正极极移移动动，直直至至达达到到其其等等电电点点的的pHpH的的位位置置。此此时时蛋蛋白白质质颗颗粒粒的的净净电电荷荷为为零零, ,也也就就不不再再向向任任何何一一极极移移动动，即即聚聚集集于于其其等等电电点的点的pHpH的位置。的位置。（1 1）电泳法）电泳法3 3（平板电泳）（平板电泳）（2 2）离子交换层析法）离子交换层析法阴阴离离子子交交换换剂剂或或阳阳离离子子交交换换剂剂也也可可用用于于蛋蛋白白质质分分离。离。阳阳离离子子交交换换树树脂脂含含有有的的酸酸性性基基团团可可解解离离出出H H+ +，当当溶溶液液中中含含有有其其他他阳阳离离子子时时（如如在在酸酸性性环环境境中中的的蛋蛋白白质质阳阳离离子子），它它们们可可以以和和H H+ +发发生生交交换换而而“结结合合”在在树树脂脂 ；相相反反，阴阴离离子子交交换换树树脂脂，可可解解离离出出OHOH，能能和和溶溶液液里里的的阴阴离离子子（如如碱碱性性环环境境中中的的带带负负电电的蛋白质）发生交换而结合在树脂上。的蛋白质）发生交换而结合在树脂上。常常用用的的阳阳离离子子交交换换剂剂有有弱弱酸酸型型的的羧羧甲甲基基纤纤维维（CMCM纤维素）。纤维素）。常常用用的的阴阴离离子子交交换换剂剂有有弱弱碱碱性性的的二二乙乙氨氨基基乙乙基基纤纤维素（维素（DEAEDEAE纤维素）。纤维素）。 RCHCOOHNH3+M1A+RCHCOOHNH3M1+A+ 氨基酸（在酸氨基酸（在酸性溶液中）性溶液中）阳离子交阳离子交换剂换剂 氨基酸盐氨基酸盐RCHCOONH2+M2B RCHCOO M2NH2+ B 氨基酸（在碱氨基酸（在碱性溶液中）性溶液中）阴离子交阴离子交换剂换剂 氨基酸盐氨基酸盐（2 2）离子交换层析法）离子交换层析法M1为酸性基团，M2为碱性基团4 4根据配体特异性的分离方法根据配体特异性的分离方法1 1原原理理：利利用用蛋蛋白白质质分分子子能能与与其其相相对对应应的的配配体体进进行行特特异异的的、非非共共价价的的、可可逆逆的的结合来分离纯化。结合来分离纯化。配配体体：指指能能与与某某些些蛋蛋白白质质进进行行特特异异结结合合的的化化合合物物，如如配配体体的的作作用用物物及及抑抑制制剂剂、激素和受体、抗原和抗体、酶及底物等。激素和受体、抗原和抗体、酶及底物等。4 4根据配体特异性的分离方法根据配体特异性的分离方法3 3亲和色谱颗粒亲和色谱颗粒4 4根据配体特异性的分离方法根据配体特异性的分离方法2 2首首先先需需要要制制备备有有特特异异性性配配体体的的亲亲和和层层析析柱柱。一一般般可可将将配配体体连连接接在在琼琼脂脂糖糖颗粒上。颗粒上。蛋蛋白白质质样样品品溶溶液液通通过过此此种种特特异异的的层层析析柱柱时时，与与此此配配体体特特异异结结合合的的蛋蛋白白质质便被吸附而与其它物质分开。便被吸附而与其它物质分开。再再用用某某些些试试剂剂将将蛋蛋白白质质与与配配体体重重新新拆开而分离之。拆开而分离之。方法：方法：三、蛋白质的鉴定三、蛋白质的鉴定（一）定性测定（一）定性测定（二）定量检测（二）定量检测 （一）定性测定（一）定性测定1 1( (总）总）1 1溶解度法溶解度法2 2电泳法电泳法3 3免疫学方法免疫学方法4 4超离心法超离心法5 5分光度度法分光度度法6 6化学分析法化学分析法（一）定性测定（一）定性测定2 2(1(1溶解度法溶解度法) ) 单单一一蛋蛋白白质质的的溶溶解解度度曲曲线线不不因因加加入入过过量量的的试试样样而而改改变变。如如果果蛋蛋白白质质制制品品是是纯纯的的，直直线线的的斜斜率率为为1，在在折折点点以以后后，斜斜率率为为零零。不不纯纯蛋蛋白白质质的的溶溶解解度度曲曲线线常常常常呈呈现现两两个个或或两两个个以以上上的的折折点。点。溶溶解解的的蛋蛋白白质质量量加入的固体蛋白质的量加入的固体蛋白质的量（一）定性测定（一）定性测定2 2(2(2电泳法电泳法) )琼脂糖凝胶电泳图琼脂糖凝胶电泳图（一）定性测定（一）定性测定2 2(2(2电泳法电泳法) ) “电电泳泳法法”只只是是一一个个相相对对的的概概念念，因因为为在在不不同同支支持持物物上上，电电泳泳分分离离的的效效果果不不一一样样。在在纸纸上上电电泳泳为为一一条条区区带带的的样样本本，在在聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶泳泳时时，可可能能分分成成数数条条区区带带；如如结结合合等等电电聚聚集集电电泳泳则则更更可可提提高高分分辩辩力力，很很容容易易检检出出微微量量杂杂蛋蛋白白质质的的混混存。存。（一）定性测定（一）定性测定2 2(3(3免疫学方法免疫学方法) ) 蛋蛋白白质质往往往往具具有有抗抗原原性性，用用琼琼脂脂免免疫疫扩扩散散或或免免疫疫电电泳泳法法，蛋蛋白白质质（抗抗原原）与与抗抗血血清清（抗抗体体）之间可产生沉淀线。之间可产生沉淀线。（一）定性测定（一）定性测定2 2(3(3免疫学方法免疫学方法) )A琼脂免疫扩散法琼脂免疫扩散法（一）定性测定（一）定性测定2 2 (4(4超离心法超离心法) ) 均均一一分分子子量量的的蛋蛋白白质质其其沉沉淀淀速速度度是是一一致致的的，因因此此离离心心后后在在溶溶剂剂中中形形成成一一条条明明显显的的分分界界线线。若若为为两两种种分分子子量量不不同同的的蛋蛋白白质质混混合合时时，则则形形成成二二条条分分界线。界线。（一）定性测定（一）定性测定2 2(5(5分光度度法分光度度法) ) 蛋蛋白白质质的的最最大大吸吸收收峰峰在在280mm，核核酸酸在在260mm，若若两两者者比比值值为为1.75以以上上，表表示示为为纯纯蛋蛋白白质质（OD280/ OD 260=1.8）。是是用用来来检检测测蛋蛋白白质质制制品品中中有有无无核核酸酸混混存的方法。存的方法。（一）定性测定（一）定性测定2 2(6(6化学分析法化学分析法) ) 应应用用化化学学分分析析方方法法测测定定纯纯化化了了的的蛋白质试样中的某种成分的比值。蛋白质试样中的某种成分的比值。（二）定量检测（二）定量检测1 1 ( (总）总）1 1凯氏定氮法凯氏定氮法2 2双缩脲法双缩脲法3 3福林酚试剂法福林酚试剂法4 4紫外吸收法紫外吸收法（二）定量检测（二）定量检测2 2 (1(1凯氏定氮法凯氏定氮法1 1）原原理理：氮氮在在蛋蛋白白质质分分子子中中含含量量恒恒定定（平平均均占占16%），因因此此测测出出样样品品中中氮氮的的含含量量后后，即即可求得样品中蛋白质含量。可求得样品中蛋白质含量。每每克克样样品品中中含含氮氮的的克克数数6.25100=100克克样样品中蛋白质的含量（克品中蛋白质的含量（克%）将将蛋蛋白白质质样样品品用用浓浓H2SO4 消消化化分分解解（加加热热、常常加加少少量量的的硫硫酸酸铜铜、硫硫酸酸钾钾作作催催化化剂剂），使使其其中中的的氮氮转转变变为为铵铵盐盐，碳碳转转变变为为CO2，硫硫转转变变为为SO2、SO3等等逸逸出出。铵铵盐盐再再与与浓浓碱碱反反应应，放放出出的的氨氨被被酸酸（硼硼酸酸）吸吸收收，滴滴定定剩剩余余的的酸酸，算出氮的含量。算出氮的含量。（二）定量检测（二）定量检测2 2 (1(1凯氏定氮法凯氏定氮法2 2）NH3H3BO4HCl滴定滴定(NH4) H2BO4NH4Cl+ H3BO4（二）定量检测（二）定量检测2 2 (2(2双缩脲法）双缩脲法）在在碱碱性性条条件件下下，蛋蛋白白质质或或多多肽肽（双双缩缩脲脲的的类类似似物物）与与硫硫酸酸铜铜反反应应能能产产生生紫紫红红色色络络合合物物，这这种种颜颜色色的的深深浅浅与与蛋蛋白白质质浓浓度度成成正正比比。将将样样品品同同标标准准蛋蛋白白质质同同时时测测定定，并并于于540560nm下下比比色色，测测光光吸吸收收值值，通通过过标标准准曲曲线线求求蛋蛋白白质的含量。质的含量。此此法法简简便便、迅迅速速、但但不不太太灵灵敏敏，所所需需样样品品量大，一般在量大，一般在0.21.7mg/ml。（二）定量检测（二）定量检测2 2 (3(3福林一酚试剂法）福林一酚试剂法）又叫又叫Lowry法法其其原原理理是是碱碱性性铜铜试试剂剂与与蛋蛋白白质质发发生生双双缩缩脲脲反反应应，然然后后蛋蛋白白质质中中的的酚酚基基（如如酪酪氨氨酸酸）在在碱碱性性条条件件下下很很容容易易将将混混合合试试剂剂（含含有有磷磷钼钼酸酸和和磷磷钨钨酸酸）还还原原或或蓝蓝色色的的钼钼蓝蓝和和钨钨蓝蓝，其其颜颜色色的的深深浅浅与与蛋蛋白白质质含含量量成成正正比比，在在650660nm下下测测定定光光吸吸收收值值，即即可可测测定定蛋蛋白白质含量。质含量。此此法法比比双双缩缩脲脲法法灵灵敏敏100倍倍。蛋蛋白白质质测测量量范范围围在在25250mg/ml，因因此此是是通通用用的的方方法法之之一一。但但其其受受还还原原剂剂、EDTA、Tritonx-100及及酚酚的的影影响响，并并且且蛋蛋白白质的种类不同，有较大的变动。质的种类不同，有较大的变动。（二）定量检测（二）定量检测2 2 (4(4紫外吸收法）紫外吸收法）由由于于蛋蛋白白质质分分子子中中的的酪酪氨氨酸酸、色色氨氨酸酸在在280nm左左右右具具有有最最大大吸吸收收，但但各各种种蛋蛋白白质质中中的的这这两两种种氨氨基基酸酸含含量量差差别别不不大大，所所以以在在280nm吸吸收收值值与与浓浓度度成成正正比比关关系系，可可用用于于蛋蛋白白质质含含量量测测定。定。此此法法准准确确度度较较差差，因因为为有有诸诸多多因因素素的的干干扰扰（如如核核酸酸），通通常常用用280nm及及260nm下下的的吸吸收收差大概计算蛋白质的浓度差大概计算蛋白质的浓度 蛋白质浓度蛋白质浓度mg/ml=1.45A2800.74 A260由由于于此此法法非非常常简简便便，条条件件要要求求低低，因因此此常常作作为粗略定量蛋白质的方法来使用。为粗略定量蛋白质的方法来使用。