第二章第二章 培养基及其制备培养基及其制备本章内容简介：本章内容简介：培养基原材料培养基原材料淀粉水解糖的制备淀粉水解糖的制备糖蜜前处理糖蜜前处理石油代粮发酵微生物工程的特征石油代粮发酵微生物工程的特征第一节第一节 培养基的原材料培养基的原材料一、培养基的营养成分及用途一、培养基的营养成分及用途 光光 光能自养光能自养 氢、硫、氨氢、硫、氨 自养菌自养菌.能源能源 亚硝酸盐、亚铁盐亚硝酸盐、亚铁盐 化能自养化能自养 碳水化合物等有机物碳水化合物等有机物 石油天然气和石油化工产品石油天然气和石油化工产品 功能：生长、繁殖需要；功能：生长、繁殖需要； 异养菌异养菌 碳酸气碳酸气 淀粉水解糖、糖蜜、亚硫酸盐纸浆废液等淀粉水解糖、糖蜜、亚硫酸盐纸浆废液等 石油、正构石蜡、天然气石油、正构石蜡、天然气 醋酸、甲醇、乙醇等石油化工产品醋酸、甲醇、乙醇等石油化工产品 功能：提供能量、构成菌体、代谢产物的物质基础；功能：提供能量、构成菌体、代谢产物的物质基础； 豆饼或蚕蛹水解液、味精废液豆饼或蚕蛹水解液、味精废液.氮源氮源 玉米浆、酒糟水等有机氮玉米浆、酒糟水等有机氮 尿素、硫酸铵、氨水、硝酸盐等无机氮、气态氮尿素、硫酸铵、氨水、硝酸盐等无机氮、气态氮 功能：构成菌体、含氮代谢物；功能：构成菌体、含氮代谢物；.碳源碳源碳源碳源 磷酸盐、钾盐、钙盐等矿物盐磷酸盐、钾盐、钙盐等矿物盐.无机盐无机盐 铁、锰、钴等微量元素铁、锰、钴等微量元素 功能：构成菌体，参与酶的组成，维持酶活性，调节渗功能：构成菌体，参与酶的组成，维持酶活性，调节渗透压，调节透压，调节pHpH值，维持氧化还原电位；值，维持氧化还原电位；.特殊生长因子：硫胺素、生物素、对氨基苯甲酸、肌特殊生长因子：硫胺素、生物素、对氨基苯甲酸、肌醇等醇等 功能：酶的辅助部分，维持生命活动；功能：酶的辅助部分，维持生命活动；.水分水分 功能：生化反应均在水溶液中进行功能：生化反应均在水溶液中进行二、培养基的类型二、培养基的类型 1.1.依营养物质的来源分类依营养物质的来源分类 天然培养基；天然培养基；（麦芽汁、玉米粉、麸皮、锯末等）（麦芽汁、玉米粉、麸皮、锯末等） 合成培养基；合成培养基； （高氏培养基、察氏培养基等（高氏培养基、察氏培养基等 ） 半合成培养基；半合成培养基； （牛肉膏蛋白胨、土豆葡萄糖（牛肉膏蛋白胨、土豆葡萄糖培养基）培养基） 2.2.依培养基制成的形式分：依培养基制成的形式分： 液体培养基；液体培养基； 固体培养基；固体培养基； 3.3.依培养基主要成分和使用目的来分依培养基主要成分和使用目的来分 基础培养基基础培养基 完全培养基完全培养基 鉴别培养基鉴别培养基 选择培养基选择培养基4.4.根据生产工艺来分根据生产工艺来分 孢子培养基孢子培养基 种子培养基种子培养基 发酵培养基发酵培养基 附：培养基配方举例附：培养基配方举例三、发酵培养基的选择三、发酵培养基的选择 发酵培养基的用途与要求、成分、配比经实验确定，发酵培养基的用途与要求、成分、配比经实验确定，配制时兼顾原料来源、成本及工艺管理；配制时兼顾原料来源、成本及工艺管理；四、原料转换及意义四、原料转换及意义 发酵培养基中所用原材料，大部分属于粮食、油脂、发酵培养基中所用原材料，大部分属于粮食、油脂、蛋白质和农用肥料，其中山芋粉、玉米粉、淀粉、糊精、蛋白质和农用肥料，其中山芋粉、玉米粉、淀粉、糊精、麦芽糖等都是可供人畜食用的粮食、油料或以粮食为原麦芽糖等都是可供人畜食用的粮食、油料或以粮食为原料的产品；我国人口众多，发酵产品品种和产量与日俱料的产品；我国人口众多，发酵产品品种和产量与日俱增，每年都消耗大量粮食、油料和蛋白质原料。增，每年都消耗大量粮食、油料和蛋白质原料。 随着原料的转换，不仅要选育与原料转换相适应的随着原料的转换，不仅要选育与原料转换相适应的菌种，同时发酵的控制方法也不相同。菌种，同时发酵的控制方法也不相同。第二节第二节 淀粉水解糖的制备淀粉水解糖的制备一、淀粉的性质：一、淀粉的性质：颗粒状态颗粒状态来源，纯度来源，纯度淀粉转化为葡萄糖：增重淀粉转化为葡萄糖：增重11%11%，还原基团，还原基团 甜味甜味 呈味物质呈味物质 色泽色泽二、淀粉水解糖的制备方法二、淀粉水解糖的制备方法 1.1.酸解法酸解法 2.2.酶解法酶解法 3.3.酸酶结合法酸酶结合法 酸酶法酸酶法 酶酸法酶酸法不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大双酶水解法制葡萄糖的优点双酶水解法制葡萄糖的优点 ：（1 1）淀粉水解是在酶的作用下进行的，酶解的反应条件）淀粉水解是在酶的作用下进行的，酶解的反应条件比较温和。比较温和。（2 2）微生物作用的专一性强，淀粉的水解副反应少，因）微生物作用的专一性强，淀粉的水解副反应少，因而水解糖液纯度高，淀粉的转化率高。而水解糖液纯度高，淀粉的转化率高。（3 3）可在较高淀粉乳浓度下水解。）可在较高淀粉乳浓度下水解。（4 4）由于微生物酶制剂中菌体细胞的自溶，糖液的营养）由于微生物酶制剂中菌体细胞的自溶，糖液的营养物质较丰富，这就使发酵培养基的组成可加以简化。物质较丰富，这就使发酵培养基的组成可加以简化。（5 5）用酶法制得的糖液颜色浅、较纯净、无苦味、质量）用酶法制得的糖液颜色浅、较纯净、无苦味、质量高，有利于糖液的精制。高，有利于糖液的精制。 二、淀粉酸水解理论基础二、淀粉酸水解理论基础 淀淀粉粉水水解解成成葡葡萄萄糖糖的的反反应应过过程程中中同同时时发发生生：水水解解反反应应、复复合合反反应应、分分解解反反应应；其其中中水水解解反反应应是是主主要要的的。 在淀粉糖化过程中，这三种化学反应的关系如下：在淀粉糖化过程中，这三种化学反应的关系如下：淀粉淀粉葡萄糖葡萄糖复合二糖复合二糖 5-羟甲基糖醛羟甲基糖醛复合低聚糖复合低聚糖有机酸、有色物质等有机酸、有色物质等盐酸盐酸 复合反应：葡萄糖分子间经复合反应：葡萄糖分子间经1-61-6糖苷键结合成龙胆二糖苷键结合成龙胆二糖（有苦味）、异麦芽糖和其他低聚糖（合称复合低聚糖（有苦味）、异麦芽糖和其他低聚糖（合称复合低聚糖）。糖）。 分解反应：葡萄糖分解反应：葡萄糖羟甲基糠醛羟甲基糠醛有机酸、色素等。有机酸、色素等。 淀粉的水解反应淀粉的水解反应 1.1.淀粉水解过程淀粉水解过程 H H+ + H H+ +3 3O O 进攻糖苷键的进攻糖苷键的O O- -形成共轭酸形成共轭酸 糖苷键断裂糖苷键断裂 2.2.淀粉酸水解反应动力学淀粉酸水解反应动力学 3.3.影响酸水解的因素影响酸水解的因素 酸的种类酸的种类 主要因素主要因素 浓度浓度 水解温度水解温度葡萄糖的复合反应及其影响因素葡萄糖的复合反应及其影响因素 复合反应：在淀粉的酸糖化过程中，水解生成的葡萄糖受复合反应：在淀粉的酸糖化过程中，水解生成的葡萄糖受酸和热的影响，葡萄糖分子之间通过糖苷键相聚合，生成二糖、酸和热的影响，葡萄糖分子之间通过糖苷键相聚合，生成二糖、三糖及其他低聚糖。三糖及其他低聚糖。影响复合反应的因素：影响复合反应的因素： 1.1.淀粉浓度的影响（用淀粉浓度的影响（用DEDE值表示葡萄糖纯度）：值表示葡萄糖纯度）： 2.2.酸的影响：酸的影响：葡萄糖的分解反应及其影响因素葡萄糖的分解反应及其影响因素 葡萄糖葡萄糖 5-5-羟甲基糠醛羟甲基糠醛乙酰丙酸、蚁酸、色素物质；乙酰丙酸、蚁酸、色素物质； 影响因素：浓度、温度、影响因素：浓度、温度、pHpH值；值；第三节第三节 糖蜜前处理糖蜜前处理一、糖蜜的来源与特点一、糖蜜的来源与特点二、糖蜜前处理的方法二、糖蜜前处理的方法三、谷氨酸发酵糖蜜前处理三、谷氨酸发酵糖蜜前处理 糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达物。糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%50%75%75%。一般糖蜜分。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。 糖蜜除含糖份外，还含有较多的杂质，其中有些是有糖蜜除含糖份外，还含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。处理。不同加工方法对甘蔗糖蜜的影响不同加工方法对甘蔗糖蜜的影响糖蜜前处理的一般方法糖蜜前处理的一般方法1.1.加酸通风沉淀法（冷酸通风处理法）加酸通风沉淀法（冷酸通风处理法） 通风，沉淀，提高通风，沉淀，提高N N、O O2 2含量含量2.2.加热加酸沉淀法（热酸通风沉淀法）加热加酸沉淀法（热酸通风沉淀法） 效果比方法效果比方法1 1好，但是费时费设备，不适于大规模生产好，但是费时费设备，不适于大规模生产3.3.添加絮凝剂澄清处理法添加絮凝剂澄清处理法 澄清效果较好澄清效果较好目的：通过稀释，酸化，灭菌，澄清，使之更适于发酵目的：通过稀释，酸化，灭菌，澄清，使之更适于发酵谷氨酸发酵的糖蜜前处理谷氨酸发酵的糖蜜前处理待处理物质：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）待处理物质：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶） 生物素（发酵控制）生物素（发酵控制）处理目的：澄清处理目的：澄清脱钙脱钙脱除生物素脱除生物素糖蜜预处理方法糖蜜预处理方法活性炭处理法活性炭处理法 稀释，漂白粉，活性炭，过滤稀释，漂白粉，活性炭，过滤 原理：吸附原理：吸附树脂处理法树脂处理法 亚硝酸处理法亚硝酸处理法原理：破坏生物素原理：破坏生物素还可以采用以下三种方法脱除生物素：还可以采用以下三种方法脱除生物素：1.1.添加化学药剂处理法添加化学药剂处理法 原理：增加细胞膜对谷氨酸的渗透性原理：增加细胞膜对谷氨酸的渗透性 添加青霉素法添加青霉素法 添加表面活性剂添加表面活性剂 添加抗氧剂法添加抗氧剂法2.2.追加糖蜜法追加糖蜜法 原理：当谷氨酸酶系统成熟时过量生物素不影响发酵，可原理：当谷氨酸酶系统成熟时过量生物素不影响发酵，可在此时添加未处理的糖蜜进去继续正常生产。在此时添加未处理的糖蜜进去继续正常生产。3.3.采用营养缺陷变异株采用营养缺陷变异株 原理：诱变生物素缺陷型菌株为油酸缺陷型等，是生物素原理：诱变生物素缺陷型菌株为油酸缺陷型等，是生物素不再影响谷氨酸的积累不再影响谷氨酸的积累第四节第四节 石油代粮发酵原料石油代粮发酵原料石油代粮发酵：石油代粮发酵： 微生物利用石油化工产品，得到蛋白，氨基酸，微生物利用石油化工产品，得到蛋白，氨基酸，抗生素，酶，柠檬酸，维生素等产品。抗生素，酶，柠檬酸，维生素等产品。石油代粮发酵的特点：石油代粮发酵的特点： 不耗粮食；不耗粮食； 反应不需高温高压耐腐蚀的设备；反应不需高温高压耐腐蚀的设备； 耗氧产热，因此要求菌种耐高温；耗氧产热，因此要求菌种耐高温； 需保证产物安全无毒；需保证产物安全无毒；石油代粮发酵的原料：石油代粮发酵的原料：各种石油馏分：正烷烃，轻油，灯油等各种石油馏分：正烷烃，轻油，灯油等各种石化产品：甲醇，乙醇，醋酸（各种石化产品：甲醇，乙醇，醋酸（for for 谷氨酸、赖氨酸），乙二醇，丙二醇等谷氨酸、赖氨酸），乙二醇，丙二醇等石油酵母菌体：为维生素石油酵母菌体：为维生素B2B2和酶的生产提和酶的生产提供供C C、N N源（间接石油发酵）源（间接石油发酵）常用：醋酸，乙醇常用：醋酸，乙醇 一一、前前体体物物质质：前前体体指指某某些些化化合合物物加加入入到到发发酵酵培培养养基基中中，能能直直接接彼彼微微生生物物在在生生物物合合成成过过程程中中合合成成到到产产物物物物分分子子中中去去，而而其其自自身身的的结结构构并并没没有有多多大大变变化化，但但是是产产物物的的产产量量却却因因加加入入前体而有较大的提高。前体而有较大的提高。青霉素：分子量青霉素：分子量356苯乙酸苯乙酸:分子量分子量136第五节第五节 前体物质、促进剂前体物质、促进剂 作用作用：前体有助于提高产量和组份：前体有助于提高产量和组份 P107用量用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化 率的问题率的问题例：例：6000单位单位/ml的青霉素的青霉素G,需要多少苯乙酸需要多少苯乙酸 青霉素青霉素6000*0.6（微克）（微克）36mg/ml 苯乙酸（苯乙酸（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38%实际使用时的转化率在实际使用时的转化率在46-90%之间之间 例某厂单耗为：例某厂单耗为：0.337（kg/10亿青霉素）亿青霉素） 转化率为：转化率为：0.6/(0.337*36/13.8)=68%用法用法：前体使用时普遍采用流加的方法：前体使用时普遍采用流加的方法 前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利 苯乙酸，一般基础料中仅仅添加苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07% 前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化， 流加也有利于提高前提的转化率流加也有利于提高前提的转化率常用的前体物质常用的前体物质氨基酸氨基酸菌种菌种前体物质前体物质产率（产率（% %）丝氨酸丝氨酸色氨酸色氨酸色氨酸色氨酸蛋氨酸蛋氨酸异亮氨酸异亮氨酸异亮氨酸异亮氨酸苏氨酸苏氨酸嗜甘油棒状杆菌嗜甘油棒状杆菌异常汉孙酵母异常汉孙酵母麦角菌麦角菌脱氮极毛杆菌脱氮极毛杆菌粘质赛氏杆菌粘质赛氏杆菌阿氏棒状杆菌阿氏棒状杆菌谷氨酸小球菌谷氨酸小球菌甘氨酸甘氨酸氨茴酸氨茴酸吲哚吲哚硫代丁酸硫代丁酸- -氨基丁酸氨基丁酸D-D-苏氨酸苏氨酸高丝氨酸高丝氨酸1.61.60.80.81.31.31.11.10.80.81.51.52.02.0二、促进剂：二、促进剂：促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。 促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。面的。 有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂本身是酶的诱导物； 有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善 细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产， 也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用； 有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。促进剂作用举例促进剂作用举例发酵过程的促进剂和抑制剂发酵过程的促进剂和抑制剂抗生素抗生素被抑制的产物被抑制的产物抑制剂抑制剂链霉素链霉素去甲基链霉素去甲基链霉素四环素四环素去甲基金霉素去甲基金霉素头孢菌素头孢菌素C C利福霉素利福霉素甘露糖链霉素甘露糖链霉素链霉素链霉素金霉素金霉素金霉素金霉素头孢霉素头孢霉素N N其他利福霉素其他利福霉素甘露聚糖甘露聚糖乙硫氨酸乙硫氨酸溴化物、硫脲溴化物、硫脲硫胺化合物硫胺化合物L-L-蛋氨酸蛋氨酸巴比妥药物巴比妥药物本章小节本章小节 掌握掌握：培养基的原料；培养基的营养成分；发：培养基的原料；培养基的营养成分；发酵培养基的选择；淀粉水解糖的制备；酵培养基的选择；淀粉水解糖的制备； 难点难点：淀粉水解理论基础；谷氨酸发酵的糖蜜：淀粉水解理论基础；谷氨酸发酵的糖蜜前处理；生物合成的前体物质；发酵过程中的促进前处理；生物合成的前体物质；发酵过程中的促进剂和抑制剂；剂和抑制剂；常见培养基的配方举例营养琼脂培养基：营养琼脂培养基： 牛肉膏牛肉膏3g3g，蛋白胨，蛋白胨10g10g，NaCl5gNaCl5g，琼脂，琼脂15-20g15-20g，水水1000ml1000ml，；，；淀粉琼脂培养基（高氏淀粉琼脂培养基（高氏1 1号培养基）：号培养基）： 可溶性淀粉可溶性淀粉20g20g，KNOKNO3 31g1g，NaCl0.5gNaCl0.5g，K K2 2HPOHPO4 40.5g0.5g，FeSOFeSO4 40.01g0.01g，琼脂，琼脂20g20g，水，水1000ml1000ml，pH7.0-7.2;pH7.0-7.2;PDAPDA培养基：培养基： 马铃薯（去皮）马铃薯（去皮）200g200g，蔗糖或葡萄糖，蔗糖或葡萄糖15g15g，琼脂，琼脂15-20g15-20g，水，水1000ml;1000ml;淀粉酸解反应动力学淀粉酸解反应动力学反应速度常数反应速度常数k=k=C CA A ：催化常数，与酸的种类相关；催化常数，与酸的种类相关； C CA A ：酸的体积摩尔浓度；：酸的体积摩尔浓度； ：多糖的水解常数，其值越低，表示多：多糖的水解常数，其值越低，表示多糖越难水解；糖越难水解； ：温度对水解速度影响的常数：温度对水解速度影响的常数 EndThanks!