1. 血浆凝固酶试验结果观察（血浆凝固酶试验结果观察（2） 2. 肠道杆菌生化反应示教肠道杆菌生化反应示教3. 粪便中肠道致病菌的分离与鉴定（粪便中肠道致病菌的分离与鉴定（2）4. 肥达氏反应结果的判定及分析（肥达氏反应结果的判定及分析（2） 5. 抗酸染色法抗酸染色法6. 细菌及其他微生物形态示教细菌及其他微生物形态示教实验八实验八 主要内容主要内容 血浆凝固酶试验结果观察：将试管微微倾斜，血浆凝固酶试验结果观察：将试管微微倾斜，凡血浆呈胶冻状者为阳性，仍呈液体者为阴性。凡血浆呈胶冻状者为阳性，仍呈液体者为阴性。阳性反应阳性反应阴性反应阴性反应不凝固不凝固少量、零少量、零散凝固散凝固明显的块明显的块状凝固状凝固巨大巨大块凝块凝固固完全凝固，完全凝固，倒置不流倒置不流动动 肠道杆菌生化反应示教肠道杆菌生化反应示教1伊红美蓝培养基：除含有基础培养基的成份外，伊红美蓝培养基：除含有基础培养基的成份外，还含有还含有乳糖及指示剂乳糖及指示剂 伊红和美蓝。伊红和美蓝。大肠杆菌大肠杆菌能能分乳糖产酸，使局部分乳糖产酸，使局部pH值下降，伊红与美蓝结合成值下降，伊红与美蓝结合成一种黑色化合物，故菌落呈紫黑色或紫红色；一种黑色化合物，故菌落呈紫黑色或紫红色；肠道肠道致病杆菌致病杆菌不分解乳糖，故菌落为无色半透明。不分解乳糖，故菌落为无色半透明。 乳糖乳糖 葡萄糖葡萄糖 大肠杆菌大肠杆菌 痢疾杆菌痢疾杆菌 - + 伤寒杆菌伤寒杆菌 - + 副伤寒杆菌副伤寒杆菌 - （黄色）（黄色）酚红酚红（红色）（红色）酸酸pH6.5 碱碱pH7.42双糖铁培养基：除含有基础培养基的成份外，双糖铁培养基：除含有基础培养基的成份外，还在每还在每100ml培养基培养基中加入中加入1g乳糖、乳糖、0.1g 葡萄糖、葡萄糖、 0.5g硫酸亚铁、硫酸亚铁、0.025g 酚红、酚红、琼脂琼脂1g。 开始反应时开始反应时1824小时后小时后1824小时后小时后若细菌既能分解葡萄糖又能分解乳糖若细菌既能分解葡萄糖又能分解乳糖 全黄全黄若细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖若细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖 上红下黄上红下黄若细菌产生若细菌产生H2S可与硫酸亚铁结合可与硫酸亚铁结合 黑色硫化铁黑色硫化铁酸酸pH6.5 碱碱pH7.4（黄色）（黄色）酚红酚红（红色）（红色）（黄色）溴甲酚紫（紫色）（黄色）溴甲酚紫（紫色）酸酸pH5.2 碱碱pH6.83.五（单）糖发酵管：在蛋白胨水培养基中五（单）糖发酵管：在蛋白胨水培养基中分别加分别加入入葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖及指示剂葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖及指示剂溴甲酚紫。溴甲酚紫。若细菌分解培养基中的糖类产酸，培养若细菌分解培养基中的糖类产酸，培养基基pH值降低，溴甲紫指示剂由紫色变为黄色，如产值降低，溴甲紫指示剂由紫色变为黄色，如产气则气则小导管小导管中有气泡。中有气泡。+4.靛基质（吲哚）试验：有些细菌靛基质（吲哚）试验：有些细菌具有色氨酸酶，具有色氨酸酶，能分解培养基中蛋白胨内的色氨酸产生靛基质（吲能分解培养基中蛋白胨内的色氨酸产生靛基质（吲哚）。吲哚本身无色，当加入对二甲基氨基苯甲醛哚）。吲哚本身无色，当加入对二甲基氨基苯甲醛（靛基质试剂），（靛基质试剂），吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，形成玫瑰吲哚，为红色化合物（阳性反应）。为红色化合物（阳性反应）。 大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌（接触面呈玫瑰红）（接触面呈玫瑰红）（接触面呈玫瑰红）（接触面呈玫瑰红） 沙门菌沙门菌沙门菌沙门菌 （接触面呈黄色）（接触面呈黄色）（接触面呈黄色）（接触面呈黄色） 肠道杆菌道杆菌选择鉴别培养基培养基双糖双糖铁培养基培养基H2S试验 五糖管五糖管葡、乳、麦、甘、蔗葡、乳、麦、甘、蔗吲哚试验动力力大大肠杆菌杆菌甲型副甲型副伤寒杆菌寒杆菌乙型副乙型副伤寒杆菌寒杆菌丙型副丙型副伤寒杆菌寒杆菌伤寒杆菌寒杆菌痢疾杆菌痢疾杆菌有色菌落有色菌落无色菌落无色菌落无色菌落无色菌落无色菌落无色菌落无色菌落无色菌落无色菌落无色菌落全黄全黄上上红下黄下黄上上红下黄下黄上上红下黄下黄上上红下黄下黄上上红下黄下黄 +/ +/ / + + + +/+ +/ +/+肠道杆菌的生化反道杆菌的生化反应及及动力力+ +常见沙门菌的抗原成份常见沙门菌的抗原成份组组菌菌 名名O抗原抗原 H抗原抗原第第1相相第第2相相ABCD甲型副伤寒沙门菌甲型副伤寒沙门菌乙型副伤寒（肖氏）沙门菌乙型副伤寒（肖氏）沙门菌鼠伤寒沙门菌鼠伤寒沙门菌丙型副伤寒（希氏）沙门菌丙型副伤寒（希氏）沙门菌猪霍乱沙门菌猪霍乱沙门菌伤寒沙门菌伤寒沙门菌肠炎沙门菌肠炎沙门菌1、2、121、4、5、121、4、5、126、7、Vi6、79、12、Vi1、9、12a biecdg、m-1、21、21、51、5-抗抗e抗抗a粪便中肠道致病菌的分离与鉴定粪便中肠道致病菌的分离与鉴定标本标本 选择鉴别培养基选择鉴别培养基（伊红美蓝培养基）（伊红美蓝培养基）生化反应生化反应血清学鉴定血清学鉴定双糖铁培养基双糖铁培养基已知已知Ab检测未知检测未知Ag （玻片凝集试验）（玻片凝集试验）五糖发酵五糖发酵H2S试验试验吲哚试验吲哚试验 粪便中肠道致病菌的分离与鉴定（粪便中肠道致病菌的分离与鉴定（2）步骤与方法步骤与方法2取出伊红美蓝培养基，观察菌落的颜色、大小、取出伊红美蓝培养基，观察菌落的颜色、大小、透明度。如若检查沙门氏菌或志贺氏菌，应在鉴别透明度。如若检查沙门氏菌或志贺氏菌，应在鉴别培养基上选取乳糖不发酵的培养基上选取乳糖不发酵的无色菌落；无色菌落；如检查致病如检查致病性大肠杆菌，则应选取发酵乳糖的有色菌落接种于性大肠杆菌，则应选取发酵乳糖的有色菌落接种于双糖铁培养基中。双糖铁培养基中。 双糖铁培养基的接种方法双糖铁培养基的接种方法 用用接种针挑取接种针挑取待检菌的菌落，由培养基表面中待检菌的菌落，由培养基表面中央直刺至到距管底央直刺至到距管底35mm止。再从原路退回，在斜止。再从原路退回，在斜面自下而上划线，置面自下而上划线，置37孵育孵育1824h，观察结果。，观察结果。 肥达氏反应肥达氏反应【结果判定结果判定】1.观察前切忽摇动试管，观察前切忽摇动试管，以免凝集分散。以免凝集分散。2.先观察先观察对照管，正确结果应无凝集现象；对照管，正确结果应无凝集现象；再观察再观察各试验管的凝集现象，凝集程度以各试验管的凝集现象，凝集程度以“+”多少表示。多少表示。：细菌完全凝集，成厚膜状铺于管底，边缘呈锯齿状。：细菌完全凝集，成厚膜状铺于管底，边缘呈锯齿状。 ：细菌呈薄层贴于管底，边缘不整齐。：细菌呈薄层贴于管底，边缘不整齐。 ：细菌在管底的中央呈小圆盘状，边缘凝集呈颗粒状。：细菌在管底的中央呈小圆盘状，边缘凝集呈颗粒状。 ：细菌呈较大的圆盘状沉淀，边缘凝集颗粒很少。：细菌呈较大的圆盘状沉淀，边缘凝集颗粒很少。 ：无凝集，细菌沉于管底呈圆点状，边缘整齐。：无凝集，细菌沉于管底呈圆点状，边缘整齐。【结果判定结果判定】 肥达氏反应肥达氏反应【效价判定效价判定】 以能出现以能出现“+”凝集现象的血清最高稀释度凝集现象的血清最高稀释度为该血清的凝集效价。为该血清的凝集效价。 【正常人群抗体水平参考值正常人群抗体水平参考值】 伤寒杆菌凝集价伤寒杆菌凝集价O1 : 80，H1 : 160。 副伤寒杆菌凝集价副伤寒杆菌凝集价A1 : 80，B1 : 80，说明，说明可能有沙门菌感染。在此基础上，伤寒杆菌可能有沙门菌感染。在此基础上，伤寒杆菌H凝凝集价高于集价高于1 : 160时可判断伤寒沙门菌感染；甲、时可判断伤寒沙门菌感染；甲、乙型副伤寒杆菌乙型副伤寒杆菌H凝集价凝集价1 : 80才有诊断意义。才有诊断意义。 2. 动态观察：动态观察：在疾病早期及中后期分别采集两次血在疾病早期及中后期分别采集两次血清，若第二份血清比第一份的效价增高清，若第二份血清比第一份的效价增高 4 倍以上倍以上具有诊断价值。具有诊断价值。肥达氏反应肥达氏反应 分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，主要分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，主要是分枝菌酸，它包围在肽聚糖的外面，所以分枝是分枝菌酸，它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过杆菌一般不易着色，要经过加热加热和和延长染色时间延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色（结合后，就很难被酸性脱色剂脱色（3%3%盐酸酒精）盐酸酒精），故名抗酸染色。，故名抗酸染色。抗酸染色法抗酸染色法 方 法石炭酸复红（初染）石炭酸复红（初染）盐酸酒精脱色盐酸酒精脱色碱性美兰（复染）碱性美兰（复染）1min加热至冒蒸汽加热至冒蒸汽 5min5min涂片、干燥、固定涂片、干燥、固定 抗酸染色法抗酸染色法步骤与方法步骤与方法1.用接种环取用接种环取 23 环环卡介苗卡介苗与与白色葡萄球菌白色葡萄球菌混合混合液制作涂片一张，干燥后火焰加热固定。液制作涂片一张，干燥后火焰加热固定。2.初染：初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红 23 滴，在火焰高处滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸出现蒸汽即暂时离开。若染液蒸发减少，应再加染液，汽即暂时离开。若染液蒸发减少，应再加染液，以以免干涸，加热免干涸，加热5分钟，分钟，待标本冷却后用水冲洗。待标本冷却后用水冲洗。 抗酸染色法抗酸染色法步骤与方法步骤与方法3. 脱色：脱色： 用用3%盐酸酒清脱色，盐酸酒清脱色，脱色时轻轻摇晃玻脱色时轻轻摇晃玻片，片，直至无颜色脱下为止（直至无颜色脱下为止（约约 0.51分钟分钟），水洗。），水洗。4. 用碱性美兰溶液复染用碱性美兰溶液复染1分钟，水洗。分钟，水洗。5. 用吸水纸吸干，油镜镜检。用吸水纸吸干，油镜镜检。结果结果 结核杆菌呈红色，常堆积成团，排列无序，结核杆菌呈红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝状生长。偶呈分枝状生长。 背景及非抗酸性细菌呈蓝色。背景及非抗酸性细菌呈蓝色。细菌及其他微生物形态示教细菌及其他微生物形态示教结核杆菌结核杆菌细菌及其他微生物形态示教细菌及其他微生物形态示教肉毒杆菌肉毒杆菌炭疽杆菌炭疽杆菌钩端螺旋体钩端螺旋体细菌及其他微生物形态示教细菌及其他微生物形态示教放线菌放线菌青霉菌青霉菌细菌及其他微生物形态示教细菌及其他微生物形态示教白色念珠菌白色念珠菌