第五章动植物细胞培养动力学51动植物细胞培养的特性动植物细胞培养技术是一项将动植物组织、器官或细胞在适当的培养基中进行离体培养的技术。组织是指由结构和功能相似的细胞和细胞间质组成，具有一定形态和生理功能的聚集体。器官是指机体中具有特殊结构和完成特殊功能的分化部分。组织与器官的培养是指在人工条件下，使它们得以继续生存或发展的一种培养方法。根据培养对象的不同，细胞培养分为动物细胞培养与植物细胞培养两类，下面介绍这两类细胞培养的基本特征。511 动物细胞培养的特性动物细胞培养的特性 由由于于动动物物细细胞胞体体外外培培养养具具有有明明显显的的表表达达产产物物的的优优点点，为为传传统统微微生生物物发发酵酵所所无无法法取取代代，因因此此，生生物物技技术术中中许许多多有有价价值值的的生生物物制制品品，需需要要借借助助于于动动物物细细胞胞培培养养而而获获得得，这这种种需需求求极极大大地地促促进进了了动动物物细细胞胞培养技术的发展。培养技术的发展。 早早在在1907年年，美美国国的的Harrison在在世世界界上上首首次次将将蛙蛙的的神神经经组组织织在在试试管管内内培培养养成成功功，建建立立起起动动物物组组织织体外培养的第一块基石。体外培养的第一块基石。1950年年前前后后，Enders及及其其同同事事发发表表了了第第一一篇篇关关于于在在培培养养细细胞胞中中生生长长病病毒毒的的报报告告，开开拓拓了了以以动动物物病病毒毒为为研研究究对对象象的的新新领领域域。当当时时人人们们已已知知道道在在细细胞胞培培养养物物中中存存在在一一些些有有特特殊殊功功能能的的蛋蛋白白质质，如如干干扰扰素素、抗抗生生素素、疫疫苗苗等等，但但是是由由于于动动物物细细胞胞的的营营养养要要求求复复杂杂，培培养养要要求求严严格格，长长期期以以来来未未能能利利用用细细胞培养来进行有经济价值的物质的生产。胞培养来进行有经济价值的物质的生产。作为大规模细胞培养，作为大规模细胞培养，Copsik等成功地等成功地进行了有关仓鼠肾细胞进行了有关仓鼠肾细胞(BHK)的悬浮培养。的悬浮培养。随后，细胞培养的原理与方法日随后，细胞培养的原理与方法日臻完善。臻完善。采采用用在在培培养养液液中中添添加加人人工工合合成成的的小小球球状状惰惰性性聚聚合合体体载载体体，大大幅幅度度提提高高了了细细胞胞的的产产量量，并并在在10 10 000000L L发发酵酵罐罐内内成成功功地地进进行行深层培养。深层培养。 随着基因工程技术的发展，人们逐渐认识到有许多基因产物随着基因工程技术的发展，人们逐渐认识到有许多基因产物不能在原核细胞内表达，它们需要经过真核细胞所特有的不能在原核细胞内表达，它们需要经过真核细胞所特有的翻译后修饰，以及正确的切割、折叠后，才能形成与自然翻译后修饰，以及正确的切割、折叠后，才能形成与自然分子一样的功能和抗原性，使得动物细胞一跃成为一种重分子一样的功能和抗原性，使得动物细胞一跃成为一种重要的宿主细胞，用以生成多种生物制品，如病毒疫苗、淋要的宿主细胞，用以生成多种生物制品，如病毒疫苗、淋巴因子巴因子( (如如r r干扰素等干扰素等) )、单克隆体、红细胞生成素、纤维蛋、单克隆体、红细胞生成素、纤维蛋白溶酶原激活剂、第八因子、肿瘤坏死因子、上皮生长因白溶酶原激活剂、第八因子、肿瘤坏死因子、上皮生长因子和过氧化物歧化酶等。采用大规模细胞培养技术生产贵子和过氧化物歧化酶等。采用大规模细胞培养技术生产贵重药品在临床诊断、治疗和预防等方面都有重要意义。重药品在临床诊断、治疗和预防等方面都有重要意义。动物细胞培养与微生物培养对比有许多不同点(表51)。主要是动物细胞无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差；生长速度缓慢，易受微生物污染，培养时需要抗生素，且大多数哺乳动物的细胞需附着在固体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格；大规模培养时，不可简单地套用微生物培养的经验等。 大大规规模模细细胞胞培培养养的的主主要要危危险险之之一一是是微微生生物物污污染染。设设备备、培培养养基基、悬悬浮浮系系统统和和操操作作方方法法等等的的复复杂杂性性都都易易引引起起微微生生物物污污染染，这这是是细细胞胞培培养养都都存存在在的的一一个个普普遍遍问问题题，在在大大规规模模培培养养中中更更为为严严重重。动动物物细细胞胞生生长长十十分分缓缓慢慢，并并易易被被大大多多数数微微生生物物污污染染物物所所破破坏坏。支支原原体体(mycoplasma)对对动动物物细细胞胞培培养养的的威威胁胁最最大大，因因为为其其感感染染力力强强且且不不易易检检出出。因因此此，大大规规模模细细胞胞培培养养成成功功的的必必要要条条件件是是要要有有一一个个设设备备精精良良的的细细胞胞库库(cell bank)。在在细细胞库中的冷冻细胞不受污染。胞库中的冷冻细胞不受污染。 由于动物细胞无细胞壁，因此人们一般认为细胞的脆性是导致培养控制(如溶氧)复杂化的关键。然而，选择坚韧的细胞，就不存在上述问题。经仔细设计的培养装置可使细胞悬浮液很好混合，在向培养基内流加基质和输送气体时也不会损坏细胞。动物细胞培养基的配方十分复杂，并且还需补充血清和蛋白胨。原料的质量控制和培养基的生产是大规模细胞培养的主要问题。因为血清来源困难，质量不稳定，残留血清给产物提纯带来困难等，所以，常采用无血清培养基。但是，在无血清培养基中更可能出现细胞毒(与水中的微量元素或有机污染有关)。因此，与培养物相接触的水必须采用高纯度的水。高纯度水的腐蚀性很强，并且有从金属物沥出元素的能力，所以，凡是与纯水接触的不锈钢容器和管道的表面都必须进行适当处理。培养基一般需经膜过滤器过滤。常用的膜过滤器可保证其无菌状态，甚至支原体也可被01um的过滤膜滤出。目前，利用动物细胞培养的方法生产的有用产品大致可分为4大类：疫苗；干扰素；单克隆抗体；遗传重组产品。总之，动物细胞培养过程的特征是：(1)生长速率慢，易被微生物污染，但可采用在培养基中加入抗生素等措施来解决。(2)细胞个体大且无壁，对环境敏感，因此应慎重解决供氧(搅拌与通风)与细胞脆弱的矛盾。(3)设备放大是一新课题，不能完全按照微生物反应过程的经验。(4)反应过程成本高，主要用于高附加值产物的生产。51.2植物细胞培养的特性有关植物细胞培养的基础研究很多，而工业规模应用却较少。早在1902年，出生于奥地利的德国植物学家巳Haberlandt就预言植物细胞培养的可能性。1937年前后，法国和美国科学家分别成功地进行了胡萝卜和烟草的组织培养。随后，人们认识到生长素等植物激素在组织培养中的作用。1966年Klein指出，能利用植物细胞培养物代替栽培植株来生产生化制品。近40年来，植物细胞培养研究成功的例子已有不少，如用紫草悬浮培养物生产紫草宁，烟草细胞的大量培养等。与微生物相比，植物细胞具有这样一些特性(表41)：细胞个大，并且细胞壁是以纤维素为主要成分，耐拉不耐扭，因此，抗剪切能力低。与动物细胞培养类同，生长速率慢，为防止培养过程中染菌，需加抗生素。细胞培养需氧，而培养液黏度大，且不能强力通风搅拌。产物在细胞内且产量低。培养的植物细胞常生长成各种大小的团块(从几个细胞到几百个细胞)，增加了悬浮培养的难度等。生长缓慢等是植物细胞的先天不足，然而它能产生一些微生物所不能合成的特有代谢产物，如朝鲜参皂角苷、桉树油和某些生物碱等。植物细胞培养技术为大规模生产这些有用物质提供了新途径。细胞培养用于试管苗生产，如兰花等名贵花卉的培育，可以不受环境的影响。利用植物细胞培养技术进行工业化生产，有产品规格好；易达到供需平衡；生产占地少等优点。进入20世纪90年代以来，伴随着紫杉醇的研究成功并应用于临床，植物细胞培养及其次级代谢产物的研究进入了新的发展时期，尤其是诱导子、前体饲喂、两相法培养、质体转化、毛状根和冠瘿瘤组织培养等新技术和新方法的发现和发展，更显示了植物细胞培养工程在制药领域的广阔发展前景。另外，将固定化技术应用于植物细胞培养中的研究对有效改善植物细胞培养中出现的不足有一定成效。可以认为，固定化技术有可能在植物细胞培养中得以应用。52生长模型与培养条件521动植物细胞的生长模型微生物的生长是多种环境因子与细胞内复杂的代谢反应的综合结果，生长与环境因子的关系目前还难以用简单的方程式来表达。同理，动植物细胞生长是细胞与影响细胞生长的环境因子相互作用的综合结果，并且其研究还处于萌芽阶段。5211碳源与生长模型微生物反应中，细胞的生长速率与限制性基质间的关系常用Monod方程来描述。同理，Monod方程也可以用于表达某些碳源与动植物细胞生长速率间的关系。例如，在植物细胞培养过程中，多以蔗糖为碳源，据安田报道，烟草细胞在分批培养中，细胞的生长速率与蔗糖浓度的关系可利用Monod方程来表达，此时umax0023h-1，Ks235g/L。蔗糖为碳源时，植物细胞首先分解蔗糖为葡萄糖和果糖，然后优先利用葡萄糖。分别以果糖或葡萄糖为碳源分批培养烟草细胞时，前者有umax0038h-1 ，Ks=025gL，后者为umax=0038h-1，Ks094gL。5212呼吸与生长模型由于动植物细胞的培养过程是好氧过程，因此，许多科技工作者研究了与细胞呼吸速率相关的因素。例如，人参细胞培养中，添加椰子汁后细胞的生长速率加快，耗氧量比不添加椰子汁时明显增大。另 外 ， 也 有 报 道 ， AcerPsedoplatanusL细胞培养中，细胞体内的含氮量与耗氧量有正比关系。一般好氧微生物的比生长速率u与菌体的维持常数m及氧的比消耗速率Qo2有如下关系：据加藤等所获得的烟草细胞分批培养的结果表明，当氧为细胞生长的限制性因素时,u与Q02有与(51)式相似的关系。这说明，植物细胞培养中氧的消耗，部分用于维持代谢，部分用于生长繁殖，所获得的m009mmol(gh)，Y0061gmmol，与一般微生物的m和Y值相比，m很小而Y较大。这可能是植物细胞培养过程中的重要特性。5213胞内物质与生长模型微生物培养中，把细胞内RNA含量作为描述其生长速率的指标，且随微生物比生长速率的增加，RNA含量增大。植物细胞培养中，也有类似的报道。吉田等在进行人参细胞培养中发现，在对数生长期，细胞的RNA含量显著增大。培养烟草细胞时，人们详细研究了细胞的比生长速率与细胞内RNA的关系，发现其与一般微生物相似，可以用一次方程表达，即综上所述，动植物细胞生长动力学的研究，在很大程度上是借鉴了微生物反应动力学理论。从已有的实例看，又多属于定性探讨。522 动植物细胞的培养操作动植物细胞的培养操作 5221植物细胞的培养操作植物细胞的培养方式根据植物细胞所处状态的不同，分为悬浮培养法与固定化植物细胞培养法，根据操作方式的不同，又分为分批式、反复分批式和连续式培养3种。下面以悬浮培养法(分批、反复分批和连续培养)为例进行介绍。(1)分批培养植物细胞的分批培养与微生物的分批培养类同。由于操作简单，从实验室到大型罐广泛应用。分批培养中，植物细胞的生长曲线一般呈s形，可明显观察出诱导期、对数生长期、减速期、静止期和衰亡期(死亡期)，但是与细菌和酵母菌的培养相比，即使是生长速率快的烟草细胞，分批培养时间(一个周期)也要6d以上，这也就是前面所说的植物细胞培养的先天不足生长缓慢。表52表示某些植物细胞分批培养中对数生长期的u与微生物的比较。即使已知生长较快的烟草细胞的平均世代时间也要158h(u0.044h-1)，不到酵母比生长速率的l10。因此，有必要开发长期无菌培养技术。目前，无论在实验室还是在工厂中，大至20t罐，广泛采用分批式操作。藤田开发的二步培养法是分批培养法的一种变形，同时使用两个反应器，第一个反应器主要是为大量培养细胞，第二个反应器是为增加目的产物的含量。分批培养中，在一定范围内增加底物浓度，可增加目的产物的产量，但浓度过高又会造成接种细胞的死亡。(2)反复式分批培养若反应器内培养液体积为V，补加量为F(等于取出量)，则比值FV称为替换率D。D与连续培养中的稀释率D不同，其与培养液取出至加入完成期间的比生长速率u有如下关系：(3)连续培养由于连续培养可以保证细胞生长环境长时间的稳定，因此，在研究细胞的生理或代谢等方面时，连续培养是一种重要的培养方法。与微生物的连续培养相同，对于单罐连续培养系统，与细胞生长相关的物料衡算式为：一般连续培养的细胞产率高于分批培养的，但由于植物细胞生长速率慢，维持长时间的无菌状态是需要解决的基本技术问题。另外，单罐连续培养法并不能适应各种反应，因此，有必要开发一些新的方法。5222动物细胞培养方法动物细胞培养方法有两种类型，一类是非贴壁依赖性细胞的培养，来源于血液、淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞(包括杂交瘤细胞)和某些转化细胞属于这一类型，其可采用类似微生物培养的方法进行悬浮培养。另一类是贴壁依赖性细胞的培养，大多数动物细胞，包括非淋巴组织的细胞和许多异倍体体系的细胞属于这一类型，它们需要附着于适量正电荷的固体或半固体的表面生长。能够进行悬浮培养的动物细胞是一类能无限繁殖的细胞，这样的细胞又称为确立细胞株。由于动物细胞对剪切力的敏感，丰富培养基容易形成过多泡沫，这都增加了反应器操作的难度。悬浮培养多采用分批式操作方法，其原理与植物细胞的类同。另外，适用于动物细胞的还有一种连续式操作方法灌流培养法。这种方法是把细胞置于某种封闭系统中，连续注入新鲜培养基的同时，连续等量排出用过的培养基，但不排出悬浮的细胞。采用这种方法后，从产物开始分泌时起，便可用快速纯化方法不断地从流出培养基中收集目的产物。虽然灌流培养系统具有以上优点，但也存在培养基消耗量比一般悬浮培养高几倍，工作过程复杂，培养物易受污染和培养细胞不稳定等缺点。灌流培养系统可分为3类：微小均质系统，如灌流悬浮细胞培养，微载体系统；巨大均质系统，如把细胞包埋在微小球或凝胶中；非均质系统，如边灌流边用过滤膜将细胞加以固定。上述灌流培养方法属于微小均质系统中的灌流悬浮细胞培养。大多数动物细胞需附着在固体或半固体表面生长，生长的细胞最终扩展成一单层，所以这种贴壁依赖培养有时又称为单层培养。动物细胞能否在载体表面附着生长以达到扩展成一单层的目的，取决于细胞的特性、载体的理化性质及培养基成分。例如，琼脂糖是一种天然材质，如果注意控制熔融后的冷却速率，使凝胶缓慢生成，则琼脂糖链形成纤维状结构。这种结构的琼脂糖能支持细胞在其表面上附着生长。相反，冷却迅速的琼脂凝胶不能支持细胞在其表面附着生长。从操作方式看，贴壁依赖性细胞的培养可采用分批、半连续和连续等多种方法，其原理与植物细胞培养的类同。从目前实用的角度看，主要采用中空纤维培养系统和微载体培养系统。其操作方式多采用灌流式操作，前者属于非均质灌流培养系统，而后者则属于微小均质的灌流培养系统。复习题1简述动、植物细胞培养的特点与难点，并与微生物细胞培养相比较。2植物细胞培养的基本技术包括哪几方面内容?3影响植物次生代谢产物积累的因素有哪些?4试比较植物细胞培养中采用不同生物反应器系统的优缺点。