免疫沉淀类实验1教学对象：高等医学院校卫生检验专业学生教学对象：高等医学院校卫生检验专业学生实验课时：实验课时：6 6学时学时课程类型：专业实验课课程类型：专业实验课课程要求：必修课程要求：必修每组人数：每组人数：2 2人人2实验目的与要求掌握单向琼脂扩散试验、双向琼脂扩散试验、对流免疫电泳的原理、结果分析及应用； 熟悉火箭免疫电泳、免疫电泳的原理及应用。 3实验内容实验内容单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验对流免疫电泳对流免疫电泳示教：示教：火箭免疫电泳火箭免疫电泳免疫电泳免疫电泳4一、单向琼脂扩散试验5实验原理实验原理： 将适量的抗体均匀混入琼脂内制成琼脂板，打孔，在孔中加入一定量的待测抗原，抗原向四周呈辐射状扩散，与抗体相遇，在比例合适时形成白色沉淀环沉淀环直径的大小与抗原含量成正比，可从用不同浓度标准抗原制成的标准曲线上，查出待检样品中抗原的含量。 一、单向琼脂扩散试验一、单向琼脂扩散试验6试剂与器材试剂与器材商品IgG、IgM、IgA单向琼脂扩散板；37恒温箱、湿盒、可调微量加样器等；待检血清。方法方法分别取商品IgG、IgM、IgA单向琼脂扩散板1块，按说明书操作。用微量加样器分别准确吸取不同稀释度待测血清10mL加于孔内。将琼脂板放入湿盒中，置于37恒温箱扩散24小时。一、单向琼脂扩散试验一、单向琼脂扩散试验7注意事项：注意事项：加样量一定要精确，并且不同逸出孔外，否则结果不好观察；实际检测过程中，标准曲线必须与样品测定同时制备。一、单向琼脂扩散试验一、单向琼脂扩散试验n 结果观察结果观察分别量取各孔样品沉淀环的直径，从相应说明书提供的参考标准曲线，计算待检血清中各种免疫球蛋白的含量。8二、双向琼脂扩散试验二、双向琼脂扩散试验9n 实验原理实验原理：在含有电解质的琼脂中，抗原抗体分子互相弥漫扩散，当比例合适时可出现肉眼可见的白色沉淀线。沉淀线的形状、位置，与抗原的浓度、扩散速度相关。 二、双向琼脂扩散试验二、双向琼脂扩散试验10试剂与器材含15g/L生理盐水的琼脂糖待检血清、抗人血清载玻片、湿盒、吸管、打孔器、37恒温箱、可调微量加样器等n方法制板制板：用510mL吸管吸取溶化的含15g/L生理盐水的琼脂糖，于一洁净的载 玻片；打孔：打孔：待琼脂板凝固后，用直径3mm的打孔器打孔，每孔之间的距离约4 5mm，根据需要，可打成呈梅花状、三角状的孔；加样：加样：用可调微量加样器根据需要在不同孔内加入待检血清和抗人血清10mL；扩散：扩散：将琼脂糖凝胶板放湿盒中，置37温箱中24h后，取出观察结果。二、双向琼脂扩散试验二、双向琼脂扩散试验11注意事项：注意事项：加样量一定要精确，并且不同逸出孔外，否则结果不好观察；制板时，玻片要清洁，边缘要整齐，加琼脂糖时要避免产生气泡；打孔时注意避免产生裂缝或将琼脂与玻片脱离。二、双向琼脂扩散试验二、双向琼脂扩散试验结果观察：结果观察：沉淀线的位置、数目与形状等。图4 抗原特异性与沉淀线形状的关系a、b：抗体 A、A、B：抗原A、B完全不同 A、A部分相同12三、对流免疫电泳三、对流免疫电泳建立在双向琼脂扩散试验的基础上，通过电流，使建立在双向琼脂扩散试验的基础上，通过电流，使蛋白质抗原、抗体在电场中作定向加速度双扩散，蛋白质抗原、抗体在电场中作定向加速度双扩散，从而加速沉淀的形成。从而加速沉淀的形成。 13n 实验原理实验原理：在一定的离子强度、pH8.4以上的缓冲液中，大多数抗原解离带负电，在电场中向阳极移动，而抗体大部分是IgG，其等电点与环境中的pH接近，很少解离。另外，由于分子量大，加上电渗作用缓慢向阴极移动，在短时间内，在两孔之间或抗体另一侧形成沉淀线。 三、对流免疫电泳三、对流免疫电泳14试剂与器材试剂与器材1.5%巴比妥缓冲液琼脂糖 待检血清、抗人血清 0.05mol/L pH8.6巴比妥缓冲液 载玻片、吸管、打孔器、可调微量加样器、电泳仪、电泳槽等n方法方法制板制板：用510mL吸管吸取溶化的含15g/L生理盐水的琼脂糖，于一洁净 的载玻片；打孔：打孔：待琼脂板凝固后，用直径3mm的打孔器打孔，每孔之间的距离约 45mm，根据需要，可打成呈梅花状、三角状的孔；加样：加样：在孔中相向加入10mL抗原和抗体 ；电泳：电泳：将抗原置于阴极侧，抗体置于阴极侧， 以4V/cm电压电泳30min1h。 三、对流免疫电泳三、对流免疫电泳15结果观察：结果观察：关闭电源，打开电泳槽，观察沉淀线的位置、数目与形状等。注意事项：注意事项：加样量一定要精确，并且不同逸出孔外，否则结果不好观察；制板时，玻片要清洁，边缘要整齐，加琼脂糖时要避免产生气泡；孔距约0.5cm左右，太远看不到实验现象。三、对流免疫电泳三、对流免疫电泳16示示 教教火箭免疫电泳火箭免疫电泳 将适量的抗体均匀混入琼脂内制成琼脂板，冷凝后，在琼脂板的一端打一排小孔，分别加入一定量的待测样品进行电泳。抗原在电泳过程中，与抗体相遇，在比例合适时可形成锥形沉淀峰，其形状如火箭，故名火箭电泳。火箭峰的高度与抗原含量成正比，以峰高为纵坐标，已知的抗原浓度为横坐标，绘制标准曲线图，就可知待检样品中抗原的含量。17示示 教教免疫电泳：免疫电泳： 免疫电泳技术是利用蛋白质分子量以及其所带电荷的不同，在电场作用下，蛋白质各组分迁移速度有别的性质，将蛋白质各组分分离，然后与槽中之抗体进行双向扩散，相应的抗原、抗体形成一条沉淀弧，从而形成一系列沉淀弧。根据沉淀弧的形状和位置，可对蛋白质的不同组分进行分析研究。18