淋巴细胞的分离、计数淋巴细胞的分离、计数中山医学院免疫学教研室2016-04 实验目的和要求实验目的和要求l 掌握 外周血单个核细胞分离的方法外周血单个核细胞分离的方法l 掌握 细胞计数的方法细胞计数的方法 实验原理实验原理 外周血中细胞种类外周血中细胞种类 细胞细胞密度密度 红细胞和多形核白细胞 1.092 淋巴细胞和单核细胞淋巴细胞和单核细胞（PBMC） 1.075-1.092 血小板 1.030-1.035 葡聚糖葡聚糖泛影葡胺密度梯度离心法：泛影葡胺密度梯度离心法： 根据外周血中各种血细胞比重不同使不同密度的 细胞呈梯度分布，从而分离出PBMC。 实验方案实验方案抽取外周血抽取外周血分离分离单个核细胞（淋巴细胞单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）（和单核细胞）（PBMC） 细胞计数细胞计数 实验材料实验材料1. 肝素抗凝血肝素抗凝血2. Hanks液液3. 淋巴细胞分离液（淋巴细胞分离液（F-H)4. 水平离心机，加样枪水平离心机，加样枪5. 显微镜，吸管显微镜，吸管6. 细胞计数板，台盼蓝计数液细胞计数板，台盼蓝计数液 实验步骤实验步骤肝素抗凝静脉血1.5ml加加1.5ml Hanks液稀释液稀释置于2ml淋巴细胞分离液上( (交界液面：一定交界液面：一定不要打乱不要打乱) )稀释后的稀释后的抗凝血抗凝血淋巴细胞淋巴细胞分离液分离液注意注意：稀释的肝素抗凝血，：稀释的肝素抗凝血，沿管壁轻沿管壁轻轻叠加于轻叠加于分离液上，使两者形成一个分离液上，使两者形成一个清晰地界面。清晰地界面。用Hanks液洗、离心(1000rpm，5min)重复2次血浆血浆分层液分层液红细胞红细胞粒细胞粒细胞离心（2000rpm，25min）淋巴细胞与单淋巴细胞与单核细胞层核细胞层注意注意：细胞经离心分层：细胞经离心分层后，缓慢小心吸取，后，缓慢小心吸取，勿勿打破形成的细胞层打破形成的细胞层。 用Hanks液重悬细胞取等量细胞悬液与白细胞计数液或台盼兰计数液混合 取10ul于细胞计数板上 细胞计数细胞计数板细胞计数 原则：原则： 数上不数下，数左不数右数上不数下，数左不数右长长1mm宽宽1mm 结果计算结果计算22个大方格内细胞总数单个核细胞浓度（细胞数/ml)10104 410= =(稀释倍数稀释倍数）活细胞百分率= =活细胞数细胞总数100%细胞活力检测：（死细胞被染成蓝色，活细胞不着色） 细胞数量： 方法评价方法评价u 纯度在90%以上u 淋巴细胞约占90-95%u 细胞收获率可达80-90%u 活细胞百分率在95%以上密度梯度离心法分离外周血单个核细胞： 细胞计数的仪器血细胞分析仪，临床常用血细胞分析仪，临床常用装有自动显微镜观察系统装有自动显微镜观察系统自动细胞计数仪自动细胞计数仪 注意事项注意事项l请将请将带血带血的试管，吸管收集放置于实验室后的的试管，吸管收集放置于实验室后的红红色消毒盆色消毒盆中。中。l值日生负责收集加样枪，计数板，洗耳球，台盼值日生负责收集加样枪，计数板，洗耳球，台盼蓝计数液，蓝计数液，Hanks液。打扫实验室卫生。液。打扫实验室卫生。