代谢控制发酵Chapter 5 Chapter 5 代谢控制发酵的代谢控制发酵的代谢控制发酵的代谢控制发酵的基本思想基本思想基本思想基本思想 （微生物代（微生物代（微生物代（微生物代谢的人工控制）谢的人工控制）谢的人工控制）谢的人工控制） 1. 微微生生物物在在正正常常情情况况下下，通通过过细细胞胞内内自自我我调调节节，维维持持各各个个代代谢谢途途径径的的相相互互协协调调，使使其其代代谢谢产产物物既既不不少少又又不不会会过过多多的的积积累累，而而人人类类利利用用微微生生物物进进行行发发酵酵则则需需要要微微生生物物积积累累较较多多的的代代谢谢产产物物，为为此此对对微生物的代谢必须进行人工控制微生物的代谢必须进行人工控制 。 人人工工控控制制微微生生物物代代谢谢的的方方法法主主要要有有两两种：种：一、改变微生物的遗传特征一、改变微生物的遗传特征二、控制发酵条件二、控制发酵条件2.第一节第一节 微生物生物合成途径的遗传控制微生物生物合成途径的遗传控制3.图图图图3-13-1谷氨酸棒杆菌谷氨酸棒杆菌谷氨酸棒杆菌谷氨酸棒杆菌鸟氨酸生物合成途鸟氨酸生物合成途鸟氨酸生物合成途鸟氨酸生物合成途径径径径乙酰谷氨酸合成酶乙酰谷氨酸合成酶乙酰谷氨酸激酶乙酰谷氨酸激酶 NONO乙酰谷氨酸醛脱乙酰谷氨酸醛脱氢酶氢酶乙酰鸟氨酸转氨酶乙酰鸟氨酸转氨酶NONO乙酰谷氨酸乙酰谷氨酸O O乙乙酰鸟氨酸乙酰基转酰鸟氨酸乙酰基转移酶移酶鸟氨酸氨甲酰基转鸟氨酸氨甲酰基转移酶移酶精氨琥珀酸合成酶精氨琥珀酸合成酶精氨琥珀酸酶精氨琥珀酸酶4. Arg对对N-乙乙酰酰谷谷氨氨酸酸合合成成酶酶和和N-乙乙酰酰谷谷氨氨酸酸激激酶酶有有反反馈馈调调节节作作用用。当当选选育育瓜瓜氨氨酸酸缺缺陷陷突突变变株株 （ Cit- ），亚亚适适量量添添加加瓜瓜氨氨酸酸（ Cit ），就就会会积积累累大大量量的鸟氨酸的鸟氨酸 。5.2、分支途径、分支途径 （1） 6.7.8.9.例如：谷氨酸棒杆菌例如：谷氨酸棒杆菌例如：谷氨酸棒杆菌例如：谷氨酸棒杆菌 、产氨短杆菌、黄色短杆菌的选、产氨短杆菌、黄色短杆菌的选、产氨短杆菌、黄色短杆菌的选、产氨短杆菌、黄色短杆菌的选育高丝氨酸脱氢酶缺陷型（育高丝氨酸脱氢酶缺陷型（育高丝氨酸脱氢酶缺陷型（育高丝氨酸脱氢酶缺陷型（homhom- -）来）来）来）来积累大量积累大量积累大量积累大量LysLys。 10.二、选育抗反馈调节突变株二、选育抗反馈调节突变株 所谓抗反馈调节突变株就是已解除了所谓抗反馈调节突变株就是已解除了反馈调节作用的突变株反馈调节作用的突变株 。在这些突变株中，。在这些突变株中，因为反馈抑制或阻遏，或两者引起的自动因为反馈抑制或阻遏，或两者引起的自动调节作用已被削弱或解除，所以能合成较调节作用已被削弱或解除，所以能合成较多的最终产物。多的最终产物。 11.（一）选育抗代谢类似物的突变株（一）选育抗代谢类似物的突变株（Analogue Resistance Mutant） 通常微生物生长需要各种代谢物。如维生通常微生物生长需要各种代谢物。如维生通常微生物生长需要各种代谢物。如维生通常微生物生长需要各种代谢物。如维生素、嘌呤、氨基酸等。在正常情况下，代谢素、嘌呤、氨基酸等。在正常情况下，代谢素、嘌呤、氨基酸等。在正常情况下，代谢素、嘌呤、氨基酸等。在正常情况下，代谢终产物如氨基酸终产物如氨基酸终产物如氨基酸终产物如氨基酸A A过量存在时，就会抑制或阻过量存在时，就会抑制或阻过量存在时，就会抑制或阻过量存在时，就会抑制或阻遏它自身生物合成酶。同时也能整合到蛋白遏它自身生物合成酶。同时也能整合到蛋白遏它自身生物合成酶。同时也能整合到蛋白遏它自身生物合成酶。同时也能整合到蛋白质中去。只有当氨基酸质中去。只有当氨基酸质中去。只有当氨基酸质中去。只有当氨基酸A A 浓度足够高时，浓度足够高时，浓度足够高时，浓度足够高时，A A与与与与调节酶的调节部位或调节基因编码的阻遏蛋调节酶的调节部位或调节基因编码的阻遏蛋调节酶的调节部位或调节基因编码的阻遏蛋调节酶的调节部位或调节基因编码的阻遏蛋白结合，产生反馈抑制或阻遏作用。当细胞白结合，产生反馈抑制或阻遏作用。当细胞白结合，产生反馈抑制或阻遏作用。当细胞白结合，产生反馈抑制或阻遏作用。当细胞中的中的中的中的A A参与蛋白质合成，而使细胞中参与蛋白质合成，而使细胞中参与蛋白质合成，而使细胞中参与蛋白质合成，而使细胞中A A的浓度的浓度的浓度的浓度下降到一定程度时，下降到一定程度时，下降到一定程度时，下降到一定程度时，A A就会从调节酶的调节部就会从调节酶的调节部就会从调节酶的调节部就会从调节酶的调节部位或阻遏蛋白上脱落下来，从而解除反馈调位或阻遏蛋白上脱落下来，从而解除反馈调位或阻遏蛋白上脱落下来，从而解除反馈调位或阻遏蛋白上脱落下来，从而解除反馈调节，又重新可以合成新的节，又重新可以合成新的节，又重新可以合成新的节，又重新可以合成新的A A。当。当。当。当A A的浓度再次的浓度再次的浓度再次的浓度再次上升到一定值时，反馈调节再次发生上升到一定值时，反馈调节再次发生上升到一定值时，反馈调节再次发生上升到一定值时，反馈调节再次发生.。 12. 我我我我们们们们说说说说代代代代谢谢谢谢物物物物和和和和调调调调节节节节酶酶酶酶的的的的变变变变构构构构部部部部位位位位或或或或阻阻阻阻遏遏遏遏蛋蛋蛋蛋白白白白的的的的结结结结合合合合是是是是可可可可逆逆逆逆的的的的。而而而而代代代代谢谢谢谢类类类类似似似似物物物物，结结结结构构构构类类类类似似似似物物物物，即即即即A A则则则则不不不不同同同同，在在在在培培培培养养养养基基基基中中中中添添添添加加加加A A其其其其空空空空间间间间结结结结构构构构与与与与A A相相相相似似似似。当当当当细细细细胞胞胞胞中中中中大大大大量量量量存存存存在在在在A A时时时时，它它它它也也也也能能能能和和和和A A一一一一样样样样与与与与调调调调节节节节酶酶酶酶的的的的调调调调节节节节部部部部位位位位或或或或调调调调节节节节基基基基因因因因编编编编码码码码的的的的阻阻阻阻遏遏遏遏蛋蛋蛋蛋白白白白结结结结合合合合，发发发发生生生生反反反反馈馈馈馈抑抑抑抑制制制制与与与与阻阻阻阻遏遏遏遏作作作作用用用用。由由由由于于于于A A不不不不能能能能整整整整合合合合到到到到蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子中中中中去去去去，细细细细胞胞胞胞中中中中的的的的AA浓浓浓浓度度度度不不不不会会会会自自自自行行行行下下下下降降降降。只只只只要要要要AA结结结结合合合合到到到到调调调调节节节节酶酶酶酶的的的的调调调调节节节节部部部部位位位位或或或或阻阻阻阻遏遏遏遏蛋蛋蛋蛋白白白白上上上上就就就就不不不不能能能能脱脱脱脱落落落落下下下下来来来来，这这这这种种种种结结结结合合合合是是是是不不不不可可可可逆逆逆逆的的的的。这这这这样样样样也也也也就就就就没没没没有有有有A A的的的的生生生生物物物物合合合合成成成成，氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸缺缺缺缺乏乏乏乏的的的的细细细细胞胞胞胞会会会会因因因因饥饥饥饥饿饿饿饿而而而而死死死死亡亡亡亡。因因因因此此此此代代代代谢谢谢谢结结结结构构构构类类类类似似似似物物物物对对对对微微微微生生生生物物物物细细细细胞胞胞胞来来来来说说说说是是是是有有有有毒毒毒毒的的的的，只只只只要要要要有结构类似物存在，菌种不会存活。有结构类似物存在，菌种不会存活。有结构类似物存在，菌种不会存活。有结构类似物存在，菌种不会存活。13. 若若若若我我我我们们们们通通通通过过过过诱诱诱诱导导导导等等等等手手手手段段段段获获获获得得得得突突突突变变变变株株株株，已已已已解解解解除除除除了了了了终终终终产产产产物物物物对对对对酶酶酶酶的的的的反反反反馈馈馈馈调调调调节节节节，也也也也就就就就是是是是说说说说终终终终产产产产物物物物 A A不不不不再再再再与与与与调调调调节节节节酶酶酶酶的的的的调调调调节节节节部部部部位位位位或或或或阻阻阻阻遏遏遏遏蛋蛋蛋蛋白白白白结结结结合合合合。那那那那么么么么A A的的的的结结结结构构构构类类类类似似似似物物物物A A也也也也同同同同样样样样不不不不再再再再与与与与调调调调节节节节酶酶酶酶的的的的调调调调节节节节部部部部位位位位或或或或胞胞胞胞质质质质阻阻阻阻遏遏遏遏蛋蛋蛋蛋白白白白结结结结合合合合，也也也也就就就就是是是是A A对对对对菌菌菌菌株株株株的的的的毒毒毒毒害害害害作作作作用用用用表表表表现现现现不不不不出出出出来来来来，我我我我们们们们就就就就说说说说该该该该菌菌菌菌株株株株对对对对A A有有有有抗抗抗抗性性性性。（resistanceresistance）我我我我们们们们常常常常常常常常将将将将经经经经过过过过各各各各种种种种手手手手段段段段诱诱诱诱变变变变的的的的突突突突变变变变株株株株放放放放到到到到含含含含有有有有终终终终产产产产物物物物结结结结构构构构类类类类似似似似物物物物A A的的的的培培培培养养养养基基基基上上上上，挑挑挑挑出出出出长长长长出出出出来来来来的的的的抗抗抗抗性性性性菌菌菌菌株株株株。若若若若突突突突变变变变株株株株抗抗抗抗A A性性性性能能能能越越越越强强强强（在在在在含含含含高高高高浓浓浓浓度度度度A A上上上上长长长长出出出出来来来来），则则则则说说说说明明明明该该该该菌菌菌菌株株株株解解解解除除除除A A对对对对其其其其生生生生物物物物合合合合成成成成系系系系统统统统的的的的反反反反馈馈馈馈调调调调节节节节就就就就越越越越彻彻彻彻底底底底，那那那那么么么么A A积积积积累就越多。累就越多。累就越多。累就越多。 14. 根根据据上上述述原原理理，只只要要选选取取结结构构类类似似物物抗抗性性突突变变株株，就就有有可可能能得得到到解解除除反反馈馈抑抑制制或或阻阻遏遏的的突突变变株株。在在这这个个意意义义上上结结构构类类似似物物抗抗性性可可以以作作为为解解除除反反馈馈调调节节菌菌株株的的“筛子筛子”。 除了氨基酸外还有嘌呤、嘧啶、维除了氨基酸外还有嘌呤、嘧啶、维生素等的结构类似物。通过选育这些结生素等的结构类似物。通过选育这些结构类似物菌株构类似物菌株 ，已获得氨基酸、核苷酸、，已获得氨基酸、核苷酸、核苷、维生素等各种代谢产物的高产菌核苷、维生素等各种代谢产物的高产菌株。株。 15.（二）从营养缺陷型回复突变株中获得对（二）从营养缺陷型回复突变株中获得对途径中调节酶解除反馈抑制的突变株途径中调节酶解除反馈抑制的突变株 调调节节酶酶的的变变构构特特性性是是由由它它的的结结构构基基因因决决定定的的，若若调调节节酶酶因因编编码码它它的的基基因因发发生生突突变变而失活，则有两种可能：而失活，则有两种可能： 1、是是编编码码为为催催化化亚亚基基与与调调节节亚亚基基的的基基因因发发生了变化。生了变化。 2、仅仅仅仅是是编编码码催催化化亚亚基基（或或活活性性部部位位）的的基因发生变化。基因发生变化。 16. 若若若若通通通通过过过过再再再再次次次次突突突突变变变变，使使使使调调调调节节节节酶酶酶酶的的的的活活活活性性性性恢恢恢恢复复复复，这这这这时时时时又有两种可能：又有两种可能：又有两种可能：又有两种可能： 一一一一是是是是催催催催化化化化亚亚亚亚基基基基和和和和调调调调节节节节亚亚亚亚基基基基恢恢恢恢复复复复（或或或或大大大大体体体体恢恢恢恢复复复复）到到到到第第第第一一一一次次次次突突突突变变变变前前前前那那那那样样样样的的的的状状状状态态态态。另另另另一一一一种种种种是是是是催催催催化化化化亚亚亚亚基基基基得得得得到到到到恢恢恢恢复复复复，而而而而调调调调节节节节亚亚亚亚基基基基却却却却丧丧丧丧失失失失了了了了调调调调节节节节作作作作用用用用，这这这这情情情情况况况况实实实实质质质质上上上上是是是是编编编编码码码码调调调调节节节节亚亚亚亚基基基基的的的的DNADNA突突突突变变变变，解解解解除了反馈抑制作用。除了反馈抑制作用。除了反馈抑制作用。除了反馈抑制作用。 调调调调节节节节酶酶酶酶的的的的失失失失活活活活与与与与否否否否，可可可可能能能能直直直直接接接接表表表表现现现现为为为为某某某某种种种种营营营营养养养养缺缺缺缺陷陷陷陷型型型型。可可可可以以以以采采采采用用用用营营营营养养养养缺缺缺缺陷陷陷陷型型型型的的的的回回回回复复复复突突突突变变变变的的的的方方方方法法法法，从从从从营营营营养养养养缺缺缺缺陷陷陷陷型型型型回回回回复复复复突突突突变变变变株株株株中中中中获获获获得得得得对对对对途途途途径径径径中中中中的调节酶解除反馈调节的调节突变株。的调节酶解除反馈调节的调节突变株。的调节酶解除反馈调节的调节突变株。的调节酶解除反馈调节的调节突变株。 17.三、产物降解酶缺失突变株三、产物降解酶缺失突变株 为了使产物在发酵液中稳定地存在，为了使产物在发酵液中稳定地存在，以提高发酵单位，可通过诱变获得缺乏降以提高发酵单位，可通过诱变获得缺乏降解产物酶的突变株，其方法是诱变处理后，解产物酶的突变株，其方法是诱变处理后，如图所示：如图所示： 18.19.四、增加前体物的合成四、增加前体物的合成 通过选育某些营养缺陷型或结构类似通过选育某些营养缺陷型或结构类似物抗性突变株以及克隆某些关键酶的方法，物抗性突变株以及克隆某些关键酶的方法，增加目的产物的前体合成，有利于目的产增加目的产物的前体合成，有利于目的产物的大量积累。物的大量积累。 20.21.五、细胞膜组分缺失突变株五、细胞膜组分缺失突变株 22.23.第二节第二节 生物发酵条件的控制（外因）生物发酵条件的控制（外因） 当菌株选育确定后，环境条件合适与当菌株选育确定后，环境条件合适与否是发酵成败的重要因素。环境条件既影否是发酵成败的重要因素。环境条件既影响微生物生长，又影响代谢速度和方向及响微生物生长，又影响代谢速度和方向及产物形成与积累。现以谷氨酸棒杆菌产物形成与积累。现以谷氨酸棒杆菌（corynebacterium glutamic acidcorynebacterium glutamic acid）发）发酵为例来说明控制发酵条件包括酵为例来说明控制发酵条件包括O O2 2浓度、浓度、NHNH4 4浓度浓度 、pHpH、磷酸盐浓度、生物素浓度、磷酸盐浓度、生物素浓度等，环境条件改变，可使代谢转换方向，等，环境条件改变，可使代谢转换方向，不生成不生成GluGlu，而生成乳酸、，而生成乳酸、a-KGAa-KGA、琥珀酸、琥珀酸、谷酰胺等产物。谷酰胺等产物。 24.表表3 3- -1 1 环环境境因因素素对对G Gl lu u产产生生菌菌发发酵酵的的影影响响 25.26.第三节第三节 代谢控制发酵实例代谢控制发酵实例27.一、丙酮酸的代谢控制发酵一、丙酮酸的代谢控制发酵（一）丙酮酸用途及生产状况（一）丙酮酸用途及生产状况（一）丙酮酸用途及生产状况（一）丙酮酸用途及生产状况 丙酮酸（丙酮酸（丙酮酸（丙酮酸（pyruvic acidpyruvic acidpyruvic acidpyruvic acid）又称）又称）又称）又称a-a-a-a-氧代丙氧代丙氧代丙氧代丙酸，酸，酸，酸，a-a-a-a-酮基丙酸或乙酰基甲酸，为无色至淡酮基丙酸或乙酰基甲酸，为无色至淡酮基丙酸或乙酰基甲酸，为无色至淡酮基丙酸或乙酰基甲酸，为无色至淡黄色液体，呈醋酸香气和愉快酸味，是最重黄色液体，呈醋酸香气和愉快酸味，是最重黄色液体，呈醋酸香气和愉快酸味，是最重黄色液体，呈醋酸香气和愉快酸味，是最重要的要的要的要的a-a-a-a-氧代羟酸之一。丙酮酸不仅在生物能氧代羟酸之一。丙酮酸不仅在生物能氧代羟酸之一。丙酮酸不仅在生物能氧代羟酸之一。丙酮酸不仅在生物能量代谢中具有十分重要的作用，而且是多种量代谢中具有十分重要的作用，而且是多种量代谢中具有十分重要的作用，而且是多种量代谢中具有十分重要的作用，而且是多种有用化合物的前体。例如：治疗帕金森病的有用化合物的前体。例如：治疗帕金森病的有用化合物的前体。例如：治疗帕金森病的有用化合物的前体。例如：治疗帕金森病的正多巴和正多巴和正多巴和正多巴和L-L-L-L-半脱氢酸半脱氢酸半脱氢酸半脱氢酸L-LeuL-LeuL-LeuL-Leu、B B B B6 6 6 6和和和和B B B B12121212的前体，的前体，的前体，的前体，也是合成氢化阿托酸，谷物保护剂等多种农也是合成氢化阿托酸，谷物保护剂等多种农也是合成氢化阿托酸，谷物保护剂等多种农也是合成氢化阿托酸，谷物保护剂等多种农药的前体，因此在化工、制药和农用化学品药的前体，因此在化工、制药和农用化学品药的前体，因此在化工、制药和农用化学品药的前体，因此在化工、制药和农用化学品等工业及科学研究中有广泛用途。等工业及科学研究中有广泛用途。等工业及科学研究中有广泛用途。等工业及科学研究中有广泛用途。 28. 作作作作为为为为一一一一种种种种化化化化工工工工产产产产品品品品，丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸早早早早已已已已实实实实现现现现工工工工业业业业化化化化生生生生产产产产，但但但但是是是是直直直直到到到到20202020世世世世纪纪纪纪90909090年年年年代代代代工工工工业业业业上上上上生生生生产产产产 丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸还还还还沿沿沿沿用用用用Howard Howard Howard Howard FraeerFraeerFraeerFraeer（1932193219321932）开开开开发发发发的的的的酒酒酒酒石石石石酸酸酸酸脱脱脱脱水水水水脱脱脱脱羟羟羟羟法法法法，没没没没有有有有多多多多大大大大改改改改进进进进，此此此此法法法法是是是是将将将将酒酒酒酒石石石石酸酸酸酸+ + + +硫硫硫硫酸酸酸酸氢氢氢氢钾钾钾钾混混混混合合合合在在在在220220220220下下下下蒸蒸蒸蒸馏馏馏馏，馏馏馏馏出出出出物物物物再再再再经经经经真真真真空空空空精精精精馏馏馏馏即即即即可可可可得得得得丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸，工工工工艺艺艺艺简简简简单单单单易易易易行行行行。其其其其主主主主要要要要缺缺缺缺点点点点（1 1 1 1）丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸产产产产率率率率较较较较低低低低（为为为为酒酒酒酒石石石石酒酒酒酒量量量量的的的的2929292930%30%30%30%）。（2 2 2 2）得得得得到到到到1g1g1g1g丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸需需需需消消消消耗耗耗耗5g5g5g5g硫硫硫硫酸酸酸酸氢氢氢氢钾钾钾钾，以以以以目目目目前前前前( ( ( (酒酒酒酒石石石石酸酸酸酸1.51.51.51.5万万万万元元元元/ / / /吨吨吨吨, , , , 硫硫硫硫酸酸酸酸氢氢氢氢钾钾钾钾0.60.60.60.6万万万万元元元元/ / / /吨吨吨吨) ) ) )市市市市场场场场价价价价计计计计算算算算, , , ,仅仅仅仅原原原原料料料料成成成成本本本本至至至至少少少少需需需需8 8 8 8万万万万元元元元/ / / /吨吨吨吨, , , ,为为为为此此此此在在在在很很很很长长长长一一一一段段段段时时时时间间间间内内内内, , , , 丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸的的的的价价价价格格格格居居居居高高高高不不不不下下下下, , , ,限限限限制制制制其其其其推推推推广广广广应应应应用用用用。1995199519951995年年年年国国国国外外外外一一一一些些些些研研研研究究究究机机机机构构构构发发发发表表表表丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸钙钙钙钙在在在在减减减减肥肥肥肥保保保保健健健健上上上上具具具具有有有有独独独独特特特特疗疗疗疗效效效效的的的的报报报报道道道道后后后后，国国国国外外外外（主主主主要要要要是是是是美美美美国国国国）对对对对丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸钙钙钙钙的的的的需需需需求求求求量量量量激激激激活活活活，刺刺刺刺激激激激国国国国内内内内一一一一些些些些化化化化工工工工厂厂厂厂一一一一拥拥拥拥而而而而上上上上，一一一一时时时时间间间间国国国国内内内内丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸（化化化化学学学学法法法法）的的的的生生生生产产产产能能能能力力力力达达达达2000200020002000吨吨吨吨/ / / /年年年年左左左左右右右右, , , , 丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸及及及及其其其其盐盐盐盐的的的的市市市市场场场场价价价价由由由由当当当当时时时时28282828万万万万元元元元/ / / /吨吨吨吨降降降降低低低低到到到到9 9 9 9万万万万元元元元/ / / /吨吨吨吨。如如如如何何何何解解解解决决决决丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸的的的的市市市市场场场场需需需需求求求求不不不不断断断断扩扩扩扩大大大大，但但但但其其其其价价价价格格格格又又又又无无无无法法法法进进进进一一一一步步步步下下下下降降降降这这这这一一一一矛矛矛矛盾盾盾盾呢呢呢呢？显显显显然然然然开开开开发发发发成成成成本本本本更更更更低低低低的的的的丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸生生生生产产产产技技技技术术术术，即即即即采采采采用用用用直直直直接接接接发发发发酵酵酵酵或或或或生物转化法是解决此问题的根本出路。生物转化法是解决此问题的根本出路。生物转化法是解决此问题的根本出路。生物转化法是解决此问题的根本出路。29. 尽管一些微生物能够积累丙酮酸，但其产尽管一些微生物能够积累丙酮酸，但其产尽管一些微生物能够积累丙酮酸，但其产尽管一些微生物能够积累丙酮酸，但其产量无法达到工业生产要求而选育高产丙酮酸量无法达到工业生产要求而选育高产丙酮酸量无法达到工业生产要求而选育高产丙酮酸量无法达到工业生产要求而选育高产丙酮酸菌株十分困难，发酵法生产丙酮酸真正取得菌株十分困难，发酵法生产丙酮酸真正取得菌株十分困难，发酵法生产丙酮酸真正取得菌株十分困难，发酵法生产丙酮酸真正取得突破是突破是突破是突破是1988198819881988年，日本东丽工业株式会社的研年，日本东丽工业株式会社的研年，日本东丽工业株式会社的研年，日本东丽工业株式会社的研究人员宫田令子和米原撤选育出一系列丙酮究人员宫田令子和米原撤选育出一系列丙酮究人员宫田令子和米原撤选育出一系列丙酮究人员宫田令子和米原撤选育出一系列丙酮酸产量超过酸产量超过酸产量超过酸产量超过50g/mL50g/mL50g/mL50g/mL的球拟酵母菌株，使得发的球拟酵母菌株，使得发的球拟酵母菌株，使得发的球拟酵母菌株，使得发酵法生产丙酮酸的工业化成为可能。酵法生产丙酮酸的工业化成为可能。酵法生产丙酮酸的工业化成为可能。酵法生产丙酮酸的工业化成为可能。1989198919891989年年年年实现工业化发酵生产，其产酸率最高达实现工业化发酵生产，其产酸率最高达实现工业化发酵生产，其产酸率最高达实现工业化发酵生产，其产酸率最高达67.8g/L67.8g/L67.8g/L67.8g/L。1992199219921992年日本开始采用发酵法生产丙年日本开始采用发酵法生产丙年日本开始采用发酵法生产丙年日本开始采用发酵法生产丙酮酸产量为酮酸产量为酮酸产量为酮酸产量为400400400400吨吨吨吨/ / / /年年年年, , , ,售价为售价为售价为售价为4000400040004000日元日元日元日元/Kg/Kg/Kg/Kg。 30.（二）酵母代谢控制发酵生产丙酮酸 31.n n 、丙酮酸脱羧酶（、丙酮酸脱羧酶（、丙酮酸脱羧酶（、丙酮酸脱羧酶（PDCPDC）；）；）；）； 、丙酮酸转氨、丙酮酸转氨、丙酮酸转氨、丙酮酸转氨酶（酶（酶（酶（PTPT）；）；）；）； 、丙酮酸羧化酶（、丙酮酸羧化酶（、丙酮酸羧化酶（、丙酮酸羧化酶（PCPC）；）；）；）；n n、丙酮酸脱氢酶复合体（、丙酮酸脱氢酶复合体（、丙酮酸脱氢酶复合体（、丙酮酸脱氢酶复合体（PDHPDH）。）。）。）。n nNANA和和和和B B1 1是丙酮酸脱氢酶系（是丙酮酸脱氢酶系（是丙酮酸脱氢酶系（是丙酮酸脱氢酶系（PDHPDH）的辅因子）的辅因子）的辅因子）的辅因子n nBioBio是丙酮酸羧化酶（是丙酮酸羧化酶（是丙酮酸羧化酶（是丙酮酸羧化酶（PCPC）的辅因子）的辅因子）的辅因子）的辅因子n nB B6 6是丙酮酸转氨酶（是丙酮酸转氨酶（是丙酮酸转氨酶（是丙酮酸转氨酶（PTPT）的辅因子）的辅因子）的辅因子）的辅因子n nB B1 1是丙酮酸脱羧酶（是丙酮酸脱羧酶（是丙酮酸脱羧酶（是丙酮酸脱羧酶（PDCPDC）辅助因子）辅助因子）辅助因子）辅助因子32.33.二、二、D-核糖代谢控制发酵核糖代谢控制发酵 （一）（一）D-D-核糖发酵机制核糖发酵机制 34.35.36.（二）（二）D-D-核糖发酵的代谢控制育种核糖发酵的代谢控制育种 1 1、出出发发菌菌株株选选择择 芽芽孢孢杆杆菌菌属属的的细细菌菌转转酮酮酸酸缺缺陷陷突突变变株株积积累累D-D-核核糖糖具具有有普普遍遍性性。而而EcoliEcoli属属伤伤寒寒沙沙门门氏氏等等细细菌菌的的转转酮酮酸酸缺缺陷陷突突变变株株并并不不积积累累核核糖糖，都都采采用用芽芽孢孢杆菌属细菌。杆菌属细菌。37.2 2、转酮酶缺陷突变株的分离（选育）、转酮酶缺陷突变株的分离（选育） （1 1）选选育育不不利利用用D-D-葡葡萄萄糖糖酸酸或或L-L-阿阿拉拉伯伯糖糖的的突突变变株株，因因为为D-D-葡葡萄萄糖糖酸酸和和L-L-阿阿拉拉伯伯糖糖必必须须通通过过磷磷酸酸戌戌糖糖途途径径进进行行代代谢谢，若若转转酮酮酶酶发发生生缺缺陷陷，那那样样菌菌体体自自然然也也就就不能利用不能利用D-D-葡萄糖酸或葡萄糖酸或L-L-阿拉伯糖。阿拉伯糖。 （2 2）选育莽草酸缺陷突变株）选育莽草酸缺陷突变株 （3 3）选选育育L-L-色色氨氨酸酸- -、L-L-酪酪氨氨酸酸- -、L-L-phephe- -、CoQCoQ- -、VkVk- -或或叶叶酸酸缺缺陷陷突突变变、莽莽草草酸酸缺缺陷陷、4-4-赤赤藓藓糖糖合合成成受受阻阻、 转转酮酮酶酶- -、转醛酶转醛酶- -。38.3 3、其它标记、其它标记 在在维维持持转转酮酮酶酶缺缺陷陷的的情情况况下下，进进一一步步诱诱变变使使菌菌体体带带上上具具有有高高葡葡萄萄糖糖脱脱氢氢酶酶活活性性和和丧丧失失孢孢子子形形成成能能力力，可可使使D-D-核核糖糖大大量量积积累累。葡葡萄萄糖糖脱脱氢氢酶酶是是芽芽孢孢杆杆菌菌属属序序细细菌菌的的孢孢子子所所特特有有的的酶酶，该该酶酶由由于于NADNAD、NADPNADP和和NADHNADH2 2、NADPHNADPH2 2会会发发生生分分子子型型的的变变换换，结结果果在在菌菌体体对对生生长长期期被被诱诱导导，导导致致D-D-核核糖糖大大量量积积累累，若若生生孢孢子子D-D-核核糖糖减少。减少。39.4 4、利用基因工程、利用基因工程 日日日日本本本本岩岩岩岩木木木木盾盾盾盾等等等等人人人人首首首首先先先先将将将将枯枯枯枯草草草草杆杆杆杆菌菌菌菌染染染染色色色色体体体体DNADNADNADNA中中中中的的的的转转转转酮酮酮酮酶酶酶酶基基基基因因因因克克克克隆隆隆隆到到到到载载载载体体体体质质质质粒粒粒粒PUB110PUB110PUB110PUB110中中中中，然然然然后后后后将将将将氯氯氯氯霉霉霉霉素素素素酰酰酰酰基基基基转转转转移移移移酶酶酶酶基基基基因因因因插插插插入入入入到到到到转转转转酮酮酮酮酶酶酶酶基基基基因因因因之之之之中中中中，造造造造成成成成转转转转酮酮酮酮酶酶酶酶基基基基因因因因的的的的不不不不可可可可逆逆逆逆失失失失活活活活。经经经经限限限限制制制制性性性性内内内内切切切切酶酶酶酶SmalSmalSmalSmal切切切切后后后后得得得得到到到到线线线线状状状状重重重重组组组组质质质质粒粒粒粒，将将将将该该该该线线线线状状状状重重重重组组组组质质质质粒粒粒粒转转转转化化化化到到到到枯枯枯枯草草草草杆杆杆杆菌菌菌菌宿宿宿宿主主主主菌菌菌菌中中中中，构构构构建建建建转转转转酮酮酮酮酶酶酶酶失失失失活活活活的的的的D-D-D-D-核核核核糖糖糖糖工工工工程程程程菌菌菌菌株株株株。其其其其核核核核糖糖糖糖产产产产量量量量达达达达52g/L52g/L52g/L52g/L。小小小小林林林林等等等等人人人人将将将将葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖脱脱脱脱氢氢氢氢酶酶酶酶基基基基因因因因克克克克隆隆隆隆到到到到载载载载体体体体质质质质粒粒粒粒PHY300PLKPHY300PLKPHY300PLKPHY300PLK中中中中，然然然然后后后后转转转转化化化化到到到到枯枯枯枯草草草草芽芽芽芽孢孢孢孢杆杆杆杆菌菌菌菌中中中中去去去去。构构构构建建建建扩扩扩扩增增增增葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖脱脱脱脱氢氢氢氢酶酶酶酶的的的的D-D-D-D-核核核核糖糖糖糖工工工工程程程程菌菌菌菌，353535350 0 0 0C C C C发发发发酵酵酵酵80h80h80h80h可可可可积积积积累累累累49g/LD-49g/LD-49g/LD-49g/LD-核糖。核糖。核糖。核糖。 40.5 5、发酵控制、发酵控制 发酵培养基：发酵培养基：发酵培养基：发酵培养基：碳碳碳碳源源源源：葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖、D-D-D-D-甘甘甘甘露露露露糖糖糖糖、山山山山梨梨梨梨醇醇醇醇、D-D-D-D-甘甘甘甘露露露露醇醇醇醇、麦芽糖、乳糖麦芽糖、乳糖麦芽糖、乳糖麦芽糖、乳糖、甘油、甘油、甘油、甘油、 糊精、可溶性淀粉等。糊精、可溶性淀粉等。糊精、可溶性淀粉等。糊精、可溶性淀粉等。氮氮氮氮源源源源：干干干干酵酵酵酵母母母母、酵酵酵酵母母母母膏膏膏膏、牛牛牛牛肉肉肉肉膏膏膏膏、蛋蛋蛋蛋白白白白胨胨胨胨 、玉米浆玉米浆玉米浆玉米浆 、（、（、（、（NHNHNHNH4 4 4 4）2 2 2 2SOSOSOSO4 4 4 4、CaCOCaCOCaCOCaCO3 3 3 3 。 要在好气条件下，要在好气条件下，要在好气条件下，要在好气条件下，pHpHpHpH中性，温度中性，温度中性，温度中性，温度373737370 0 0 0C C C C 。 41.三、三、r-亚麻酸代谢控制发酵亚麻酸代谢控制发酵 42.（一）丝状真菌利用葡萄糖生物合成（一）丝状真菌利用葡萄糖生物合成（一）丝状真菌利用葡萄糖生物合成（一）丝状真菌利用葡萄糖生物合成r-r-r-r-亚麻酸的代谢途径亚麻酸的代谢途径亚麻酸的代谢途径亚麻酸的代谢途径 43.44.(二二)高产高产r-r-亚麻酸亚麻酸 菌株的选育思路菌株的选育思路图3-9 高产r-亚麻酸 菌株的选育思路45.1 1、出发菌株、出发菌株 多多 采采 用用 被被 孢孢 霉霉 （MortierellaMortierella） 毛毛 霉霉（MucorMucor）红红酵酵母母（RhodotorulaRhodotorula）小小克克银银汉汉霉霉（CunninghamellaCunninghamella）等等产产油油脂脂高高的的真真菌作出发菌株。菌作出发菌株。46.2 2、切断或减弱支路代、切断或减弱支路代vva-a-亚麻酸亚麻酸- -、花生四烯酸、花生四烯酸- -、二十碳五烯酸、二十碳五烯酸- -vv花生四烯酸花生四烯酸L L、二十碳五烯酸、二十碳五烯酸L L47.3 3、解除反馈调节、解除反馈调节 选育脂肪酸结构类似物，选育脂肪酸结构类似物，如（如（LTBLTBr r），耐高浓度的），耐高浓度的r-r-亚麻酸突变株。亚麻酸突变株。 48.4 4、强强化化能能量量代代谢谢 提提高高菌菌体体细细胞胞内内ATPATP的的水水平有利于脂肪酸合成。平有利于脂肪酸合成。选选育育呼呼吸吸抑抑制制剂剂（丙丙二二酸酸、氰氰化化钾钾、亚亚伸伸酸等）抗性突变株。酸等）抗性突变株。选选育育ADPADP磷磷酸酸化化抑抑制制剂剂（羟羟胺胺、2.42.4二二硝硝基基酚等）抗性突变株。酚等）抗性突变株。选选育育抑抑制制能能量量代代谢谢的的抗抗生生素素( (寡寡霉霉素素、结结元氨霉素、制霉素元氨霉素、制霉素) ) 抗性突变株。抗性突变株。49.5 5、增加前体、增加前体 菌菌体体生生物物合合成成-亚亚麻麻酸酸与与HMPHMP、EMPEMP途途径径直直接接相相关关。增增加加HMPHMP途途径径，NADPHNADPH的的数数量量增增多多，有有利利于于-亚亚麻麻酸酸产产量量的的提提高高。过过量量的的磷磷酸酸盐盐或或通通气气不不足足会会使使EMPEMP途途径径增增强强。而而产产生生NADPHNADPH的的HMPHMP途途径径受受阻阻，导导致致不不饱饱和和脂脂肪肪酸酸的的合合成成降降低低。通通过过选选育育单单氟氟乙乙酸酸敏敏感感、碘碘乙乙酸酸敏敏感感、萘萘啶啶酮酮酸酸敏敏感感突突变变株株，均均有有助助于于-亚亚麻麻酸酸产产量量的的提提高高。另另据据报报道道，选选育育异异柠柠檬檬酸酸脱脱氢氢酶酶渗渗漏漏突突变变殊殊，也也有利于有利于-亚麻酸产量的提高。亚麻酸产量的提高。 50.6 6、选育、选育-6-6脱氢酶活力强的突变株脱氢酶活力强的突变株 -6 -6脱氢酶是生物合成脱氢酶是生物合成r-r-亚麻酸关亚麻酸关键酶之一。其活性高低直接与键酶之一。其活性高低直接与r-r-亚麻酸亚麻酸含量的高低密切有关，可采用选育呼吸含量的高低密切有关，可采用选育呼吸缺陷型相反的方法，即呼吸增强型，通缺陷型相反的方法，即呼吸增强型，通过诱变后菌株涂在含有过诱变后菌株涂在含有TTCTTC的一种无色的一种无色的氧化还原剂的生长培养基上，若的氧化还原剂的生长培养基上，若-6-6脱氢酶强，即可将脱氢酶强，即可将TTCTTC还原成红色的物还原成红色的物质，红色越强，表明菌体细胞内质，红色越强，表明菌体细胞内-6-6脱脱氢酶越强，氢酶越强，r-r-亚麻酸的积累量也就越多。亚麻酸的积累量也就越多。 51.7 7 7 7选育低温生长突变株选育低温生长突变株选育低温生长突变株选育低温生长突变株 细胞膜是重要的微生物细胞表面结构，由脂质细胞膜是重要的微生物细胞表面结构，由脂质细胞膜是重要的微生物细胞表面结构，由脂质细胞膜是重要的微生物细胞表面结构，由脂质和蛋白质组成。脂质分子中不饱和脂肪酸的含量和蛋白质组成。脂质分子中不饱和脂肪酸的含量和蛋白质组成。脂质分子中不饱和脂肪酸的含量和蛋白质组成。脂质分子中不饱和脂肪酸的含量越高，其在低温条件下细胞膜的沉动性也就越大，越高，其在低温条件下细胞膜的沉动性也就越大，越高，其在低温条件下细胞膜的沉动性也就越大，越高，其在低温条件下细胞膜的沉动性也就越大，即微生物细胞生长的温度就越低。据报道，选育即微生物细胞生长的温度就越低。据报道，选育即微生物细胞生长的温度就越低。据报道，选育即微生物细胞生长的温度就越低。据报道，选育在相对低温在相对低温在相对低温在相对低温(15)(15)(15)(15)条件下生长良好的突变抹，结条件下生长良好的突变抹，结条件下生长良好的突变抹，结条件下生长良好的突变抹，结果其果其果其果其-亚麻酸的产量提高了亚麻酸的产量提高了亚麻酸的产量提高了亚麻酸的产量提高了1.41.41.41.4倍。倍。倍。倍。 52.8 8 8 8选育耐高糖的突变株选育耐高糖的突变株选育耐高糖的突变株选育耐高糖的突变株 在代谢控制发酵中，常采用耐高渗透压突变株。在代谢控制发酵中，常采用耐高渗透压突变株。在代谢控制发酵中，常采用耐高渗透压突变株。在代谢控制发酵中，常采用耐高渗透压突变株。-亚麻酸发酵与培养基中糖浓度有密切关系，在亚麻酸发酵与培养基中糖浓度有密切关系，在亚麻酸发酵与培养基中糖浓度有密切关系，在亚麻酸发酵与培养基中糖浓度有密切关系，在一定范围内，一定范围内，一定范围内，一定范围内，-亚麻酸的产坠随糖浓度的增加而亚麻酸的产坠随糖浓度的增加而亚麻酸的产坠随糖浓度的增加而亚麻酸的产坠随糖浓度的增加而增加，但糖浓度过高就会抑制菌体生长。降低产增加，但糖浓度过高就会抑制菌体生长。降低产增加，但糖浓度过高就会抑制菌体生长。降低产增加，但糖浓度过高就会抑制菌体生长。降低产物的积累。因此，通过选育耐高糖的突变抹。可物的积累。因此，通过选育耐高糖的突变抹。可物的积累。因此，通过选育耐高糖的突变抹。可物的积累。因此，通过选育耐高糖的突变抹。可使菌体高效率地利用葡萄糖，从而提高使菌体高效率地利用葡萄糖，从而提高使菌体高效率地利用葡萄糖，从而提高使菌体高效率地利用葡萄糖，从而提高-亚麻酸亚麻酸亚麻酸亚麻酸的产量。的产量。的产量。的产量。 53.四、柠檬酸代谢控制发酵四、柠檬酸代谢控制发酵 2001年以来世界柠檬酸的产量为年以来世界柠檬酸的产量为100万吨左右，万吨左右，2004年我国柠檬酸产量达年我国柠檬酸产量达45万吨，其中万吨，其中80%出口，已经成为世界柠出口，已经成为世界柠檬酸生产和销售大国。我国柠檬酸发酵檬酸生产和销售大国。我国柠檬酸发酵水平：薯干粉产酸水平：薯干粉产酸12%，发酵周期，发酵周期64h，转化率，转化率95%；玉米粉液化液产酸；玉米粉液化液产酸15%，发酵周期，发酵周期5464h，转化率，转化率95%以上。以上。 54.(一一)黑曲霉生物合成柠檬酸有机酸及多元黑曲霉生物合成柠檬酸有机酸及多元醇途径醇途径55. 1 1 1 1、 葡葡葡葡 萄萄萄萄 糖糖糖糖 氧氧氧氧 化化化化 酶酶酶酶 2 2 2 2、内内内内酯酯酯酯酶酶酶酶 3 3 3 3、己己己己糖糖糖糖激激激激酶酶酶酶或或或或葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖激激激激酶酶酶酶 4 4 4 4、P-P-P-P-葡葡葡葡萄糖异构酶萄糖异构酶萄糖异构酶萄糖异构酶 5 5 5 5、果果果果糖糖糖糖运运运运输输输输 6 6 6 6、己己己己糖糖糖糖 7 7 7 7、1-P-1-P-1-P-1-P-甘甘甘甘露露露露（糖糖糖糖）醇醇醇醇脱脱脱脱氢氢氢氢酶酶酶酶 8 8 8 8、1-1-1-1-磷磷磷磷酸酸酸酸甘甘甘甘露露露露（糖糖糖糖）醇醇醇醇磷磷磷磷酸酸酸酸（酯酯酯酯）酶酶酶酶 9 9 9 9、甘甘甘甘露露露露（糖糖糖糖）醇醇醇醇运运运运输输输输 10101010、磷磷磷磷酸酸酸酸果果果果糖糖糖糖激激激激酶酶酶酶 11111111、醛醛醛醛缩缩缩缩酶酶酶酶 12121212、丙丙丙丙糖糖糖糖-P-P-P-P异异异异构构构构酶酶酶酶 13131313、3-P3-P3-P3-P甘甘甘甘 油油油油 醛醛醛醛 脱脱脱脱 氢氢氢氢 酶酶酶酶 14141414、丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸激激激激酶酶酶酶 15151515、丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸羧羧羧羧化化化化酶酶酶酶 16161616、草草草草酰酰酰酰乙乙乙乙酸酸酸酸水水水水解解解解酶酶酶酶 17171717、草草草草酸酸酸酸运运运运输输输输 18181818柠柠柠柠檬檬檬檬酸酸酸酸运运运运输输输输 19191919、苹苹苹苹 果果果果 酸酸酸酸 脱脱脱脱 氢氢氢氢 酶酶酶酶 20202020、 三三三三 羧羧羧羧 酸酸酸酸 载载载载 体体体体 21212121、柠柠柠柠檬檬檬檬酸酸酸酸合合合合成成成成酶酶酶酶 22222222、丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸脱脱脱脱氢氢氢氢酶酶酶酶系系系系56.1 1、葡葡萄萄糖糖化化酶酶是是胞胞外外酶酶，直直接接受受环环境境pHpH的的影影响响。当当pHpH3.53.5时时, ,此此酶酶失失活活, ,当当一一旦旦柠柠檬檬酸酸积积累累使使pHpH降降至至1.8,1.8,从从而而导导致致葡葡萄萄糖糖氧氧化化酶酶失活。失活。57. 2 2 2 2、草草草草酸酸酸酸是是是是由由由由草草草草酰酰酰酰乙乙乙乙酸酸酸酸水水水水解解解解酶酶酶酶的的的的催催催催化化化化生生生生成成成成的的的的，该该该该酶酶酶酶是是是是细细细细胞胞胞胞质质质质酶酶酶酶，草草草草酰酰酰酰乙乙乙乙酸酸酸酸水水水水解解解解酶酶酶酶的的的的生生生生物物物物合合合合成成成成也也也也受受受受外外外外界界界界pHpHpHpH值值值值调调调调节节节节，尽尽尽尽管管管管其其其其调调调调节节节节机机机机制制制制现现现现还还还还没没没没有有有有搞搞搞搞清清清清楚楚楚楚，但但但但是是是是研研研研究究究究表表表表明明明明诱诱诱诱导导导导此此此此酶酶酶酶的的的的最最最最适适适适pHpHpHpH值值值值为为为为5 5 5 56 6 6 6，而而而而当当当当pHpHpHpH为为为为2 2 2 2时时时时，仅仅仅仅观观观观察察察察到到到到非非非非常常常常低低低低的的的的酶酶酶酶活活活活性性性性。过过过过去去去去采采采采用用用用糖糖糖糖蜜蜜蜜蜜，孢孢孢孢子子子子接接接接种种种种发发发发酵酵酵酵pHpHpHpH太太太太低低低低，不不不不利利利利于于于于b b b b孢孢孢孢子子子子萌萌萌萌发发发发，一一一一般般般般发发发发酵酵酵酵前前前前期期期期控控控控制制制制pH5pH5pH5pH56 6 6 6，因因因因此此此此存存存存在在在在少少少少量量量量的的的的葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖或或或或草草草草酸酸酸酸，现现现现在在在在我我我我国国国国采采采采用用用用淀淀淀淀粉粉粉粉质质质质原原原原料料料料的的的的液液液液化化化化液液液液，并并并并采采采采用用用用菌菌菌菌丝丝丝丝大大大大接接接接种种种种量量量量接接接接种种种种，再再再再加加加加上上上上我我我我国国国国的的的的黑黑黑黑曲曲曲曲霉霉霉霉产产产产的的的的糖糖糖糖化化化化酶酶酶酶是是是是耐耐耐耐酸酸酸酸的的的的，因因因因此此此此当当当当黑黑黑黑曲曲曲曲霉霉霉霉大大大大量量量量繁繁繁繁殖殖殖殖后后后后，就就就就产产产产生生生生柠柠柠柠檬檬檬檬酸酸酸酸，发发发发酵酵酵酵液液液液的的的的pHpHpHpH是较低的。是较低的。是较低的。是较低的。 58. 3 3 3 3、多多多多元元元元醇醇醇醇（甘甘甘甘露露露露醇醇醇醇、赤赤赤赤藓藓藓藓醇醇醇醇、丙丙丙丙三三三三醇醇醇醇甘甘甘甘油油油油）是是是是由由由由糖糖糖糖生生生生成成成成的的的的，一一一一旦旦旦旦糖糖糖糖类类类类底底底底物物物物被被被被耗耗耗耗尽尽尽尽，它它它它们们们们就就就就会会会会遭遭遭遭到到到到再再再再次次次次分分分分解解解解，因因因因此此此此只只只只要要要要糖糖糖糖类类类类底底底底物物物物最最最最终终终终能能能能全全全全部部部部消消消消耗耗耗耗多多多多元元元元醇醇醇醇就就就就不不不不可可可可能能能能是是是是影影影影响响响响柠柠柠柠檬檬檬檬酸酸酸酸最最最最终产量的主要因素。终产量的主要因素。终产量的主要因素。终产量的主要因素。 综上所述高产综上所述高产综上所述高产综上所述高产AspAspAspAsp nger nger nger nger柠檬酸产生菌应该柠檬酸产生菌应该柠檬酸产生菌应该柠檬酸产生菌应该在发酵中只生成柠檬酸。事实上，经天津工在发酵中只生成柠檬酸。事实上，经天津工在发酵中只生成柠檬酸。事实上，经天津工在发酵中只生成柠檬酸。事实上，经天津工微所的研究表明，控制好发酵条件，我国柠微所的研究表明，控制好发酵条件，我国柠微所的研究表明，控制好发酵条件，我国柠微所的研究表明，控制好发酵条件，我国柠檬酸产生菌的发酵液经低层析，只有一个柠檬酸产生菌的发酵液经低层析，只有一个柠檬酸产生菌的发酵液经低层析，只有一个柠檬酸产生菌的发酵液经低层析，只有一个柠檬酸斑点。檬酸斑点。檬酸斑点。檬酸斑点。 59.（二）（二）黑曲霉生物合成柠檬酸机制黑曲霉生物合成柠檬酸机制 60.61.62.五、五、赖氨酸代谢控制发酵赖氨酸代谢控制发酵（一）赖氨酸生物合成途径及调节机制（一）赖氨酸生物合成途径及调节机制微生物合成微生物合成Lys的途径主要有两种：的途径主要有两种：1.在霉菌和酵母中的在霉菌和酵母中的L-赖氨酸是经赖氨酸是经-氨基己二氨基己二酸途径：酸途径：63.64.酿酒酵母：同型柠檬酸合成酶存在两种同功酶酿酒酵母：同型柠檬酸合成酶存在两种同功酶酿酒酵母：同型柠檬酸合成酶存在两种同功酶酿酒酵母：同型柠檬酸合成酶存在两种同功酶（HSHS，HSHS），它们都受），它们都受），它们都受），它们都受LysLys相同程度的反馈抑相同程度的反馈抑相同程度的反馈抑相同程度的反馈抑制，制，制，制，HSHS较易受较易受较易受较易受L- LysL- Lys阻遏。阻遏。阻遏。阻遏。薄膜假丝酵母：同型柠檬酸合成酶也存在两种同功薄膜假丝酵母：同型柠檬酸合成酶也存在两种同功薄膜假丝酵母：同型柠檬酸合成酶也存在两种同功薄膜假丝酵母：同型柠檬酸合成酶也存在两种同功酶，但只有酶，但只有酶，但只有酶，但只有HSHS受受受受LysLys反馈抑制。反馈抑制。反馈抑制。反馈抑制。解脂复膜孢酵母：没有发现同工酶，其解脂复膜孢酵母：没有发现同工酶，其解脂复膜孢酵母：没有发现同工酶，其解脂复膜孢酵母：没有发现同工酶，其HSHS强烈受强烈受强烈受强烈受LysLys反馈抑制。反馈抑制。反馈抑制。反馈抑制。产黄青霉菌：同型柠檬酸合成酶受产黄青霉菌：同型柠檬酸合成酶受产黄青霉菌：同型柠檬酸合成酶受产黄青霉菌：同型柠檬酸合成酶受LysLys和青霉素和青霉素和青霉素和青霉素GG的的的的协同反馈抑制。协同反馈抑制。协同反馈抑制。协同反馈抑制。65. 2 2、在细菌、蓝、绿藻中存在另一条重要的途径。是、在细菌、蓝、绿藻中存在另一条重要的途径。是、在细菌、蓝、绿藻中存在另一条重要的途径。是、在细菌、蓝、绿藻中存在另一条重要的途径。是以天冬氨酸为起点，经二氨基庚二酸（以天冬氨酸为起点，经二氨基庚二酸（以天冬氨酸为起点，经二氨基庚二酸（以天冬氨酸为起点，经二氨基庚二酸（DAPDAP）生物）生物）生物）生物合成合成合成合成L- LysL- Lys，称为天冬氨酸途径，亦称，称为天冬氨酸途径，亦称，称为天冬氨酸途径，亦称，称为天冬氨酸途径，亦称-二氨基庚二氨基庚二氨基庚二氨基庚二酸途径。二酸途径。二酸途径。二酸途径。 E.coliE.coli和黄色短杆菌，（谷氨酸棒杆菌等和黄色短杆菌，（谷氨酸棒杆菌等和黄色短杆菌，（谷氨酸棒杆菌等和黄色短杆菌，（谷氨酸棒杆菌等GluGlu产产产产生菌）是研究较为深入的两类细菌，具有一定的代生菌）是研究较为深入的两类细菌，具有一定的代生菌）是研究较为深入的两类细菌，具有一定的代生菌）是研究较为深入的两类细菌，具有一定的代表性。表性。表性。表性。 在大肠杆菌合成在大肠杆菌合成在大肠杆菌合成在大肠杆菌合成LysLys的天冬氨酸途径中，含有三的天冬氨酸途径中，含有三的天冬氨酸途径中，含有三的天冬氨酸途径中，含有三种种种种ASPASP激酶（激酶（激酶（激酶（AKAK）同功酶和两种高丝氨酸脱氢酶）同功酶和两种高丝氨酸脱氢酶）同功酶和两种高丝氨酸脱氢酶）同功酶和两种高丝氨酸脱氢酶（HDHD）同功酶，每个同功酶受不同终产物的反馈）同功酶，每个同功酶受不同终产物的反馈）同功酶，每个同功酶受不同终产物的反馈）同功酶，每个同功酶受不同终产物的反馈调节，而且每个分支途径后的初始酶分别受各自产调节，而且每个分支途径后的初始酶分别受各自产调节，而且每个分支途径后的初始酶分别受各自产调节，而且每个分支途径后的初始酶分别受各自产物的反馈抑制。如物的反馈抑制。如物的反馈抑制。如物的反馈抑制。如LysLys分支途径第一个酶和第二个分支途径第一个酶和第二个分支途径第一个酶和第二个分支途径第一个酶和第二个酶（二氢吡啶二羧酸合成酶与二氢吡啶二羧酸还原酶（二氢吡啶二羧酸合成酶与二氢吡啶二羧酸还原酶（二氢吡啶二羧酸合成酶与二氢吡啶二羧酸还原酶（二氢吡啶二羧酸合成酶与二氢吡啶二羧酸还原酶）受酶）受酶）受酶）受LysLys的反馈抑制等。然后在黄色短杆菌，谷的反馈抑制等。然后在黄色短杆菌，谷的反馈抑制等。然后在黄色短杆菌，谷的反馈抑制等。然后在黄色短杆菌，谷氨酸棒杆菌，乳糖发酵短杆菌等氨酸棒杆菌，乳糖发酵短杆菌等氨酸棒杆菌，乳糖发酵短杆菌等氨酸棒杆菌，乳糖发酵短杆菌等GluGlu生产菌中的关生产菌中的关生产菌中的关生产菌中的关键酶键酶键酶键酶AKAK却都是单一的，该酶受却都是单一的，该酶受却都是单一的，该酶受却都是单一的，该酶受Thr+LysThr+Lys的协同反馈的协同反馈的协同反馈的协同反馈抑制。此外还有以下与大肠杆菌不同：抑制。此外还有以下与大肠杆菌不同：抑制。此外还有以下与大肠杆菌不同：抑制。此外还有以下与大肠杆菌不同：66. (1)(1)没有发现对没有发现对没有发现对没有发现对ASPASP激酶（激酶（激酶（激酶（AKAK）或天冬氨酸半醛脱氢酶的）或天冬氨酸半醛脱氢酶的）或天冬氨酸半醛脱氢酶的）或天冬氨酸半醛脱氢酶的反馈阻遏。反馈阻遏。反馈阻遏。反馈阻遏。 (2)Lys (2)Lys分支途径的第一个酶和第二个酶（二氢吡啶二羧酸分支途径的第一个酶和第二个酶（二氢吡啶二羧酸分支途径的第一个酶和第二个酶（二氢吡啶二羧酸分支途径的第一个酶和第二个酶（二氢吡啶二羧酸合成酶与二氢吡啶二羧酸还原酶）既不受合成酶与二氢吡啶二羧酸还原酶）既不受合成酶与二氢吡啶二羧酸还原酶）既不受合成酶与二氢吡啶二羧酸还原酶）既不受LysLys的反馈的反馈的反馈的反馈抑制，也不受抑制，也不受抑制，也不受抑制，也不受LysLys的阻遏，这对的阻遏，这对的阻遏，这对的阻遏，这对LysLys的积累十分有益。的积累十分有益。的积累十分有益。的积累十分有益。（3 3）未发现）未发现）未发现）未发现LysLys脱羧酶，有利于生产脱羧酶，有利于生产脱羧酶，有利于生产脱羧酶，有利于生产LysLys 综上所述可以采用黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、综上所述可以采用黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、综上所述可以采用黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、综上所述可以采用黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌、北京棒杆菌等乳糖发酵短杆菌、北京棒杆菌等乳糖发酵短杆菌、北京棒杆菌等乳糖发酵短杆菌、北京棒杆菌等GluGlu产生菌选为出发产生菌选为出发产生菌选为出发产生菌选为出发菌株进行诱变或菌株进行诱变或菌株进行诱变或菌株进行诱变或DNADNA重组技术选育高产重组技术选育高产重组技术选育高产重组技术选育高产LysLys菌株。若菌株。若菌株。若菌株。若采用采用采用采用DNADNA重组技术，因重组技术，因重组技术，因重组技术，因E.coliE.coli遗传背景研究较清楚，遗传背景研究较清楚，遗传背景研究较清楚，遗传背景研究较清楚，可以将产可以将产可以将产可以将产LysLys的关键酶基因克隆到的关键酶基因克隆到的关键酶基因克隆到的关键酶基因克隆到E.coliE.coli中，让其表达。中，让其表达。中，让其表达。中，让其表达。67.(二二) 谷氨酸产生菌的赖氨酸生物合成调节机制谷氨酸产生菌的赖氨酸生物合成调节机制68.图图3-13 3-13 乳糖发乳糖发酵短杆菌赖氨酸酵短杆菌赖氨酸生物合成的调节生物合成的调节机制机制1 1、丙酮酸羧化、丙酮酸羧化酶酶2 2、磷酸烯醇丙、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶酮酸羧化酶3 3、天冬氨酸激、天冬氨酸激酶酶4 4、DDPDDP合成酶合成酶5 5、DDPDDP还原酶还原酶6 6、高丝氨酸脱、高丝氨酸脱氢酶氢酶7 7、高丝氨酸激、高丝氨酸激酶酶8 8、琥珀酰高丝、琥珀酰高丝氨酸合成酶氨酸合成酶9 9、苏氨酸脱氨、苏氨酸脱氨酶酶69.1 1、优先合成：、优先合成：、优先合成：、优先合成：MetMet比比比比ThrThr、LysLys优先合优先合优先合优先合成，成，成，成，ThrThr比比比比LysLys优先合成，优先合成，优先合成，优先合成，HDHD酶活为酶活为酶活为酶活为PSPS酶活的酶活的酶活的酶活的1515倍。倍。倍。倍。2 2、AKAK受受受受Thr+LysThr+Lys协同反馈抑制协同反馈抑制协同反馈抑制协同反馈抑制3 3、LysLys和和和和LeuLeu代谢互锁，代谢互锁，代谢互锁，代谢互锁，PSPS受受受受LeuLeu阻遏阻遏阻遏阻遏4 4、乙酰、乙酰、乙酰、乙酰CoACoA和取平衡合成和取平衡合成和取平衡合成和取平衡合成5 5、 Glu Glu 优于优于优于优于AspAsp合成合成合成合成70.(三三)高产高产Lys菌株的育种思路菌株的育种思路71.72.73.74.75.76.（四）采用细胞工程和基因工程选（四）采用细胞工程和基因工程选育高产育高产Lys菌株菌株1.细胞融合选育高产细胞融合选育高产Lys菌株菌株77.78.79.80.高产乙醇的酵母菌的选育思路高产乙醇的酵母菌的选育思路呼吸缺陷型突变株的筛选呼吸缺陷型突变株的筛选n n 如果你分离到一株啤酒酵母，其生长速度是已如果你分离到一株啤酒酵母，其生长速度是已如果你分离到一株啤酒酵母，其生长速度是已如果你分离到一株啤酒酵母，其生长速度是已知生产菌株的二倍，因此你将其用于生产酒精的试知生产菌株的二倍，因此你将其用于生产酒精的试知生产菌株的二倍，因此你将其用于生产酒精的试知生产菌株的二倍，因此你将其用于生产酒精的试验，但结果表明，该酵母株发酵葡萄糖的产物是酒验，但结果表明，该酵母株发酵葡萄糖的产物是酒验，但结果表明，该酵母株发酵葡萄糖的产物是酒验，但结果表明，该酵母株发酵葡萄糖的产物是酒精和其它产物的混合物，并且酒精产量只有现在生精和其它产物的混合物，并且酒精产量只有现在生精和其它产物的混合物，并且酒精产量只有现在生精和其它产物的混合物，并且酒精产量只有现在生产菌株的产菌株的产菌株的产菌株的50%50%。请你写出如何改造你新分离的酵母。请你写出如何改造你新分离的酵母。请你写出如何改造你新分离的酵母。请你写出如何改造你新分离的酵母菌株，使其优于现有的生产菌株的方案。菌株，使其优于现有的生产菌株的方案。菌株，使其优于现有的生产菌株的方案。菌株，使其优于现有的生产菌株的方案。n n 呼吸抑制发酵：在低糖呼吸抑制发酵：在低糖呼吸抑制发酵：在低糖呼吸抑制发酵：在低糖0.2%0.2%酵母比生长速率酵母比生长速率酵母比生长速率酵母比生长速率0.1/h0.1/h时，还是进行呼吸和生长的，而使其生长速率时，还是进行呼吸和生长的，而使其生长速率时，还是进行呼吸和生长的，而使其生长速率时，还是进行呼吸和生长的，而使其生长速率大大提高，因此可以筛选呼吸缺陷型突变株。大大提高，因此可以筛选呼吸缺陷型突变株。大大提高，因此可以筛选呼吸缺陷型突变株。大大提高，因此可以筛选呼吸缺陷型突变株。81.82.