会计学1rnai用于基因功能的鉴定用于基因功能的鉴定(jindng)和确证和确证第一页，共41页。Gain of functionORF expression clonesTansfection/TransductionLoss of functionshRNA/miRNAChemical geneticsInhibitors and activators of biological processAutomated read-outmechanismTherapeutic strategycellFulenGenGene Function Screening第1页/共40页第二页，共41页。Mechanism of RNAi (shRNA/miRNA)第2页/共40页第三页，共41页。Comparison of shRNA and miRNA propertiesArchitectureshorthairpinSingle-strandOriginalExogenousEndogenousNo.ofintendedtarget1ManyDegreeofgenesilenceHighLowComplementarytomRNAtargetPerfectImperfectEffectonmRNAEndonucleolyticcleavageRepressedtranslationshRNA miRNAFulenGen第3页/共40页第四页，共41页。FulenGen第4页/共40页第五页，共41页。u shRNA的设计与构建u shRNA的验证u miRNA的克隆(k ln)与检测u miRNA靶标的确证u 基因沉默后的功能拯救FulenGen第5页/共40页第六页，共41页。FulenGen第6页/共40页第七页，共41页。shRNA 表达克隆的构建表达克隆的构建(u jin)载体载体(zit)选择选择 筛选标记和报告基筛选标记和报告基因因 目的细胞目的细胞shRNA序列序列(xli)设计设计 高准确性的预测方法高准确性的预测方法 茎和环序列茎和环序列(xli)有效性检测有效性检测 3-5个shRNA/基因目的基因是否表达克隆和测序克隆和测序合成引物的长度茎环结构难以有效测序27mer shRNA Oligo Design 5 GATCGAGAGTGGAGGACGCTTTGCCTCCAAGCTCAAGAGGCTTGGAGGCAAAGCGTCCTCCACTCTTTTTTTGG 3 3 CTCTCACCTCCTGCGAAACGGAGGTTCGAGTTCTCCGAACCTCCGTTTCGCAGGAGGTGAGAAAAAAACCTTAA 5A(30)B(44)D(42)C(32)N1N27N27ASN1ASN1N27N27ASN1AS第7页/共40页第八页，共41页。u保证高表达抑制效率和最低的脱靶效应；u慢病毒载体和以哺乳动物(brdngw)细胞表达载体；u序列已经过测序；u每个基因提供4个克隆，至少有1抑制水平达到70%以上u提供包含不规则序列的阴性对照克隆来比较研究。OmicsLink shRNAOmicsLink shRNA表达克隆表达克隆FulenGen第8页/共40页第九页，共41页。经过验证的人类激酶组经过验证的人类激酶组shRNA表达克隆表达克隆 350个人类激酶基因的确证个人类激酶基因的确证shRNA表达克隆表达克隆 表达抑制效应都经过验证，达表达抑制效应都经过验证，达70以上以上(yshng) 低的脱靶效应。低的脱靶效应。 FulenGen第9页/共40页第十页，共41页。shRNA克隆克隆(k ln)用于信号通用于信号通路研究路研究第10页/共40页第十一页，共41页。qPCR Primer array 即将即将(jjing)上市上市p采用先进的算法，精心设计的qPCR引物p扩展长度(chngd)100250bp；pPCR扩展效率90%；p每对引物的都经过扩展曲线、溶解曲线和电泳检测，包括扩展的特异性第11页/共40页第十二页，共41页。ExonicNon-codingMicroRNAs 由由RNA Polymerase II转录转录(zhun l)IntronicNon-codingandcodingLee,etal.,EMBOJ.23:4051-602004第12页/共40页第十三页，共41页。/-OHmature and primary microRNA 的结构的结构(jigu)Pri-miRNADroshaCleavagesiteMature第13页/共40页第十四页，共41页。Vector-Based microRNA Expression Clones Promoter5 miR flank3 miR flankPre-miR TerFulenGen第14页/共40页第十五页，共41页。III 型启动子II 型启动子CMVeGFPPriMiRNAIRESPuromycinpolyAH1/U6eGFPPriMiRNAIRESPuromycinTTTTTTCMVVector-Based microRNA Expression Clones IIII型启动子型启动子IIIIII型启动子型启动子转录序列PriPri/Pre转录终止位置不确定确定转录产物不确定确定FulenGen第15页/共40页第十六页，共41页。OmicsLink Human Precursor miRNA Expression Clones pEZ-MR02u650种前体miRNA表达克隆涵盖了miRBase（版本）中已知的678种miRNA的95% umiRNA表达框已完全测序确证 u基于慢病毒载体系统的表达克隆可转染未分化细胞和难转化的细胞，获得与普通分化细胞类似的转染效率 u提供被转染细胞的存活性的筛选基因，可用于稳定(wndng)或瞬时表达调控 u通过应用eGFP可以监测病毒和质粒载体的转染效率 FulenGen第16页/共40页第十七页，共41页。microRNA肿瘤发生miR-9神经母细胞瘤miR-10b乳腺癌miR-15、miR-15a白血病、垂体腺瘤miR-16、miR-16-1白血病、垂体腺瘤miR-17-5p、miR-17-92肺癌、淋巴瘤miR-20a肺癌、淋巴瘤miR-21乳腺癌、胆管腺癌、头颈癌、白血病、宫颈癌miR-29、miR-29b白血病，胆管腺癌miR-31结肠直肠癌miR-34a胰腺癌miR-96结肠直肠癌miR-98头颈癌miR-103胰腺癌miR-107白血病、胰腺癌miR-125a、miR-125b神经母细胞瘤、乳腺癌miR-128胶质母细胞瘤miR-133b结肠直肠癌miR-135b结肠直肠癌miR-143结肠癌、宫颈癌miR-145乳腺癌、结肠直肠癌miR-146甲状腺癌miR-155乳腺癌、白血病、胰腺癌miR-181、miR-181a、miR-181b、miR-181c肺癌、白血病、胶质母细胞瘤、甲状腺癌miR-183直肠结肠癌miR-184神经母细胞瘤miR-196a-2胰腺癌miR-221胶质母细胞瘤、甲状腺癌、胰腺癌miR-222甲状腺癌miR-223白血病miR-301胰腺癌miR-376胰腺癌let-7、let-7a、let-7a-1、hsa-let-7a-2、let-7a-3肺癌、结肠癌miRNA与肿瘤与肿瘤(zhngli)第17页/共40页第十八页，共41页。miRNA的检测(jin c)和定量检测检测(jin c)(jin c)方法方法 NothernblotNothernblot Microarray Microarray Quantitative Real-time PCR Quantitative Real-time PCR检测检测(jin c)(jin c)对象对象 Primary-miRNA Primary-miRNA Pre-miRNA Pre-miRNA Mature miRNA Mature miRNAFulenGen第18页/共40页第十九页，共41页。QuantitativeReal-timePCRdetectmiRNApolyApolyA加尾法加尾法LoopLoop反转录反转录(zhun l)(zhun l)法法通用性高；适用于同一样本检测多种miRNA经济(jngj)、方便特异性高；适用于多个(du)样本中检测同一miRNA价格较高FulenGen第19页/共40页第二十页，共41页。qPCR检测(jinc)miRNA的特异性第20页/共40页第二十一页，共41页。qPCRqPCR检测检测检测检测(ji(ji n c)miRNAn c)miRNA的特异性的特异性的特异性的特异性 第21页/共40页第二十二页，共41页。第22页/共40页第二十三页，共41页。qPCR检测(jinc)miRNA困难采用采用(ciyng)LN(ciyng)LNA A探针探针第23页/共40页第二十四页，共41页。miRNA TargetmiRNA Target的分析的分析的分析的分析(fnx)(fnx)n n研究发现，在哺乳动物中，研究发现，在哺乳动物中，miRNAsmiRNAs的基因抑制作用的基因抑制作用是通过其是通过其55一段长为一段长为6 68nt8nt的核苷酸与的核苷酸与mRNAs3mRNAs3端非翻译区域相结合实现的。一般这段核苷酸位于端非翻译区域相结合实现的。一般这段核苷酸位于 miRNAmiRNA序列序列55的的2828个个ntnt，被称为，被称为seedseed区。区。n n20072007年，美国约翰年，美国约翰霍普金斯大学发现霍普金斯大学发现miR-29b 5miR-29b 5的的6 6个核苷酸与该个核苷酸与该miRNAmiRNA的细胞定位的细胞定位(dngwi)(dngwi)有关。有关。FulenGen第24页/共40页第二十五页，共41页。n nmiRNA 5的seed区域在miRNA家族中具有很高的保守(boshu)性，对脊椎动物的miRNA target的识别具有重要的作用，尤其是第2-8个碱基。 FulenGen第25页/共40页第二十六页，共41页。针对针对HDAC5HDAC5的三个不同版本的三个不同版本(bnbn)(bnbn)的算法的的算法的microRNAmicroRNA的预测结果的预测结果红色表示第三(dsn)和第四版重叠的microRNA，黄色表示第四和第五版重叠的microRNA第26页/共40页第二十七页，共41页。microRNAhLucTranslationDegradeationOr Translation inhibitionLightNo LightpEZX-MT01第27页/共40页第二十八页，共41页。RenillaLuciferasedataFirefly Luciferase data第28页/共40页第二十九页，共41页。第29页/共40页第三十页，共41页。第30页/共40页第三十一页，共41页。miRNA的编辑(binj)及其靶标的变化seedelment：AImiR376a-5p 经过编辑后，其靶标的变化经过编辑后，其靶标的变化FulenGen第31页/共40页第三十二页，共41页。OmicsLinkHumanmiRNATargetSequence(3UTR)ExpressionClonesSV40 hLuc RLuc CMV polyA polyA pUC oriKan/Neo3UTRSV40 GLuc sAP CMV polyA polyA pUC oriKan/Neo3UTRpEZX-MT01pEZX-MT02FulenGen第32页/共40页第三十三页，共41页。Gaussia luciferase expression in CHO cellsFulenGen第33页/共40页第三十四页，共41页。构建克构建克隆隆转染细转染细胞胞分泌表达Luciferase取上清取上清加入底物加入底物读取荧光值读取荧光值FulenGen第34页/共40页第三十五页，共41页。miRNADeliverintocell,tissueoranimalRestorethesilencegenefunctionmRNAcleavageortranslationinhibitionSilencegenefunction基因沉默后的功能基因沉默后的功能(gngnng)拯救拯救第35页/共40页第三十六页，共41页。第36页/共40页第三十七页，共41页。第37页/共40页第三十八页，共41页。RNAi临床药物临床药物(yow)开开发发第38页/共40页第三十九页，共41页。Thank You! Phone： 020-32068595; FAX： Email：第39页/共40页第四十页，共41页。内容(nirng)总结会计学。慢病毒载体和以哺乳动物细胞表达载体。每对引物的都经过扩展曲线、溶解曲线和电泳检测，包括扩展的特异性。Drosha Cleavage site。3 miR flank。提供被转染细胞的存活性的筛选(shixun)基因，可用于稳定或瞬时表达调控。第16页/共40页。第17页/共40页。Quantitative Real-time PCR。Silence gene function。Email：。第39页/共40页第四十一页，共41页。