基因工程中的载体 克隆载体克隆载体具备的3个特点1、具有一个复制起点，能独立于宿主细胞进行自主复制2、含有筛选标记，便于鉴别阳性重组子3、含有一个或多个限制酶的单个酶切位点，从而使目的基因插入载体的特定位点克隆载体的种类1、质粒2、噬菌体载体3、黏粒4、噬粒5、人工染色体6、其他（动植物病毒等）克隆载体的种类1、质粒2、噬菌体载体3、黏粒4、噬粒5、人工染色体1、质粒载体复制起点来自一些天然质粒质粒的特点：质粒的特点：大小：2-200kb存在于细菌中，偶见于链霉菌和酵母独立于染色体之外进行复制和遗传,又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。比病毒还简单的亚细胞结构，一旦离开寄主细胞则无法繁殖。1、质粒载体复制起点来自一些天然质粒常用的两种质粒：PBR322质粒和PUC质粒（1）PBR322质粒概念：概念：质粒载体PBR322是研究得最多，使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。1、质粒载体复制起点来自一些天然质粒（1）PBR322质粒优点：1、质粒载体pBR322的大小为4361bp,相对分子质量较小。2、2、它带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。3、具有两种抗生素抗性基因（氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因），可供转化子的选择标记（负选择法）。4、质粒载体pBR322具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增以后，每个细胞中可累积1000-3000份拷贝，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。1、质粒载体复制起点来自一些天然质粒（2）PUC质粒（PBR322的衍生质粒）与PBR322的异同：（1）PUC质粒保持了PBR322的复制起点（2）保留了氨苄青霉素抗性基因（3）增加了大肠杆菌乳糖操纵子的启动子和LacZ基因部分区段（可产生肽）（4）新增了多克隆位点1、质粒载体复制起点来自一些天然质粒（2）PUC质粒（PBR322的衍生质粒）PUCPUC质粒通过蓝白斑实验选择重组子质粒通过蓝白斑实验选择重组子 经IPTG诱导LacZ酶催化X-gal后会使菌落变蓝，当外源基因插入目的基因多克隆位点之后，破坏了肽的功能，该产物不能与宿主LacZ的N端有缺失的产物发生互补，无LacZ酶活性，因此不能使X-gal变蓝，仍为白色菌落。克隆载体的种类1、质粒2、噬菌体载体3、黏粒4、噬粒5、人工染色体2、噬菌体载体重组DNA技术中常用的噬菌体克隆载体主要有类噬菌体和M13噬菌体构建噬菌体载体的基本原理是多余限制位点的删除，按照这一基本原理构建的噬菌体的派生载体，可以归纳成两种不同的类型：一种是插入型载体（insertionvectors），只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。插入型载体只能承受较小分子量（一般在10kb以内）的外源DNA片段的插入，广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆。另一种是替换型载体（rePlacementvectors），具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的DNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，所以适用于克隆高等真核生物的染色体DNA。2、噬菌体载体噬菌体载体和质粒载体优缺点比较：噬菌体载体和质粒载体优缺点比较：（1）噬菌体文库比质粒文库克隆容量大一倍；（2）噬菌体载体感染包装效率更高；（3）质粒DNA提取较为方便。克隆载体的种类1、质粒2、噬菌体载体3、黏粒4、噬粒5、人工染色体3、黏粒带有黏端位点(cos)的质粒黏粒是由人工构建的含有噬菌体DNA的cos序列和质粒复制子的载体。黏粒的组成包括质粒复制起点（ColE1）、氨苄青霉素抗性标记、cos位点。黏粒有4个特点：具有噬菌体的特性。黏粒在克隆了外源DNA在体外包装成噬菌体颗粒后，可以感染宿主菌并在细菌内按照噬菌体DNA的方式环化起来。但黏粒载体不含有噬菌体的全部必要基因，因此不会使宿主菌裂解，无法形成子代噬菌体颗粒。具有质粒的特性。黏粒具有质粒复制子，可在宿主菌内像质粒DNA一样进行复制。克隆外源DNA的容量大。黏粒自身相对较小，一般只有57kb，而最大的克隆片段可达45 kb左右。能与有同源序列的质粒进行重组。克隆载体的种类1、质粒2、噬菌体载体3、黏粒4、噬粒5、人工染色体4、噬粒噬粒(phagemid或phasmid)是由质粒载体和单链噬菌体载体构建成的。它们既有质粒的复制起点，又有噬菌体的复制起点。同时具有噬菌体和质粒的性质。在大肠杆菌细胞里，可以按正常的双链质粒分子进行复制，生成双链DNA；当存在辅助噬菌体的条件时，在噬菌体基因蛋白质的作用下，又可像单链噬菌体M13一样按滚环模型复制出单链DNA，并在包装成噬菌体颗粒后释放出宿主细胞。克隆载体的种类1、质粒2、噬菌体载体3、黏粒4、噬粒5、人工染色体5、人工染色体（1）细菌人工染色体（BAC） 该系统的复制子来源于大肠杆菌等F因子，在细胞内只有1-2个拷贝，质粒本身只有几kb到20kb，但可以克隆的外源DNA的长度达100300kb。（2）酵母人工染色体（YAC） 是由天然的自主复制区、端粒区、着丝粒区和外源DNA插入区构成的高级结构。YAC克隆的外源基因可由几百kb几千kb。（3）哺乳类人工染色体（MAC）可以容纳1000kb的外源DNA片段。 人类人工染色体（HAC）可以克隆多达10Mb的外源DNA片段。THANK YOU！