一、实验目的通过本实验让学生掌握质粒DNA双酶切的原理和操作方法1二、实验原理限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。每一种内切酶能识别DNA分子中由46个核苷酸组成的特定序列多种细菌能合成限制性内切酶，这是它们保护自己，降解外来DNA分子的重要手段。细菌细胞内的DNA由于相应序列上的A或C碱基的甲基化而不被限制性内切酶攻击，而外源DNA一旦进入细胞则立即被识别，双股DNA螺旋都被切断，这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象限制性内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶限制性内切酶按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：型、型和型2型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等 型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式：粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。 如EcoRI的识别顺序为： 5 GAA|TTC 3 3 C T T|AAG .5 |表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG，这就是回文顺序。 表示在双链上交错切割的位置，切割后生成两个DNA片段，各有一个单链末端，两条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”3平头末端：型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5 GAT|ATC 3 3 CTA|TAG 5 切割后形成两种片段，片段末端同样可以通过DNA连接酶连接起来型限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆影响限制性内切酶活性的因素：DNA的纯度DNA的甲基化程度酶切消化反应的温度DNA的分子结构溶液中离子浓度及种类缓冲液的pH值4双酶切的两种酶介绍Xho酶（TaKaRa公司） 识别序列和切割位点：EcoR酶（TaKaRa公司） 识别序列和切割位点：5三、仪器、材料与试剂水浴锅移液枪和枪头制冰机浮板R-pGEX-4T-1质粒DNAXho酶EcoR酶10H Buffer无菌水小离心管6四、实验步骤质粒DNA的双酶切反应体系：反应条件：温度37，酶切1.5h琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果紫外线投射仪观察结果UVP凝胶成像系统记录结果（电泳图）EcoR1LXho1L10H Buffer2L质粒DNA10L12L1g无菌水6L 4L总体积20L（无菌水补至总体积）7五、思考题型限制性内切酶识别序列的特点是什么？这种酶的切割有两种方式，两种切割方式分别产生怎样的末端？影响限制性内切酶活性的因素有哪些？8910