第七章Genetic transformation in plant2目录转基因技术现状及其应用植物遗传转化技术载体构建遗传转化操作转基因鉴定3第三节载体构建4Transformation CassettesContains1. Gene of interest The coding region and its controlling elements2. Selectable marker Distinguishes transformed/untransformed plants3. Insertion sequences Aids Agrobacterium insertion5Lets Build A Complex CassettepB19hpc (Golden Rice Cassette)TLTRaphIV35SGt1psy35S rbcScrtlHygromycinResistancePhytoeneSynthasePhytoeneDesaturaseT-DNABorderT-DNABorderSelectableMarkerGene ofInterestGene ofInterestInsertionSequenceInsertionSequence61. gene of interest Based on what you are doing and what you want to getQualityStress toleranceSecondary metabolism7A cloning site for the gene of interest 82. Selectable marker Allows the transgenic plants to survive under stringent selection.Coding Region Gene that breaks down a toxic compound;non-transgenic plants dieex.: nptII kanamycin (bacterial antibiotic) resistance aphIV hygromycin (bacterial antibiotic) resistance Bar glufosinate (herbicide) resistance9Effect of Selectable MarkerTransgenic = Has Kan or Bar GenePlant grows in presenceof selective compoundPlant dies in presenceof selective compoundNon-transgenic = Lacks Kan or Bar GeneX10A selectable marker gene 抗性素类kanamycin resistance, nptII hygromycin resistance, hpt 除草剂类bar gene (for resistance to herbicide phosphinothricin)草胺膦 DHFR gene (for resistance to methotrexate)甲氨蝶呤ESPS gene (for resistance to glyfosate)11常用抗生素抗性酶基因新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)，抗卡那霉素潮霉素磷酸转移酶基因（HPT），抗潮霉素(hygromycin) 12 npt基因基因在植物基因工程中被广泛使用，来源于细菌转座子在植物基因工程中被广泛使用，来源于细菌转座子Tn5上的上的ahpA2。该基因编码氨基糖苷。该基因编码氨基糖苷-3-磷酸转移酶（磷酸转移酶（aminnoglycoside3-phosphotransferase）。）。Npt使使ATP分子上的分子上的-磷酸基转移到抗生素分子上，磷酸基转移到抗生素分子上，影响抗生素与核糖体亚基的结合，从而使氨基糖苷类影响抗生素与核糖体亚基的结合，从而使氨基糖苷类抗生素（抗生素（新霉素、卡那霉素新霉素、卡那霉素、庆大霉素、巴龙霉素和、庆大霉素、巴龙霉素和G418等）磷酸化失活。等）磷酸化失活。13HPT潮霉素是一种很强的细胞生长抑制剂，对许多种植物都产生很高的毒性。而潮霉素磷酸转移酶基因产物通过酶促磷酸化作用能使潮霉素失活，从而产生抗性。14常用抗除草剂基因 bar基因，产生PPT乙酰转移酶，抗Bialaphos或glufosinate草铵膦EPSP基因，产生5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，抗glyphosate草甘磷GOX基因，产生草甘膦氧化酶,降解草甘膦 153. Reporter genes: scorable marker gene具有两大特点（1）便于检测；（2）其表达产物及产物的类似功能在未转化的植物细胞内并不存在。optional, but very useful16Reporter genesbeta-glucuronidase activity (GUS) green fluorescent protein (GFP)chloramphenicolacetyl transferase activity luciferase activity 17 (1) GUS基因基因Gus基因编码-葡萄糖苷酸酶（ -glucuronidase，GUS），能催化许多-葡萄糖苷脂类物质的水解。能被许多葡萄糖苷诱导，即其表达受GUS底物的诱导。 18GUSGUS组织化学染色组织化学染色以X-gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚- -D-葡萄糖苷酸脂）为底物，在适宜条件下，底物进入检测组织。经氧化二聚作用形成5，5-二溴-4，4-二氯靛蓝染料，使具有GUS活性的产位呈现蓝色。19(2) 绿色荧光蛋白基因绿色荧光蛋白基因 GFP is a fluorescent protein isolated from Coelenterates, such as the Pacific jellyfish, Aequoria victoria, or from the sea pansy, Renilla reniformis.Osamu Shimomura was the first person to isolate GFP and to find out which part of GFP was responsible for its fluorescence. 20 gfpIts role is to transduce the blue chemiluminescence of the protein aequorin into green fluorescent light by energy transfer. The gene for GFP has been isolated and has become a useful tool for making chimeric proteins of GFP linked to other proteins where it functions as a fluorescent protein tag.是一种活体标记。能够接受荧光辐射并发射荧光。是一种活体标记。能够接受荧光辐射并发射荧光。GFP在原核或真核细胞中蓝光激发能发出绿光在原核或真核细胞中蓝光激发能发出绿光即发射团的形成无物种特异性，也不需要特异的即发射团的形成无物种特异性，也不需要特异的辅助因子。基于这一特点，辅助因子。基于这一特点，gfp基因作为新型标记基因作为新型标记或报告基因可以广泛应用于各种生物。或报告基因可以广泛应用于各种生物。2122gfp基因具有以下优点基因具有以下优点适用于各种生物的基因转化检测方法简便，只要有紫外光或蓝光照射，其表达产物即可发出绿色荧光便于活体检测，有利于活体内基因表达调控研究检测时可获得直观信息，有利于转基因植物安全性问题的研究及防范23荧光素酶基因 Luciferase 萤光素酶可催化生物体自身发光，荧火虫荧光素酶及细菌荧光素酶。萤火虫萤光素酶催化6-羟基喹啉类，脱羧后生成激活态的氧化萤光素；细菌萤光素酶以脂肪醛为底物，氧化成脂肪酸。萤光素酶检测的灵敏度高,而且没有背景，萤光素酶基因的最大特点是不损害植物,即在整体植物或离体器官内,基因产物都可测定。244. 启动子和终止子Promoter & Terminator作用:形成独立的表达单元，启动目的基因的表达，同时减少或避免干扰邻近基因表达 TLTRaphIV35SGt1psy35S rbcScrtlHygromycinResistancePhytoeneSynthasePhytoeneDesaturaseT-DNABorderT-DNABorderSelectableMarkerGene ofInterestGene ofInterest25常用的Promoter组成型表达启动子（constitutive promotor），也叫非特异性表达启动子特异性表达的启动子诱导型启动子其它26组成型表达启动子constitutive promoter也叫非特异性表达启动子特点:表达没有时间、空间、组织的特异性单子叶植物：来自玉米的Ubiquitin启动子和来源于水稻的Actin1 启动子双子叶植物：来自花椰菜花叶病毒CaMV(Cauliflower mosaic virus)35S启动子27特异性或诱导性启动子特异性表达的启动子 组织（花药）特异性表达启动子：TA29 种子特异性表达启动子：CG1诱导型启动子 光诱导表达: rbsS启动子 热诱导表达：hsp70启动子 损伤诱导启动子: wun1 启动子其它气孔特异、病害诱导特异28植物基因转化的受体植物基因转化的受体原生质体悬浮细胞胚性愈伤组织胚状体叶片切块其它受体：如花、子房、离体条件下的子叶、胚轴、茎段、根和体细胞胚、花粉等29第四节遗传转化操作30一、受体材料的选择受体是指用于接受外源DNA的转化材料。良好的植物基因转化受体系统应满足如下条件：高效稳定的再生能力；受体材料要有较高的遗传稳定性；外植体来源方便，如胚和其它器官等；对筛选剂敏感；转化率高31常用的受体材料有以下几大类型:1.愈伤组织再生系统外植体材料经过脱分化培养诱导形成愈伤组织，转化（带有目的基因质粒的农杆菌侵染），分化培养获得再生植株。优点：外植体来源广，繁殖快，易接受外源基因， 转化效率高。缺点：遗传稳定性差、嵌合体 因此需要连续的再生系统322.直接分化再生系统 外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定；缺点：材料局限，转化率低。3.原生质体再生系统原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早的再生受体系统之一。优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得基因型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多种转化系统；缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。334.胚状体再生系统是指具有胚胎性质的个体。优点：个体数目巨大、同质性好，接受外源基因能力强， 嵌合体少，易于培养、再生。缺点：技术含量高，多数植物不易获得胚状体。5.生殖细胞受体系统以生殖细胞如花粉粒、卵细胞等受体细胞进行外源基因转化的系统。一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、转化受体系统；二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法，花粉粒浸泡法，子房微针注射法等。34二、载体构建、转化流程图 外源基因 中间载体（pUC18，T-vector etc.） 启动子 筛选标记基因 中间表达载体(pBI121, pCAMBIA etc.) 转化载体系统中间表达载体 农杆菌（co-integrated vector/ binary vector ) 转化植物组织 （愈伤，胚轴，子叶等） 再生植株35目的基因的克隆与鉴定目的基因的克隆与鉴定转化载体的构建转化载体的构建E.ColiE.Coli转化，质粒转化，质粒抽提与鉴定抽提与鉴定农杆菌的转化与活化农杆菌的转化与活化外植体制备外植体制备浸浸 染染选择培养选择培养共培养共培养移栽移栽继代繁殖继代繁殖分子检测分子检测生理检测生理检测纯化纯化361、克隆目的基因37Recombinant DNA Is Formed by Splicing DNA From a Vector Into Host DNA38392. 农杆菌转化与活化农杆菌转化与活化40挑单克隆挑单克隆414243测OD60044收集细胞收集细胞45用液体MS培养基重悬细胞46将预培养的外植体放入菌液中共培养47100rpm,30min48取出外植体在无菌滤纸上吸干菌液49共培养Co-culture50在含有选择压力的培养基上诱导细胞分化，形成转化芽51诱导芽生长52生根，形成转化植株53Plant Tissue CultureA Requirement for Transgenic DevelopmentA plant part Is culturedCallusgrowsShootsdevelopShoots are rooted;plant grows to maturity