第一节第一节 甲壳动物的免疫系统的组成甲壳动物的免疫系统的组成甲壳动物的免疫系统的组成甲壳动物的免疫系统的组成proPOproPO系统组成及其释放、激活的调控机制系统组成及其释放、激活的调控机制动物免疫系统的进化树动物免疫系统的进化树体腔动物一、甲壳动物的免疫系统的组成一、甲壳动物的免疫系统的组成v从免疫进化角度，从免疫进化角度，甲壳动物的免疫系统仅由遗甲壳动物的免疫系统仅由遗传控制的组织相容性反应和中胚层起源的效应传控制的组织相容性反应和中胚层起源的效应细胞组成细胞组成，不具备，不具备T、B淋巴细胞、免疫球蛋白淋巴细胞、免疫球蛋白等免疫效应因子等免疫效应因子v甲壳类不具备甲壳类不具备获得性免疫获得性免疫（adaptive/acquired immunityadaptive/acquired immunity），仅），仅有有天然免疫天然免疫（innate immunityinnate immunity）甲壳动物免疫防御系统由甲壳动物免疫防御系统由基本防御屏障基本防御屏障（甲壳和表皮）（甲壳和表皮）、细胞防御屏障细胞防御屏障和和生理防御屏障生理防御屏障三部分组成三部分组成 甲壳，机械屏障作用蜕壳后新甲壳尚未硬化的表皮中，有苯醌生成，苯醌具有抗生作用，构成甲壳动物体表的化学防御屏障前肠、后肠及鳃表面，有表皮细胞覆盖甲壳和表皮构成了甲壳动物最基本的免疫防御屏障甲壳和表皮构成了甲壳动物最基本的免疫防御屏障若对虾的甲壳磨损或表皮受损，则极易受水体中病原菌的感染，从而产生甲壳溃疡病等病症 基本防御屏障基本防御屏障细胞防御屏障细胞防御屏障对虾免疫防御的核心对虾免疫防御的核心对虾的细胞防御主要由对虾的细胞防御主要由血淋巴细胞血淋巴细胞承担承担 血淋巴细胞血淋巴细胞是虾类免疫系统中最为重要的组分，虾虾免疫功能主要通过血淋巴细胞来完成免疫功能主要通过血淋巴细胞来完成许多非细胞免疫因子，都直接或间接与血淋巴细胞有关不同类型的血淋巴细胞在虾免疫系统中所起的作用不同不同类型的血淋巴细胞在虾免疫系统中所起的作用不同（表1）细胞防御屏障细胞防御屏障表表1 虾类血淋巴细胞的免疫功能虾类血淋巴细胞的免疫功能细胞类型细胞类型免疫功能免疫功能透明细胞透明细胞吞噬作用；参与血淋巴凝固；伤口修复吞噬作用；参与血淋巴凝固；伤口修复小颗粒细胞小颗粒细胞包掩作用，有限的吞噬作用，储存和释放包掩作用，有限的吞噬作用，储存和释放proPOproPO系统，细系统，细胞毒作用胞毒作用大颗粒细胞大颗粒细胞储存和释放储存和释放proPOproPO系统，细胞毒作用，伤口修复系统，细胞毒作用，伤口修复吞噬作用是最重要的细胞防御反应吞噬作用是最重要的细胞防御反应中国明对虾的透明细胞中国明对虾的透明细胞光镜下：细胞近球形，直径17.520.0微米，细胞核大靠近中央，核占细胞体大部分，其周围的细胞质少，细胞质中基本无颗粒状物质v透明细胞（透明细胞（X8000）v1细胞核；2匀质颗粒；3条纹颗粒；4线粒体；5，6内质网中国明对虾的小颗粒细胞中国明对虾的小颗粒细胞光镜下：细胞球形或卵圆形，长轴直径20.022.5微米，短轴直径15.020.0微米，细胞核清晰，略偏于细胞一侧，细胞质中有一些黑色小颗粒状物质v小颗粒细胞小颗粒细胞（X8000）v1细胞核；2小颗粒；3匀质颗粒；4条纹颗粒；5微管束，6线粒体，7，8内质网中国明对虾的大颗粒细胞中国明对虾的大颗粒细胞光镜下：细胞球形或卵圆形，相对较大，长轴直径25.032.5微米，短轴直径17.525.0微米，细胞核所占比例小，细胞质中含有大量较大颗粒状物质v大颗粒细胞大颗粒细胞（X8000）v1细胞核；2大颗粒；3线粒体；4内质网；5微管束血淋巴细胞对大颗粒异物的吞噬过程血淋巴细胞对大颗粒异物的吞噬过程清除清除异物的识别异物的识别（由该异物的表面性质（如LPS，PG，-葡聚糖等）和血淋巴细胞膜上的专一性受体（如LPSBP，BGBP，凝集素等）共同决定的）粘连粘连（由血淋巴细胞分泌的一种附着因子（76kD蛋白）所介导）聚集聚集（血淋巴细胞与异物粘连后相互聚集而形成细胞团） 摄入摄入在异物的吞噬过程中，不同的血淋巴细在异物的吞噬过程中，不同的血淋巴细胞协同发挥作用胞协同发挥作用透明细胞：透明细胞：具较强的吞噬能力，需活化的酚氧化酶原系统组分激活其吞具较强的吞噬能力，需活化的酚氧化酶原系统组分激活其吞噬能力噬能力小颗粒细胞：小颗粒细胞：只在脱颗粒之后才具有吞噬活性，对异物非常敏感，极易只在脱颗粒之后才具有吞噬活性，对异物非常敏感，极易脱颗粒，释放酚氧化酶组分脱颗粒，释放酚氧化酶组分大颗粒细胞：大颗粒细胞：含大量的酚氧化酶原，无吞噬能力，可释放大量的活性酚含大量的酚氧化酶原，无吞噬能力，可释放大量的活性酚氧化酶促进透明细胞的吞噬氧化酶促进透明细胞的吞噬小颗粒细胞是免疫防御反应中起关键作用的细胞小颗粒细胞是免疫防御反应中起关键作用的细胞细菌的吞噬及杀灭过程生理防御屏障生理防御屏障酚氧化酶原激活系统（酚氧化酶原激活系统（proPO系系统）统） 凝集素凝集素 （agglutinin）可凝固蛋白可凝固蛋白（clottable protein，CP） 细胞毒活性氧细胞毒活性氧 (RIOs)抗微生物多肽抗微生物多肽 溶血素溶血素 溶酶体酶溶酶体酶 消化酶消化酶 酚氧化酶原激活系统（酚氧化酶原激活系统（proPOproPO系统）系统）proPO系统是虾类重要的识别与防御系统系统是虾类重要的识别与防御系统对入侵异物发生免疫反应的关键是对异物的初始对入侵异物发生免疫反应的关键是对异物的初始识别识别高等动物，初始识别过程由抗体、高等动物，初始识别过程由抗体、T淋巴细胞和补体途径完淋巴细胞和补体途径完成成对虾类由对虾类由proPO系统组成的类补体途径充当了重要的角色系统组成的类补体途径充当了重要的角色极微量的微生物多糖极微量的微生物多糖(如如-1，3-glucan，LPS，PG等等)以及胰蛋白，以及胰蛋白，SDS等就可激活等就可激活proPOproPO系统系统活化过程中活化过程中产生一系列的活性物质产生一系列的活性物质，可通过多，可通过多种方式种方式参与宿主的防御反应参与宿主的防御反应，包括提供调理素，包括提供调理素，促进血淋巴细胞吞噬作用，包囊作用和结节形促进血淋巴细胞吞噬作用，包囊作用和结节形成，以及介导凝集和凝固，产生杀菌物质等成，以及介导凝集和凝固，产生杀菌物质等甲壳动物体内存在多种能使细菌、脊椎动物红细胞、寄生虫等发甲壳动物体内存在多种能使细菌、脊椎动物红细胞、寄生虫等发生凝集的因子，称为生凝集的因子，称为凝集素凝集素其实质是一类其实质是一类糖蛋白糖蛋白，具有结构异质性和异物结合位点的特异性，具有结构异质性和异物结合位点的特异性，其其作用类似脊椎动物的抗体作用类似脊椎动物的抗体，是虾类体内的另一类免疫识别因子，是虾类体内的另一类免疫识别因子虾类凝集素由血淋巴细胞合成虾类凝集素由血淋巴细胞合成 凝集素借助其分子上的糖基与细胞表面相应的糖基受体相结合，凝集素借助其分子上的糖基与细胞表面相应的糖基受体相结合，形成细胞间桥梁，导致细胞被凝集形成细胞间桥梁，导致细胞被凝集凝集素凝集素凝集素凝集素凝集素在虾类免疫防御过程中，具有三种功能：1、清除杂物功能，在虾类变态期间，参与清除机体不必要的细胞，、清除杂物功能，在虾类变态期间，参与清除机体不必要的细胞，组织片段或残余物组织片段或残余物2、参与识别参与识别防御机制防御机制，3、参与其他活动功能，参与止血、凝固、胞囊、微生物中和作用、参与其他活动功能，参与止血、凝固、胞囊、微生物中和作用直至创伤修复等，以保障机体健康直至创伤修复等，以保障机体健康 凝集素具有高度的调理作用，能专一性的结合在非己颗粒的表面，而且还能与吞噬细胞表面的受体相结合，从而象脊椎动物的补体系统的C3b成分和免疫球蛋白的Fc片段那样促进吞噬作用凝集素的这种调理作用可能通过如下二种机制完成：1)当凝集素与非己物质结合后引起凝集素分子结构发生变化，使其第二活性位点能与血细胞膜上的受体位点结合；2）某些凝集素本身就是膜结合凝集素此外，凝集素能促进血淋巴细胞活化，诱导血淋巴细胞中各种酶（如proPO系统成分）的活化和释放，从而将入侵异物灭活可凝固蛋白是虾类血淋巴内不同于凝集素的又一类免疫防御分子，已在多种虾蟹体内被发现已知CP为一糖蛋白，由2个相同的亚基通过二硫键组成，每个亚基各含一个游离的赖氨酸和谷氨酰氨CP不与外界异物直接起作用，但当虾受伤，在血细胞（尤其是透明细胞和小颗粒细胞）释放的谷氨酰氨转移酶（TGases）和血浆钙离子存在时，不同CP分子之间的游离赖氨酸和谷氨酰氨之间形成共价键，从而使虾类的血淋巴发生凝固，防止机体血淋巴的流失 可凝固蛋白可凝固蛋白可凝固蛋白可凝固蛋白虾类血淋巴细胞在吞噬侵入体内的病原微生物后，会产生呼吸爆发现象，释放有毒性的活性氧，包括过氧化氢，羟自由基和单线态氧等产物,这些物质具有强有力的杀菌作用透透明明细细胞胞是是产产生生细细胞胞毒毒活活性性氧氧的的场场所所，而而小小颗颗粒粒细细胞和大颗粒细胞不产生活性氧胞和大颗粒细胞不产生活性氧呼吸爆发的活力与对虾的生存环境和抗病力均有关 细胞毒活性氧（呼吸爆发）细胞毒活性氧（呼吸爆发）细胞毒活性氧（呼吸爆发）细胞毒活性氧（呼吸爆发）抗微生物多肽是动物界中广泛存在的一种宿主防御机制对虾素（Penaeidins）是虾类中研究最多的一类抗微生物多肽，血淋巴细胞是对虾素产生和存储的场所，机体产生应激反应时可将对虾素从血细胞中释放到血淋巴中抗微生物多肽抗微生物多肽抗微生物多肽抗微生物多肽在Litopenaeus vannamei中，发现了3类penaeidins：Pen-1: 50个氨基酸残基Pen-2: 50个氨基酸残基Pen-3: 62个氨基酸残基对虾素的结构特点：对虾素的结构特点：氨基端富含proline残基羧基端含有6个cysteine残基分子内含3个二硫键对虾素具有广泛的抗微生物作用对虾素具有广泛的抗微生物作用，包括抗革兰氏阳，包括抗革兰氏阳性细菌和抗真菌性细菌和抗真菌对虾素抗细菌作用表现为在细菌膜上形成孔洞从而使菌对虾素抗细菌作用表现为在细菌膜上形成孔洞从而使菌膜裂解的快速杀菌作用，而抗真菌作用则通过抑制丝状膜裂解的快速杀菌作用，而抗真菌作用则通过抑制丝状真菌的孢子的萌发和菌丝的生长而实现真菌的孢子的萌发和菌丝的生长而实现此外，研究还表明，对虾素还具有结合几丁质的性此外，研究还表明，对虾素还具有结合几丁质的性能能 在日本对虾和中国对虾的体内都曾发现能对鸡红细胞产生溶血作用的溶血素活性这种溶血作用是由溶血素与血细胞表面的特异性糖链结合后，使细胞膜发生溶解造成的机体溶血素活性的高低反映了机体识别和排除异种细胞能力的大小机体溶血素活性的高低反映了机体识别和排除异种细胞能力的大小其作用可能类似于脊椎动物的补体系统，可溶解破坏异物细胞，参与调理作用，能溶解革兰氏阳性菌，并可能与酚氧化酶原的激活系统有关 溶血素溶血素溶血素溶血素溶酶体酶主要源于血淋巴细胞和血淋巴，研究较多的有溶菌酶碱性磷酸酶酸性磷酸酶过氧化物酶超氧化物歧化酶等这些酶的活性和水平在某种程度上与生物体的健康状况及免疫水平密切相关因此其活性的变化可衡量动物的免疫状态 溶酶体酶溶酶体酶溶酶体酶溶酶体酶虾蟹消化道内的消化酶对混杂在食物中的病菌及寄生虫也具有一定的杀灭降解作用 消化酶消化酶消化酶消化酶二、二、proPOproPO系统组成及其释放、激活的调控机制系统组成及其释放、激活的调控机制1、 proPO系统中重要的蛋白质及其功能系统中重要的蛋白质及其功能 2、 proPOproPO系统释放和被激活的调控机制系统释放和被激活的调控机制 proPO系统中重要的蛋白质及其功能系统中重要的蛋白质及其功能 -1，3-葡聚糖结合蛋白（葡聚糖结合蛋白（BGBP） BGBP受体受体 76kD蛋白（蛋白（Peroxinectin） 酚氧化酶原激活酶酚氧化酶原激活酶ppA 酚氧化酶原酚氧化酶原proPO 酚氧化酶酚氧化酶PO BGBP是虾类免疫系统中是虾类免疫系统中3类重要的类重要的非己识别非己识别蛋白蛋白之一（另外两类重要的识别蛋白分别是之一（另外两类重要的识别蛋白分别是肽葡聚糖识别蛋白肽葡聚糖识别蛋白和和LPSLPS结合蛋白结合蛋白 ）BGBP存在于血淋巴细胞和血淋巴中存在于血淋巴细胞和血淋巴中 -1，3-葡聚糖结合蛋白（葡聚糖结合蛋白（BGBP）BGBP具有两个生物学功能位点具有两个生物学功能位点，其中一个位点能与微生物其中一个位点能与微生物成分相结合，另一个位点能与虾血细胞上的相应配体结合，成分相结合，另一个位点能与虾血细胞上的相应配体结合，且后一位点只有在前一位点已发生结合时才具生物学活性且后一位点只有在前一位点已发生结合时才具生物学活性这样既能满足识别非己物质并产生免疫反应的需要，又能防止无外物攻击时产生自身免疫性反应-葡聚糖(G)对大颗粒细胞无直接作用，但G与BGBP相结合后，结合物可同大颗粒细胞表面的相应受体结合，引起一系列细胞反应：BGBP与与GG结合后，能够激活结合后，能够激活proPO系统的活性系统的活性能够引起大颗粒细胞中能够引起大颗粒细胞中proPO系统的释放和介导血淋巴细胞系统的释放和介导血淋巴细胞在病原体表面的扩张在病原体表面的扩张结合有结合有GG的的 BGBP还可作为一种调理素，刺激离体血淋巴还可作为一种调理素，刺激离体血淋巴细胞吞噬吸收酵母颗粒细胞吞噬吸收酵母颗粒 BGBP受体受体 存 在 于 血 淋 巴 大 颗 粒 细 胞 的 细 胞 膜 上， 能 够 与 结 合 有 葡 聚 糖 的 BGBP 蛋 白 起 作 用， 参 与 细 胞 内 外 的 信 息 传 递 BGBP受体受体76kD蛋白（蛋白（Peroxinectin） 以非活化状态存在于有颗粒细胞中，伴随proPO系统的激活而活化76 kD蛋白具有多种功能：1）在体外，可作为血淋巴细胞附着因子，在钙离子存在时，可促进血）在体外，可作为血淋巴细胞附着因子，在钙离子存在时，可促进血淋巴细胞附着于玻片上淋巴细胞附着于玻片上2）具有调理素活性和促包囊形成活性，起到增强血淋巴细胞结合、吞）具有调理素活性和促包囊形成活性，起到增强血淋巴细胞结合、吞噬病原体的作用噬病原体的作用3）可通过胞吐作用引起大颗粒细胞和小颗粒细胞的脱颗粒作用）可通过胞吐作用引起大颗粒细胞和小颗粒细胞的脱颗粒作用4）参与细胞间信息传递，使机体有效调动免疫系统对抗异物入侵）参与细胞间信息传递，使机体有效调动免疫系统对抗异物入侵5）具有过氧化物酶的活性）具有过氧化物酶的活性 76kD蛋白（蛋白（Peroxinectin）酚氧化酶原激活酶酚氧化酶原激活酶ppA 主要存在于有颗粒细胞内，是一种丝氨酸蛋白酶，可通过蛋白水解作用将proPO裂解为具有酚氧化酶（PO）活性的酶分子，从而激活proPO系统ppA本身可能还具有抗微生物活性 酚氧化酶原激活酶酚氧化酶原激活酶ppA酚氧化酶原酚氧化酶原proPO酚氧化酶原酚氧化酶原proPO 是PO的前体主要存在于大颗粒细胞内，少量存在于小颗粒细胞内酚氧化酶酚氧化酶PO 主要存在于血浆中，具有如下免疫功能：参与黑色素的形成，可将单酚羟基化形成二酚，二酚进一步氧化生成醌作为一种识别系统的成分诱导宿主防御系统中其他成分的产生酚氧化酶还可作为调理素，促进透明细胞的吞噬作用 酚氧化酶酚氧化酶PO除此之外，proPO系统中还存在一些蛋白酶抑制剂，如胰蛋白酶抑制剂和类-巨球蛋白能调节proPO系统的激活，并参与溶解外源细胞 proPOproPO系统释放和被激活的调控机制系统释放和被激活的调控机制 当微生物或寄生虫等侵入宿主机体时，其体表的结构成分当微生物或寄生虫等侵入宿主机体时，其体表的结构成分（如（如葡聚糖，肽葡聚糖和葡聚糖，肽葡聚糖和LPS等）作为等）作为异己信号异己信号，一方面一方面直接作用直接作用于于小颗粒细胞小颗粒细胞，诱导其，诱导其产生胞吐产生胞吐作用，作用，释放释放少量少量proPO系统的组分系统的组分proPOproPO和和proppAproppA（无活性的酚氧化酶原（无活性的酚氧化酶原激活酶原）于细胞膜上；激活酶原）于细胞膜上；另一方面异物体表的结构成分另一方面异物体表的结构成分与相应的识别蛋白相结合与相应的识别蛋白相结合，形成异物，形成异物- -识别蛋识别蛋白结合物，此结合物与大颗粒细胞膜上的白结合物，此结合物与大颗粒细胞膜上的异物异物- -识别蛋白结合物的受体相结识别蛋白结合物的受体相结合合，将异物入侵信号传入大颗粒细胞将异物入侵信号传入大颗粒细胞，使，使大颗粒细胞胞吐大颗粒细胞胞吐proPOproPO和和proppA proppA 于于细胞膜上细胞膜上异物异物- -识别蛋白结合物识别蛋白结合物也可也可作用于细胞膜上的作用于细胞膜上的proppAproppA，使，使之成为有活性的之成为有活性的酚氧化酶原激活酶酚氧化酶原激活酶(ppA)(ppA)ppA在调节因子（蛋白酶抑制剂）的调节下，可按需将proPO激活proPO经过有限水解形成有活性的酚氧化酶PO进入血淋巴PO将酚氧化成醌，醌自发生成最终产物黑色素激活的proPO系统的组分同时还可激活76kD蛋白激活的76kD蛋白既可促进血淋巴细胞对入侵异物的包囊作用，又可正反馈调节小颗粒细胞和大颗粒细胞胞吐proppA由于proPO系统主要存在于有颗粒的细胞中，因此，BGBPBGBP和和76kD蛋蛋白就成为控制白就成为控制proPO系统释放的重要物质系统释放的重要物质通过proPO系统形成的黑色素及其形成过程中的中间产物皆为高活性物质，可抑制病原体胞外蛋白酶和几丁质酶的活性，从而在伤口愈合、抑制甚至杀死病原体方面发挥着重要的作用 本节内容的重点本节内容的重点1 1、甲壳动物免疫系统的特点及组成、甲壳动物免疫系统的特点及组成2 2、甲壳动物血淋巴细胞的免疫机能、甲壳动物血淋巴细胞的免疫机能3 3、血淋巴细胞清除异物的过程、血淋巴细胞清除异物的过程4 4、甲壳动物生理防御屏障的组成、甲壳动物生理防御屏障的组成5 5、proPOproPO系统中重要的蛋白质及其功能系统中重要的蛋白质及其功能6 6、 proPOproPO系统释放和被激活的调控机制系统释放和被激活的调控机制7 7、甲壳动物血液凝固的机理、甲壳动物血液凝固的机理