第十五章第十五章 核酸的研究方法核酸的研究方法1、核酸的分离、提纯和定量测定、核酸的分离、提纯和定量测定DNA的分离RNA的分离核酸的定量Isolation of Nucleic AcidsGoals:removal of proteinsDNA vs RNAisolation of a specific type of nucleic acidTypes of Methods:differential solubilityadsorption methodsdensity gradient centrifugationTypes of DNA:genomic (chromosomal)organellar (satellite)plasmid (extra-chromosomal)phage/viral (ds or ss)complementary (mRNA)General Features:denaturing cell lysis (SDS, alkali, boiling, chaotropic) enzyme treatmentsproteaseRNase (DNase-free)DNase (RNase-free)Collection of cellsUse soft brushes to dislodge epithelial cells lining the mouth. Ample cell collection is very critical for success.Whats in Lysis Buffer?Tris buffer to maintain pH of solution so that DNA is stableSDS to dissolve membranes of cell, allowing DNA to be released into solutionSDS also denatures proteins, making them more susceptible to protease cleavageLysis bufferOSOOO-SDSCH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3-Why add Protease?Protease destroys nuclear proteins that bind DNA, and cytoplasmic enzymes that breakdown and destroy DNA (nucleases)Protease treatment increases the yield of DNA Adding salt (5M NaCl)Na+ binds to phosphate groups of DNA, neutralizing the electric charge of DNANaCl allows DNA molecules aggregate instead of repelling each other, making it easier for DNA to precipitate out of solution when alcohol is addedAdding ice cold alcoholDNA cannot dissolve in alcoholThe addition of cold alcohol makes the DNA clump together and precipitate out of solutionPrecipitated DNA molecules appear as long pieces of fluffy, stringy, web-like strandsMicroscopic oxygen bubbles “aggregate” or “fuse” together, simultaneously with the DNA precipitationThe larger, visible air bubbles act to “lift” the DNA out of solution, from the aqueous into the organic phaseDNA PrecipitationHigh MW Genomic DNA IsolationTypical Procedure1Cell Lysis0.5% SDS + proteinase K (55o several hours)2Phenol Extractiongentle rocking several hours3Ethanol Precipitation4RNAse followed by proteinase K5Repeat phenol extrac-tion and EtOH pptPhenol Extractionmix sample with equal volume of sat. phenol solnretain aqueous phaseoptional chloroform/isoamyl alcohol extraction(s) aqueous phase (nucleic acids) phenol phase (proteins)High MW Genomic DNA IsolationTypical Procedure1Cell Lysis0.5% SDS + proteinase K (55o several hours)2Phenol Extractiongentle rocking several hours3Ethanol Precipitation4RNAse followed by proteinase K5Repeat Phenol Extrac-tion and EtOH pptEtOH Precipitation2-2.5 volumes EtOH, -20ohigh salt, pH 5-5.5centrifuge or spool outIsolation of RNASpecial ConsiderationsRNAse inhibitors!extraction in guanidine saltsphenol extractions at pH 5-6 (pH 8 for DNA)treatment with RNase-free DNaseselective precipitation of high MW forms (rRNA, mRNA) with LiCloligo-dT column2 2、核酸的沉降特性、核酸的沉降特性 通常很难分离出完整DNA分子，但可得到分子量不太大的环状DNA，这类制剂包括：共价闭环DNA：常呈超螺旋型开环DNA：双链环状DNA的一条链断裂，分子呈松弛态线型DNA：环状DNA的双链断开 在超速离心机造成的离心力场中，溶液中的核酸下沉在超速离心机造成的离心力场中，溶液中的核酸下沉的速率会大大加快，这是核酸的沉降特性，该技术可的速率会大大加快，这是核酸的沉降特性，该技术可研究：研究： 核酸在溶液中的构象核酸在溶液中的构象 测定核酸的沉降系数和相对分子量测定核酸的沉降系数和相对分子量氯化铯密度梯度沉降平衡超离心法核酸密度测定测定DNA中G-C之含量溶液中核酸构象的研究用于核酸的制备Density Gradient Centrifugationrate zonal/sucrose (size fractionation)electrophoresis more commonisopycnic/CsCl (density)DNA 1.7 g/cm3protein 1.3 g/cm3RNA DNAssDNA dsDNAGC content20406080% GC base pairs1.681.701.721.74density (g/cm3)CsCl GradientsApplicationslarge scale preparationshigh puritysatellite DNARNA cushionsCsCl Gradients三、核酸的凝胶电泳三、核酸的凝胶电泳凝胶电泳兼有分子筛和电泳的双重效果凝胶电泳兼有分子筛和电泳的双重效果不纯核酸样品：不纯核酸样品：琼脂糖凝胶电泳分离出区带琼脂糖凝胶电泳分离出区带溴化乙锭染色溴化乙锭染色紫外灯下粗略估计含量紫外灯下粗略估计含量电泳迁移率取决于：电泳迁移率取决于：核酸分子大小胶浓度DNA的构象电流碱基组成温度凝胶电泳的样品可进行回收聚丙烯酰胺作为支持物孔径小于丙烯酰胺可分析小于1000bp的DNA片断聚丙烯酰胺凝胶电泳4 4、核酸的核苷酸序列测定、核酸的核苷酸序列测定DNA一级结构的测定Sanger发明的末端终止法M. Maxam和W. Gilbert 发明的化学断裂法焦磷酸测序 。 前两种方法一般都会用放射性32P对DNA进行标记，需要使用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法对长度不同的核酸片段进行分离，分离以后还需要使用放射自显影的技术进行观察和分析。目前已普遍使用荧光物质代替放射性同位素对DNA进行标记。焦磷酸测序是新一代DNA序列分析技术，该项技术无需电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。末端终止法末端终止法也叫双脱氧法。要想理解此方法的原理，需要对DNA复制的过程有所了解。DNA是一种双螺旋分子，其复制是在DNA聚合酶催化下，以原来的两条母链上的核苷酸序列为模板，通过互补配对的方式合成新DNA链的过程。复制需要引物和四种dNTPs，总是从5-端向3-端进行。细胞内DNA复制的引物一般是RNA，但体外DNA复制的引物可以是人工合成的与模板链互补的一段寡聚脱氧核苷酸。复制开始于引物3-端自由的羟基，依据碱基互补配对的原则，不断地形成新的3,5-磷酸二酯键，使DNA链得到延伸，直到一个新的DNA分子完全被合成。末端终止法?进行四组平行反应?每一组反应混合物含有dATP, dGTP, dCTP和dTTP，有一种被32P标记?每一组反应含有一种少量的ddATP或ddGTP或ddCTP或ddTTP。?在多数情况下，聚合酶使用正常的核苷酸，DNA合成正常延伸。?有时，聚合酶使用ddNTP，而导致末端终止。?每一组反应中ddNTP的随机插入留下一系列长度不等的以该双脱氧核苷酸结尾的DNA链。?对每一组反应混合物走凝胶电泳。?片段越短，走的越快，就越靠近凝胶的底部。?从凝胶的底部向上读出序列。?将读出的序列转化成互补链的序列。化学断裂法其基本原理是用特殊的化学试剂，处理待测的具有末端放射性同位素（32P）标记的单链DNA或者只有一条链的末端被放射性同位素标记的双链DNA片段，造成特定碱基的修饰、脱落和戊糖-磷酸骨架被特异性切割，从而产生一组长度不同的DNA链降解产物，经聚丙烯凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。化学断裂法进行四组平行的反应：G特异性剪切 在碱性条件下，先用硫酸二甲酯（ DMS ）处理，然后再使用哌啶处理。嘌呤碱基特异性剪切DNA先进行酸处理，然后再加DMS。嘧啶碱基特异性剪切先用肼处理，然后用哌啶处理。C特异性剪切在高盐浓度下，先用肼处理，然后用哌啶处理。即进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影。比较G、AG、CT和C各个泳道，自下而上从自显影片上就可读出DNA序列。焦磷酸测序焦磷酸测序需要在同一反应体系中发生由4种特异性酶催化的级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链的3-端并释放出等量的焦磷酸基团（PPi）。PPi可转化为可见光信号，并最终转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。第一轮反应结束后，再加入下一种dNTP，继续下一轮DNA链的合成。DNA自自动分析分析仪的的组成成RNA一级结构的测定目前用来测定RNA一级结构的方法主要有：（1）先使用逆转录酶将待测RNA逆转录成cDNA，然后再使用Sanger的末端终止法进行测定；（2）用化学或/和酶学方法对放射性同位素标记的RNA进行部分消化后，再进行聚丙烯酰胺电泳分析；（3）质谱法DNA Sequencing Analysis Sanger dideoxynucleotide chain termination analysis Procedure for the Sanger dideoxy chain termination technique DNA to be sequenced is cloned into a vector, adjacent to a primer site Four reactions are set up - each containing one of four ddNTPs DNA is synthesized in the presence of the ddNTPs, giving rise to sets of DNA products representing all of the possible size fragments for the unknown sequence The fragments are resolved by gel electrophoresis and the sequenceis read up from the bottom of the gel by identifying the lane givingthe next larger size fragment DNA to be sequenced is cloned into the EcoRI site immediately adjacent to the primer binding siteEcoRISal I gene for ampicillinresistancegene for tetracycline resistancePst Ioriprimer binding sitepBR32253|3 For sequencing the DNA is denatured into single strands the primer is hybridized to the template strand DNA is synthesized using DNA polymerase structure of a dNTP structure of a ddNTP (dideoxynucleotide)OBASE (A, T, G, C)HOOPOPOPCOOOO-O-O-O-OHOOOOBASE (A, T, G, C)OPOPOPCO-O-O-O-OH53|ddATPDNAdNTPsddTTPDNAdNTPsddGTPDNAdNTPsddCTPDNAdNTPsA T C A T G T C A T C A A G T C T A G C A C T AT A G T AT A G T A C AT A G T A C A G T AT A G T A C A G T A G T T C AT A G T A C A G T A G T T C A G A All possible products of the reactioncontaining ddATP Each fragment is terminated by a ddA53|A T C A T G T C A T C A A G T C T A G C A C ATGCTAGTACAGTAGTTCAGATCGTG Longer fragmentsShorter fragmentsSequenceof thestrandthat wassynthesized5 5、聚合酶链式反应、聚合酶链式反应PCRPCR（Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction）即聚合即聚合酶链式反应，是指在酶链式反应，是指在DNADNA聚合酶催化下，以母聚合酶催化下，以母链链DNADNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板链模板DNADNA互补的子链互补的子链DNADNA的过程。是一项的过程。是一项DNADNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的增任何目的DNADNA。可用于基因分离克隆，序列可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。多方面。PCR技术的基本原理PCR反应成分：1.模板DNA；2.引物；3.四种脱氧核糖核苷酸；4.DNA聚合酶；5.反应缓冲液、Mg2+等。PCR反应基本步骤：1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（94，30s）。2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55，30s）。3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（7072，3060s）5GGATCTAGCGTATGCTTGAAA33CCTAGATCGCATACGAACTTT5模板DNA3 GAACTTT 5引物15GGATCTA 3引物2图1 PCR引物与模板结合示意图1.变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程。2.退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子。3.延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、 Mg2+存在下，DNA聚合酶催化引物按53方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。 以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。模板DNA55退火70延伸2530 次循环目的片段扩增2n倍94变性PCR原理示意图PCR反应产物积累规律示意图平台期产物量时间6、DNA的化学合成寡核苷酸的化学合成起步于寡核苷酸的化学合成起步于2020世纪四十年代末世纪四十年代末 19551955年，剑桥大学的年，剑桥大学的ToddTodd实验室成功合成了具有磷酸二酯键实验室成功合成了具有磷酸二酯键结构的结构的TpTTpT, ,并获得并获得19571957年诺贝尔奖年诺贝尔奖 19651965年，年，KhoranaKhorana等利用化学方法大量合成脱氧核苷的单一等利用化学方法大量合成脱氧核苷的单一聚合物或二种、三种脱氧核苷的重复序列，人工合成的六十聚合物或二种、三种脱氧核苷的重复序列，人工合成的六十四种核糖三糖苷，研究蛋白质的生物合成过程，从而确定了四种核糖三糖苷，研究蛋白质的生物合成过程，从而确定了氨基酸的三联密码子，因此而获得氨基酸的三联密码子，因此而获得19681968年诺贝尔奖年诺贝尔奖 六十至七十年代，寡核苷酸的化学合成方法不断完善，逐渐六十至七十年代，寡核苷酸的化学合成方法不断完善，逐渐形成了今天被广泛应用的固相亚磷酸三酯法并实现了合成的形成了今天被广泛应用的固相亚磷酸三酯法并实现了合成的自动化自动化 固相合成寡核苷酸Routine processMicroprocessor-controlled instrumentSynthesis on a solid supportFirst base(3) attached to solid supportSynthesis direction is 35DNADNA的合成有磷酸三酯法、亚磷酰胺法、氢磷酸法的合成有磷酸三酯法、亚磷酰胺法、氢磷酸法等，现在常用的是固相等，现在常用的是固相亚磷酰胺法亚磷酰胺法 合成时所用单体不是脱氧核苷三磷酸，而是核苷合成时所用单体不是脱氧核苷三磷酸，而是核苷酸的亚磷酰胺衍生物酸的亚磷酰胺衍生物二甲氧基三苯甲基（二甲氧基三苯甲基（DMTDMT） 经过化学修饰的核苷酸33位位P P上二异丙胺基，缩合所用的功能基上二异丙胺基，缩合所用的功能基33位位P P上腈乙基，保护基，合成完毕后脱去。上腈乙基，保护基，合成完毕后脱去。 5-DMT5-DMT，保护基，缩合前脱去。保护基，缩合前脱去。A A和和C C的杂环氨基上的苯甲酸保护基，合成完毕的杂环氨基上的苯甲酸保护基，合成完毕后脱去。后脱去。G G上上嘌嘌呤呤环环氨氨基基上上的的异异丙丙酰酰保保护护基基，合合成成完完毕毕后脱去。后脱去。固相支持物最常用的固相载体为可控微孔玻璃珠（最常用的固相载体为可控微孔玻璃珠（CPGCPG，controlled pore glasscontrolled pore glass），），CPGCPG的孔径根据所的孔径根据所合成的寡核苷酸的长度而定，一般合成链长小合成的寡核苷酸的长度而定，一般合成链长小于于60nt60nt时，选择孔径时，选择孔径500500埃，链长大于埃，链长大于60nt60nt时，时，使用使用10001000埃埃CPGCPG，使用使用CPGCPG的缩合效率高达的缩合效率高达98%-98%-99.9%99.9%，可以满足合成长达，可以满足合成长达175nt175nt的寡核苷酸的的寡核苷酸的条件。条件。CPGCPG通过连接化合物与初始核苷酸的羟通过连接化合物与初始核苷酸的羟基共价结合，核苷酸的基共价结合，核苷酸的55羟基用二甲氧基三羟基用二甲氧基三苯甲基（苯甲基（DMTDMT）保护。保护。 合成过程中的第一个寡核苷酸合成的具体步骤去封闭去封闭, ,用三氯乙酸去除用三氯乙酸去除CPGCPG所连核苷上的所连核苷上的DMT,DMT,以暴露以暴露55羟基，羟基，供下一步缩合。供下一步缩合。活化活化, ,在缩合之前，单体与四唑混合并进入合成柱，此时四唑提在缩合之前，单体与四唑混合并进入合成柱，此时四唑提供一个质子给供一个质子给33磷酸上二异丙胺基的磷酸上二异丙胺基的N N原子，质子化的二异丙胺原子，质子化的二异丙胺是一个良好的游离基团，与四唑形成亚磷酰胺四唑这种活性中间是一个良好的游离基团，与四唑形成亚磷酰胺四唑这种活性中间体。体。 连接连接，亚磷酰胺四唑与亚磷酰胺四唑与CPGCPG所连的核苷酸碰撞时，与其所连的核苷酸碰撞时，与其55羟基发羟基发生亲核反应，发生缩合并脱掉四唑，合成的寡核苷酸链延长一个。生亲核反应，发生缩合并脱掉四唑，合成的寡核苷酸链延长一个。盖帽盖帽, ,为了防止未反应的与为了防止未反应的与CPGCPG相连的相连的55羟基在随后的循环中被羟基在随后的循环中被延长，需要在连接反应充分进行之后使之封闭，常用乙酰化来封延长，需要在连接反应充分进行之后使之封闭，常用乙酰化来封闭此羟基。临用前混合乙酸酐和闭此羟基。临用前混合乙酸酐和N-N-甲基咪唑等形成一活性很强的甲基咪唑等形成一活性很强的乙酰化试剂，与少量为参与连接反应的乙酰化试剂，与少量为参与连接反应的55羟基缩合成酯键。羟基缩合成酯键。 氧化氧化，连接反应后新加上的核苷酸通过亚磷酯键（磷为三价）与连接反应后新加上的核苷酸通过亚磷酯键（磷为三价）与CPGCPG上相连的寡核苷酸链连接，此亚磷酯键不稳定，易被酸、碱上相连的寡核苷酸链连接，此亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，因此需将此处三价磷氧化为五价的磷。常用的氧化剂为碘水解，因此需将此处三价磷氧化为五价的磷。常用的氧化剂为碘的四氢呋喃溶液。的四氢呋喃溶液。 DetritylationActivation and CouplingCappingOxidation合成后处理切割：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下切割：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水来裂解来。常用新鲜的浓氨水来裂解CPGCPG上连接化合物与初始上连接化合物与初始核苷间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的核苷间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的33羟羟基。基。脱保护基：须在此步前选好后续的纯化方法。一般用脱保护基：须在此步前选好后续的纯化方法。一般用新鲜的浓氨水处理较长时间以脱掉腈乙基、苯甲酰基、新鲜的浓氨水处理较长时间以脱掉腈乙基、苯甲酰基、异丙基，用三氟乙酸脱异丙基，用三氟乙酸脱5-DMT.5-DMT.纯化：根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化纯化：根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。常用的纯化方法有：的方法。常用的纯化方法有：C18C18柱、柱、OPCOPC柱、柱、PAGEPAGE和和HPLCHPLC。定量。根据寡核苷酸在定量。根据寡核苷酸在260nm260nm处的紫外吸收来定量。处的紫外吸收来定量。