会计学1核酸的分离核酸的分离(fnl)纯化纯化第一页，共153页。 核酸的结构与功能是分子水平生命活动的基础； 内源基因的突变(tbin)、表达及调控的异常和外源致病基因的侵入是人类疾病发生、发展的根源。第五章第五章 核酸的分离核酸的分离(fnl)(fnl)纯化纯化第1页/共152页第二页，共153页。DNADNA、RNARNA是是生生物物体体中中最最重重要要(zhngyo)(zhngyo)的的核核酸酸分分子子，是分子生物学和分子诊断的研究对象。是分子生物学和分子诊断的研究对象。 DNADNA、RNARNA的的分分离离纯纯化化是是分分子子生生物物学学研研究究及及对对疾疾病病进进行分子诊断的最基础工作。行分子诊断的最基础工作。第五章第五章 核酸的分离核酸的分离(fnl)(fnl)纯化纯化第2页/共152页第三页，共153页。核酸分离纯化的原则核酸分离纯化的原则一、一、 保持保持(boch)(boch)核酸一级结构的完整性核酸一级结构的完整性二二 、尽可能提高核酸制品的纯度、尽可能提高核酸制品的纯度第五章第五章 核酸的分离核酸的分离(fnl)(fnl)纯化纯化第3页/共152页第四页，共153页。提取提取(tq)DNA(tq)DNA总的原总的原则则1 1 1 1 保证核酸一级结构的完整性；保证核酸一级结构的完整性；保证核酸一级结构的完整性；保证核酸一级结构的完整性；2 2 2 2 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污分子的污分子的污分子的污染应降低到最低程度染应降低到最低程度染应降低到最低程度染应降低到最低程度(chngd)(chngd)(chngd)(chngd)；3 3 3 3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；过高浓度的金属离子；过高浓度的金属离子；过高浓度的金属离子；4 4 4 4 其他核酸分子，如其他核酸分子，如其他核酸分子，如其他核酸分子，如RNARNARNARNA，也应尽量去除。，也应尽量去除。，也应尽量去除。，也应尽量去除。第4页/共152页第五页，共153页。第一节第一节 核酸核酸(h sun)(h sun)分离纯化的设计及原则分离纯化的设计及原则第二节第二节 基因组基因组DNADNA的分离的分离(fnl)(fnl)纯化纯化第三节第三节 质粒质粒DNADNA的提取的提取(tq)(tq)与纯化与纯化第四节第四节 RNARNA的分离纯化的分离纯化第五章第五章第五章第五章 核酸的分离纯化核酸的分离纯化核酸的分离纯化核酸的分离纯化第5页/共152页第六页，共153页。第一节第一节 核酸分离核酸分离(fnl)(fnl)纯化的设计纯化的设计及原则及原则第6页/共152页第七页，共153页。一、材料一、材料(cilio)与方法的选择与方法的选择二、技术二、技术(jsh)路线的设路线的设计计三、核酸三、核酸(hsun)的鉴定与的鉴定与保存保存第一节第一节 核酸分离纯化的设计及原则核酸分离纯化的设计及原则第7页/共152页第八页，共153页。一、材料一、材料(cilio)与方法的选择与方法的选择（一） 材料(cilio)与方法的选择（二） 选择(xunz)原则 第8页/共152页第九页，共153页。（一）（一）（一）（一） 材料材料材料材料(cilio)(cilio)(cilio)(cilio)与方法的选与方法的选与方法的选与方法的选择择择择 不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度可能有不同的要求可能有不同的要求可能有不同的要求可能有不同的要求需考虑制备核酸所需的时间与成本需考虑制备核酸所需的时间与成本需考虑制备核酸所需的时间与成本需考虑制备核酸所需的时间与成本应选择应选择应选择应选择(xu(xu nz)nz)安全的试剂与制备方案安全的试剂与制备方案安全的试剂与制备方案安全的试剂与制备方案 一、材料与方法一、材料与方法(fngf)的选择的选择第9页/共152页第十页，共153页。 1 1、保持核酸碱基序列的完整性、保持核酸碱基序列的完整性 2 2、尽尽量量(jnling)(jnling)清清除除其其它它分分子子的的污污染染，保保证证核核酸纯度酸纯度 3 3、保持核酸的完整性、保持核酸的完整性 应应尽尽量量(jnling)(jnling)简简化化分分离离纯纯化化步步骤骤，缩缩短短提取时间提取时间 尽尽量量(jnling)(jnling)避避免免各各种种有有害害因因素素对对核核酸酸的的破坏破坏 （二） 选择(xunz)原则一、材料与方法一、材料与方法(fngf)的选择的选择第10页/共152页第十一页，共153页。二、技术路线二、技术路线(lxin)的设的设计计（一）核酸(h sun)的释放（二）核酸的分离(fnl)与纯化（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤第11页/共152页第十二页，共153页。（一）核酸（一）核酸（一）核酸（一）核酸(h sun)(h sun)(h sun)(h sun)的的的的释放释放释放释放 DNADNA和和和和RNARNA均均均均位位位位于于于于细细细细胞胞胞胞内内内内（病病病病毒毒毒毒除除除除外外外外），因因因因此此此此(ync(ync ) )核核核核酸酸酸酸分分分分离离离离与与与与纯纯纯纯化化化化的的的的第第第第一一一一步步步步即即即即是是是是裂裂裂裂解解解解细胞、释放核酸。细胞、释放核酸。细胞、释放核酸。细胞、释放核酸。二、技术路线二、技术路线(lxin)的设的设计计第12页/共152页第十三页，共153页。表表表表- - - - 各种组织细胞破碎各种组织细胞破碎各种组织细胞破碎各种组织细胞破碎(p su)(p su)(p su)(p su)方法方法方法方法细胞破碎方法 应用 机械法1匀浆法机体软组织2捣碎法动物韧性组织3研磨法细菌、酵母 物理法1超声法细胞混悬液2反复冻融法培养细胞3冷热交替法细菌、病毒4低渗裂解红细胞 化学法1有机溶剂细菌、酵母2去垢剂组织、培养细胞3酶解法细菌、酵母第13页/共152页第十四页，共153页。核酸分子核酸分子(fnz)抽提抽提的技术设计的技术设计核酸核酸(h sun)(h sun)的释放：的释放： 破裂细胞破裂细胞 释放核酸释放核酸(h sun)(h sun) 机械法与非机械法（非机械法中溶胞法是应机械法与非机械法（非机械法中溶胞法是应 用最广泛的方法）用最广泛的方法）核酸核酸(h sun)(h sun)的分离与纯化：的分离与纯化： 将含有核酸将含有核酸(h sun)(h sun)分子复杂复合物中，将核酸分子复杂复合物中，将核酸(h sun)(h sun)与其与其 他物质分离他物质分离 非核酸非核酸(h sun)(h sun)的大分子污染物（蛋白质、多糖的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂和脂 类分子）、非需要的核酸类分子）、非需要的核酸(h sun)(h sun)分子、试剂和分子、试剂和溶液溶液第14页/共152页第十五页，共153页。第15页/共152页第十六页，共153页。第16页/共152页第十七页，共153页。 应该清除的杂质主要包括三部分应该清除的杂质主要包括三部分应该清除的杂质主要包括三部分应该清除的杂质主要包括三部分 1 1、非核酸的大分子、非核酸的大分子、非核酸的大分子、非核酸的大分子(fnz(fnz ) )污染物：蛋白质、多糖及脂类污染物：蛋白质、多糖及脂类污染物：蛋白质、多糖及脂类污染物：蛋白质、多糖及脂类 物质等物质等物质等物质等 2 2、非需要的核酸分子、非需要的核酸分子、非需要的核酸分子、非需要的核酸分子(fnz(fnz ) )：分离某一特定的核酸分子：分离某一特定的核酸分子：分离某一特定的核酸分子：分离某一特定的核酸分子(fnz(fnz ) ) 时，其它的核酸分子时，其它的核酸分子时，其它的核酸分子时，其它的核酸分子(fnz(fnz ) )皆为杂质皆为杂质皆为杂质皆为杂质 3 3、加入的有机溶剂和某些金属离子、加入的有机溶剂和某些金属离子、加入的有机溶剂和某些金属离子、加入的有机溶剂和某些金属离子（二）核酸(h sun)的分离与纯化二、技术二、技术(jsh)路线的设计路线的设计第17页/共152页第十八页，共153页。（三）核酸的浓缩、沉淀（三）核酸的浓缩、沉淀（三）核酸的浓缩、沉淀（三）核酸的浓缩、沉淀(chndin)(chndin)(chndin)(chndin)与洗涤与洗涤与洗涤与洗涤n n沉淀是浓缩核酸的最常用的方法沉淀是浓缩核酸的最常用的方法n n常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁及氯化镁n n常用的有机溶剂则为乙醇、异丙醇和聚乙二醇常用的有机溶剂则为乙醇、异丙醇和聚乙二醇n n核酸沉淀常常含有少量核酸沉淀常常含有少量(sholing)(sholing)共沉淀的盐，需用共沉淀的盐，需用70%70%75%75%的乙醇洗涤去除的乙醇洗涤去除二、技术二、技术(jsh)路线的设路线的设计计第18页/共152页第十九页，共153页。三、核酸三、核酸(hsun)的鉴定与的鉴定与保存保存（一）核酸(hsun)的鉴定（二）核酸(hsun)的保存第19页/共152页第二十页，共153页。（一）核酸（一）核酸(hsun)的的鉴定鉴定1、浓度(nngd)鉴定2、纯度(chnd)鉴定3、完整性鉴定三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存第20页/共152页第二十一页，共153页。 紫外分光光度法：该法是基于核酸分子紫外分光光度法：该法是基于核酸分子(fnz)(fnz) 中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收 紫外线，其最大吸收波长为紫外线，其最大吸收波长为260nm260nm。 1、浓度(nngd)鉴定三、核酸三、核酸(hsun)的鉴定的鉴定与保存与保存第21页/共152页第二十二页，共153页。 各种各种( zhn)( zhn)碱基的紫外吸收光谱碱基的紫外吸收光谱三、核酸的鉴定三、核酸的鉴定(jindng)与保存与保存第22页/共152页第二十三页，共153页。 荧荧光光光光度度法法：核核酸酸的的荧荧光光染染料料溴溴化化乙乙锭嵌锭嵌 入入碱碱基基平平面面后后，本本身身无无荧荧光光的的核核酸酸在在UVUV激激 发发下下发发出出(fch)(fch)红红色色荧荧光光，且且荧荧光光强强度度的积分与的积分与 溶液中核酸的含量呈正比。溶液中核酸的含量呈正比。三、核酸三、核酸(hsun)的鉴定的鉴定与保存与保存第23页/共152页第二十四页，共153页。EB与DNA的结合(jih)第24页/共152页第二十五页，共153页。 紫外分光光度法：该法主要通过紫外分光光度法：该法主要通过紫外分光光度法：该法主要通过紫外分光光度法：该法主要通过A260A260与与与与A280 A280 的比值来判定有无蛋白质的污染，比值升高与的比值来判定有无蛋白质的污染，比值升高与的比值来判定有无蛋白质的污染，比值升高与的比值来判定有无蛋白质的污染，比值升高与 降低降低降低降低(jingd)(jingd)均提示不纯。均提示不纯。均提示不纯。均提示不纯。在在在在TETE缓冲液中，纯缓冲液中，纯缓冲液中，纯缓冲液中，纯DNADNA的的的的A260/A280A260/A280 纯纯纯纯RNARNA的的的的A260/A280A260/A280比值为比值为比值为比值为2、纯度(chnd)鉴定三、核酸三、核酸(hsun)的鉴定的鉴定与保存与保存第25页/共152页第二十六页，共153页。1. DNA1. DNA或或RNARNA的定量的定量OD260OD260相当于相当于50g/ml50g/ml双链双链DNADNA40g/ml40g/ml单链单链DNADNA（或（或RNARNA）20g/ml20g/ml寡核苷酸寡核苷酸2.2.判断核酸样品判断核酸样品(yngpn)(yngpn)的纯度的纯度DNADNA纯品纯品: OD260/OD280 : OD260/OD280 RNARNA纯品纯品: OD260/OD280 : OD260/OD280 三、核酸三、核酸(hsun)的鉴定与的鉴定与保存保存第26页/共152页第二十七页，共153页。浓度浓度(nngd)鉴定鉴定紫外分光光度法：测定紫外分光光度法：测定紫外分光光度法：测定紫外分光光度法：测定DNADNADNADNA在在在在A260nmA260nmA260nmA260nm的光吸收值。的光吸收值。的光吸收值。的光吸收值。 如计算如计算如计算如计算DNADNADNADNA浓度浓度浓度浓度 A260 A260 A260 A260稀释倍数稀释倍数稀释倍数稀释倍数(bish)50(bish)50(bish)50(bish)50 g/ml g/ml g/ml g/mlug/mlug/mlug/mlug/ml的核酸溶液。的核酸溶液。的核酸溶液。的核酸溶液。(A值等于(dngy)1时，相当于50g/ml双链DNA， 40g/ml单链DNA或RNA，20 g/ml单链寡核苷酸）第27页/共152页第二十八页，共153页。n n 荧光光度法：用荧光光度法：用EBEB等荧光染料等荧光染料(r (r nlio)nlio)示踪的核酸电示踪的核酸电n n 泳结果可判定核酸制品的纯度。泳结果可判定核酸制品的纯度。DNADNA分子较分子较n n RNA RNA大得多，电泳迁移率低。大得多，电泳迁移率低。三、核酸三、核酸(hsun)的鉴定与的鉴定与保存保存第28页/共152页第二十九页，共153页。 荧光光度法荧光光度法荧光光度法荧光光度法 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度出荧光，且荧光强度出荧光，且荧光强度出荧光，且荧光强度(qingd)(qingd)(qingd)(qingd)与核酸含量呈正与核酸含量呈正与核酸含量呈正与核酸含量呈正比。比。比。比。 适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng1-5ng1-5ng1-5ng）第29页/共152页第三十页，共153页。 琼脂糖凝胶电泳法：琼脂糖凝胶电泳法： 以以EBEB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果可为示踪剂的核酸凝胶电泳结果可判定判定(pndng)(pndng)核酸制品的完整性。基因组核酸制品的完整性。基因组DNADNA片段片段的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果发生降解，电泳图呈拖尾状。发生降解，电泳图呈拖尾状。3、完整性鉴定(jindng)三、核酸三、核酸(hsun)的鉴定与的鉴定与保存保存第30页/共152页第三十一页，共153页。DNADNA片段片段(pin dun)(pin dun)的降解的降解三、核酸三、核酸(hsun)的鉴定的鉴定与保存与保存第31页/共152页第三十二页，共153页。n n完完整整(wnzhng)(wnzhng)或或降降解解很很少少的的总总RNARNA电电泳泳图图谱谱中中，三三条条带带荧荧光光强强度度积积分分应应呈呈特特定定的的比比值值，沉沉降降系系数数大大的的核核酸酸区区带带，电电泳泳迁迁移移低低，荧荧光光强强度度积积分分高高；反反之之，分分子子量量小，电泳迁移率高，荧光强度积分低。小，电泳迁移率高，荧光强度积分低。n n 三、核酸三、核酸(hsun)的鉴定的鉴定与保存与保存第32页/共152页第三十三页，共153页。n n 一般而言，28S（23S）RNA的荧光强度约为18S（16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解(jin ji)。若 n n 在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA n n 的污染。三、核酸的鉴定三、核酸的鉴定(jindng)与保存与保存第33页/共152页第三十四页，共153页。 总总RNARNA电泳图谱电泳图谱三、核酸的鉴定三、核酸的鉴定(jindng)与保存与保存第34页/共152页第三十五页，共153页。正常时，正常时，28S RNA的荧光强度的荧光强度(qingd)约为约为18S RNA的的2倍，倍，否则提示否则提示RNA的的降解降解第35页/共152页第三十六页，共153页。（二）核酸(hsun)的保存1、DNA的储存(chcn)2、RNA的储存(chcn)三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存第36页/共152页第三十七页，共153页。1 1 1 1、短期贮存：、短期贮存：、短期贮存：、短期贮存： 4 4 4 4或或或或-20-20-20-20存放于存放于存放于存放于TETETETE（tristristristris和和和和EDTAEDTAEDTAEDTA）缓冲液中。）缓冲液中。）缓冲液中。）缓冲液中。 TETETETE缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液的的的的PHPHPHPH与与与与DNA DNA DNA DNA 贮贮贮贮存存存存有有有有关关关关，PHPHPHPH为为为为8 8 8 8时时时时，可可可可减减减减少少少少DNADNADNADNA脱脱脱脱氨氨氨氨反反反反应，应，应，应，PHDNAPHDNAPHDNAPHDNA容易变性。容易变性。容易变性。容易变性。2 2 2 2、长期贮存：、长期贮存：、长期贮存：、长期贮存： TETETETE缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液中中中中-70-70-70-70保保保保存存存存数数数数年年年年；在在在在DNADNADNADNA溶溶溶溶液液液液中中中中加加加加一一一一滴滴滴滴氯氯氯氯仿仿仿仿可可可可有有有有效效效效防止防止防止防止(fngzh)(fngzh)(fngzh)(fngzh)细菌和核酸的污染。细菌和核酸的污染。细菌和核酸的污染。细菌和核酸的污染。三、核酸三、核酸(hsun)的鉴定的鉴定与保存与保存（二）核酸(hsun)的保存_DNA的储存第37页/共152页第三十八页，共153页。2 2 2 2、RNARNARNARNA的储存的储存的储存的储存(chcn)(chcn)(chcn)(chcn) RNA溶于mol/L的NaAc溶液(rngy)或三蒸水中，-70保存。如用DEPC处理过的水溶解RNA或者在RNA溶液(rngy)中加入RNasin或VRC，保存时间可延长。三、核酸的鉴定三、核酸的鉴定(jindng)与保存与保存第38页/共152页第三十九页，共153页。第二节第二节 真核基因组真核基因组DNADNA的分离的分离(fnl)(fnl)纯化纯化第39页/共152页第四十页，共153页。生物体组织细胞玻棒缠绕法酚抽提法基因组 DNA粗品PFGE分离特定的DNA片段AGE分离PAGE分离乙醇沉淀洗涤基因组DNA纯品精分离 粗分离前处理离子交换层析纯化有机溶剂抽提细胞裂解蛋白质变性沉淀降解DNA释放甲酰胺解聚法 哺乳动物基因组DNA分离纯化(chn hu)的一般技术路线第二节第二节 真核基因组真核基因组DNADNA的分离的分离(fnl)(fnl)纯化纯化第40页/共152页第四十一页，共153页。第二节第二节 真核基因组真核基因组DNADNA的分离的分离(fnl)(fnl)纯化纯化一、酚抽提法(t f)二、甲酰胺解聚法三、玻棒缠绕(chnro)法四、其它方法五、DNA片段的纯化六、DNA片段的回收第41页/共152页第四十二页，共153页。DNA酚抽提法(t f)示意图 一、酚抽提法(t f)第42页/共152页第四十三页，共153页。 一、酚抽提法一、酚抽提法(t f)n n该该法法于于19761976年年由由StaffordStafford及及其其同同事事创创立立，现现在在使使用用的的是是改进的方法改进的方法n n以以含含EDTAEDTA、SDSSDS及及RNaseRNase裂裂解解(li (li ji)ji)缓缓冲冲液液裂裂解解(li (li ji)ji)细胞细胞n n经经蛋蛋白白酶酶K K处处理理后后，用用的的TrisTris饱饱和和酚酚抽抽提提DNADNA，获获得得DNADNA粗制品粗制品第43页/共152页第四十四页，共153页。第44页/共152页第四十五页，共153页。DNADNA样品样品(yngpn)(yngpn)准备准备n n 常见的标本常见的标本(biobn)(biobn)：n n 血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等n n 生物组织：生物组织：n n 最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存 n n 70 70或液氮或液氮第45页/共152页第四十六页，共153页。主要试剂的作用：主要试剂的作用： EDTA：1 二价二价(r ji)金属螯金属螯合剂，抑制核酸酶；合剂，抑制核酸酶； 2 降低细胞膜的稳定性降低细胞膜的稳定性第46页/共152页第四十七页，共153页。SDSSDS的作用：的作用：1 1 溶解膜蛋白和脂肪，从而是溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂；细胞膜破裂；溶解核膜和核小体，使其解聚，溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸将核酸 释放出来；释放出来；3 3 对对RNARNA、DNADNA酶有抑制作用；酶有抑制作用；4 4 与蛋白质形成与蛋白质形成(xngchng)R-O-SO3 .R(xngchng)R-O-SO3 .R蛋白质复合物，使蛋白质变蛋白质复合物，使蛋白质变性。性。第47页/共152页第四十八页，共153页。蛋白酶蛋白酶K K：水解蛋白质的作用，消化水解蛋白质的作用，消化(xiohu)DNA(xiohu)DNA酶和细胞中的蛋酶和细胞中的蛋白质。白质。蛋白酶蛋白酶K K与其他蛋白酶相比，它与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能具有更强的水解能力，而且在力，而且在SDSSDS、EDTAEDTA存在时仍存在时仍保持较高活性，可保持较高活性，可同时使用。同时使用。第48页/共152页第四十九页，共153页。n n酚可以酚可以酚可以酚可以(ky)(ky)(ky)(ky)使蛋白质变性沉淀、抑制使蛋白质变性沉淀、抑制使蛋白质变性沉淀、抑制使蛋白质变性沉淀、抑制DNADNADNADNA酶活性。酶活性。酶活性。酶活性。n n的的的的TrisTrisTrisTris溶液可以溶液可以溶液可以溶液可以(ky)(ky)(ky)(ky)似的抽提出的似的抽提出的似的抽提出的似的抽提出的DNADNADNADNA进入水相，进入水相，进入水相，进入水相，减少在蛋白质层滞留。减少在蛋白质层滞留。减少在蛋白质层滞留。减少在蛋白质层滞留。n n在酚或酚在酚或酚在酚或酚在酚或酚- - - -氯仿中加入少许的异戊醇，是可以氯仿中加入少许的异戊醇，是可以氯仿中加入少许的异戊醇，是可以氯仿中加入少许的异戊醇，是可以(ky)(ky)(ky)(ky)减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。保持分相的稳定性。保持分相的稳定性。保持分相的稳定性。第49页/共152页第五十页，共153页。为什么苯酚为什么苯酚为什么苯酚为什么苯酚(bn fn)(bn fn)(bn fn)(bn fn)要重蒸饱和后才能用于要重蒸饱和后才能用于要重蒸饱和后才能用于要重蒸饱和后才能用于DNADNADNADNA的分离？的分离？的分离？的分离？ 苯酚在空气中经常被氧化生成醌，苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由基，直接用于它能够产生自由基，直接用于DNA分离，会使磷酸二酯键断裂，分离，会使磷酸二酯键断裂，造成造成DNA降解。氧化苯酚需要经降解。氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去过高温重蒸以除去(ch q)氧化物，氧化物，并用并用Ttis-Hcl饱和酚，并调节至中饱和酚，并调节至中性。另外使用饱和酚减少酚吸收性。另外使用饱和酚减少酚吸收更多的更多的DNA溶液，降低溶液，降低DNA的损的损失率。失率。第50页/共152页第五十一页，共153页。DNADNADNADNA的沉淀的沉淀的沉淀的沉淀(chndin)(chndin)(chndin)(chndin) 沉淀前往往加入沉淀前往往加入沉淀前往往加入沉淀前往往加入NaClNaCl等盐离子等盐离子等盐离子等盐离子(lz(lz ) )，作用是中和核酸分子表面的，作用是中和核酸分子表面的，作用是中和核酸分子表面的，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。负电荷，有助于分子之间的聚集。负电荷，有助于分子之间的聚集。负电荷，有助于分子之间的聚集。 无水乙醇可以吸收分子之间的水，使无水乙醇可以吸收分子之间的水，使无水乙醇可以吸收分子之间的水，使无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNADNA沉淀析出，无水乙醇使沉淀析出，无水乙醇使沉淀析出，无水乙醇使沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，可以减少用前冰冻，可以减少用前冰冻，可以减少用前冰冻，可以减少DNADNA沉淀析出过程释放热量对沉淀析出过程释放热量对沉淀析出过程释放热量对沉淀析出过程释放热量对DNADNA的损伤。的损伤。的损伤。的损伤。 除了使除了使除了使除了使DNADNA沉淀外，还可以溶解少量的小的沉淀外，还可以溶解少量的小的沉淀外，还可以溶解少量的小的沉淀外，还可以溶解少量的小的RNARNA分子。分子。分子。分子。第51页/共152页第五十二页，共153页。DNADNA的浓缩的浓缩(nn su)(nn su)1 1、固固体体(gt)(gt)聚聚乙乙二二醇醇（PEGPEG）浓浓缩缩：用用透透析析袋袋外外敷敷PEGPEG至合适量。至合适量。2 2、丁丁醇醇抽抽提提浓浓缩缩：DNADNA溶溶液液中中水水可可分分配配到到正正丁丁醇醇或或仲仲丁丁醇醇，但但DNADNA不不会会。因因此此重重复复几几次次可可显显著著减减少少DNADNA体积。体积。第52页/共152页第五十三页，共153页。 DNA的检测的检测(jin c)溴乙锭染色溴乙锭染色 ：在：在254nm254nm紫外光下检测，如需回收紫外光下检测，如需回收最好在最好在300nm300nm紫外光下割胶，否则易使嘌呤紫外光下割胶，否则易使嘌呤(piolng)(piolng)断链，在断链，在1cm1cm宽带上可检到宽带上可检到10ng 10ng DNADNA。 银染法银染法 ：Ag+Ag+与与DNADNA形成复合物，在甲醛还原下形成复合物，在甲醛还原下可染成黑褐色，灵敏度高可染成黑褐色，灵敏度高200200倍，但不能回收。倍，但不能回收。第53页/共152页第五十四页，共153页。二、甲酰胺解聚法二、甲酰胺解聚法二、甲酰胺解聚法二、甲酰胺解聚法n n1987198719871987年年年年KupiecKupiecKupiecKupiec等等等等报报报报道道道道了了了了甲甲甲甲酰酰酰酰胺胺胺胺解解解解聚聚聚聚法法法法，其其其其中中中中细细细细胞胞胞胞裂裂裂裂解解解解(li (li (li (li ji)ji)ji)ji)和和和和蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质水水水水解解解解步步步步骤骤骤骤同同同同酚酚酚酚抽抽抽抽提提提提法法法法，但但但但不不不不进进进进行酚的抽提。行酚的抽提。行酚的抽提。行酚的抽提。第54页/共152页第五十五页，共153页。破碎细胞同上，然后用高浓度破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与甲酰胺解聚蛋白质与DNADNA的结的结合，再透析获得合，再透析获得DNADNA。高浓度。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与甲酰胺可以裂解蛋白质与DNADNA的复合物，可以使蛋白质变性。的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤减少了酚多次抽提的步骤甲酰胺解聚法适用于从标本中甲酰胺解聚法适用于从标本中制备制备(zhbi)(zhbi)高分子量的高分子量的DNADNA样品。可得样品。可得DNA 200kbDNA 200kb左右左右第55页/共152页第五十六页，共153页。 三、玻棒缠绕三、玻棒缠绕(chnro)法法n n现现 今今 使使 用用 (shyng)(shyng)的的 缠缠 绕绕 法法 是是 以以 19871987年年BowtellBowtell的方法经改进而来。的方法经改进而来。第56页/共152页第五十七页，共153页。DNA玻棒缠绕(chnro)法示意图 三、玻棒缠绕(chnro)法第57页/共152页第五十八页，共153页。四、其它四、其它四、其它四、其它(qt)(qt)方法方法方法方法 常常用用的的一一些些分分子子诊诊断断技技术术，并并不不需需要要高高分分子子量量的的DNADNA样样品品，因因此此步步骤骤简简化化、操操作作简简便便的的DNADNA快快速速提提取取法法运运用用而而生生并并广广泛使用泛使用 1. 1.异异丙丙醇醇沉沉淀淀法法: :仅仅用用二二倍倍容容积积(rngj)(rngj)异异丙丙醇醇替替代代乙乙醇醇，可可去去除小分子除小分子RNARNA（在异丙醇中可溶状态）（在异丙醇中可溶状态） 2. 2.玻璃珠吸附法玻璃珠吸附法第58页/共152页第五十九页，共153页。五、五、五、五、 DNA DNA DNA DNA片段片段片段片段(pin dun)(pin dun)(pin dun)(pin dun)的纯化的纯化的纯化的纯化n n常用的纯化(chn hu)方法包括有机溶剂抽提法与商品化的 柱 层 析 法 （ column chromatography）第59页/共152页第六十页，共153页。DNA柱层析法柱层析法示意图示意图五、五、 DNA DNA片段片段(pin dun)(pin dun)的纯化的纯化第60页/共152页第六十一页，共153页。六、六、六、六、 DNA DNA DNA DNA片段片段片段片段(pin dun)(pin dun)(pin dun)(pin dun)的回收的回收的回收的回收原则与要求原则与要求: : 1. 1.提高片段的回收率；提高片段的回收率； 2. 2.清除回收的清除回收的DNADNA样品样品(yngpn)(yngpn)中的杂质。中的杂质。第61页/共152页第六十二页，共153页。六、六、六、六、 DNA DNA DNA DNA片段片段片段片段(pin (pin (pin (pin dun)dun)dun)dun)的回收的回收的回收的回收（二） 从聚丙烯酰胺凝胶回收(hushu)DNA片段（一） 从琼脂糖凝胶中回收(hushu)DNA片段第62页/共152页第六十三页，共153页。1.1.二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基- -纤维素膜插片电泳法纤维素膜插片电泳法2.2.电泳洗脱法电泳洗脱法3.3.冷冻冷冻(lngdng)(lngdng)挤压法挤压法4.4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法 （一）（一）（一）（一） 从琼脂糖凝胶中回收从琼脂糖凝胶中回收从琼脂糖凝胶中回收从琼脂糖凝胶中回收(hushu)DNA(hushu)DNA片段片段片段片段六、六、 DNA DNA片段片段(pin dun)(pin dun)的回收的回收第63页/共152页第六十四页，共153页。电泳到电泳到电泳到电泳到DEAE-DEAE-DEAE-DEAE-纤维素膜纤维素膜纤维素膜纤维素膜 ： DEAE DEAE DEAE DEAE是一种是一种是一种是一种(y zhn)(y zhn)(y zhn)(y zhn)阴离子交换纤维素，可以阴离子交换纤维素，可以阴离子交换纤维素，可以阴离子交换纤维素，可以吸附带有负电荷的吸附带有负电荷的吸附带有负电荷的吸附带有负电荷的DNADNADNADNA分子。分子。分子。分子。 在所需条带前插入在所需条带前插入在所需条带前插入在所需条带前插入DEAT-DEAT-DEAT-DEAT-纤维素膜，继续电泳至纤维素膜，继续电泳至纤维素膜，继续电泳至纤维素膜，继续电泳至条带条带条带条带DNADNADNADNA都到膜上，取出洗下。都到膜上，取出洗下。都到膜上，取出洗下。都到膜上，取出洗下。 500bp-5kb 500bp-5kb 500bp-5kb 500bp-5kb的的的的DNADNADNADNA片段回收率较好，纯度高。但不片段回收率较好，纯度高。但不片段回收率较好，纯度高。但不片段回收率较好，纯度高。但不适用于分子量超过适用于分子量超过适用于分子量超过适用于分子量超过10kb10kb10kb10kb和单链和单链和单链和单链DNADNADNADNA。 第64页/共152页第六十五页，共153页。透析袋电洗脱透析袋电洗脱 ： 切下条带的琼脂糖凝胶，放透析袋内，加缓切下条带的琼脂糖凝胶，放透析袋内，加缓冲液后继续电泳，冲液后继续电泳，DNADNA出胶后进行出胶后进行(jnxng)(jnxng)抽提抽提DNADNA回收。回收。 第65页/共152页第六十六页，共153页。低熔点琼脂糖凝胶：低熔点琼脂糖凝胶：低熔点琼脂糖凝胶：低熔点琼脂糖凝胶： 切下胶，加热到切下胶，加热到切下胶，加热到切下胶，加热到65656565熔化熔化熔化熔化(rnghu)(rnghu)(rnghu)(rnghu)胶，然后抽胶，然后抽胶，然后抽胶，然后抽提回收提回收提回收提回收DNADNADNADNA。 方法：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂方法：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂方法：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂方法：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂水解酶等。水解酶等。水解酶等。水解酶等。 第66页/共152页第六十七页，共153页。玻璃珠洗脱法：将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化钠溶玻璃珠洗脱法：将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化钠溶玻璃珠洗脱法：将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化钠溶玻璃珠洗脱法：将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化钠溶液，然后加入液，然后加入液，然后加入液，然后加入(jir)(jir)(jir)(jir)玻璃珠结合玻璃珠结合玻璃珠结合玻璃珠结合DNADNADNADNA，经分离、，经分离、，经分离、，经分离、洗涤后，在低盐缓冲液中将洗涤后，在低盐缓冲液中将洗涤后，在低盐缓冲液中将洗涤后，在低盐缓冲液中将DNADNADNADNA洗脱下。洗脱下。洗脱下。洗脱下。第67页/共152页第六十八页，共153页。 琼脂水解酶：将含琼脂水解酶：将含DNADNA的凝胶进行的凝胶进行消化，琼脂糖水解成二糖，释放消化，琼脂糖水解成二糖，释放DNADNA，后使用，后使用(shyng)(shyng)酚抽提方酚抽提方法回收法回收DNA DNA 第68页/共152页第六十九页，共153页。（二）（二）（二）（二） 从聚丙烯酰胺凝胶回收从聚丙烯酰胺凝胶回收从聚丙烯酰胺凝胶回收从聚丙烯酰胺凝胶回收(hushu)DNA(hushu)DNA(hushu)DNA(hushu)DNA片段片段片段片段 聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶中中回回收收DNADNA的的标标准准方方法法是是压压碎碎与与浸浸泡泡法法。虽虽费费时时但但操操作作(cozu)(cozu)简简单单，是是小小片片段段DNADNA回收的较好方法。回收的较好方法。六、六、 DNA DNA片段片段(pin dun)(pin dun)的回收的回收第69页/共152页第七十页，共153页。n n至至今今尚尚无无一一种种方方法法既既能能有有效效回回收收DNADNA大大片片段段或或微微量量的的DNADNA片片段段，又又能能同同时时回回收收几几种种DNADNA片片段段并并有效清除有效清除(qngch)(qngch)凝胶中酶促反应抑制剂。凝胶中酶促反应抑制剂。六、六、 DNA DNA片段片段(pin (pin dun)dun)的回收的回收第70页/共152页第七十一页，共153页。第三节第三节 质粒质粒DNADNA的提取的提取(tq)(tq)与纯化与纯化 第71页/共152页第七十二页，共153页。质粒简介质粒简介质粒简介质粒简介(ji(ji n ji)n ji)质粒是细菌内独立质粒是细菌内独立质粒是细菌内独立质粒是细菌内独立(dl)(dl)(dl)(dl)于染色体并能自我复制的小于染色体并能自我复制的小于染色体并能自我复制的小于染色体并能自我复制的小环状环状环状环状DNADNADNADNA分子分子分子分子 其大小范围从其大小范围从其大小范围从其大小范围从lkblkblkblkb至至至至200kb200kb200kb200kb以上不等以上不等以上不等以上不等 已经在形形色色的细菌类群中发现质粒已经在形形色色的细菌类群中发现质粒已经在形形色色的细菌类群中发现质粒已经在形形色色的细菌类群中发现质粒 这些质粒都是独立这些质粒都是独立这些质粒都是独立这些质粒都是独立(dl)(dl)(dl)(dl)于细菌染色体之外进行于细菌染色体之外进行于细菌染色体之外进行于细菌染色体之外进行复复复复 制和遗传的辅助性遗传单位制和遗传的辅助性遗传单位制和遗传的辅助性遗传单位制和遗传的辅助性遗传单位第72页/共152页第七十三页，共153页。第73页/共152页第七十四页，共153页。第74页/共152页第七十五页，共153页。 质粒是携带外源基因进入质粒是携带外源基因进入(jnr)(jnr)细菌中扩增或表达的细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验取则是最常用、最基本的实验技术技术 第75页/共152页第七十六页，共153页。质粒特性质粒特性(txng)1. 1. 1. 1. 分子相对小分子相对小分子相对小分子相对小 2. 2. 2. 2. 含有高效的自主复制成分含有高效的自主复制成分含有高效的自主复制成分含有高效的自主复制成分(chng fn) (chng fn) (chng fn) (chng fn) 3. 3. 3. 3. 不相容性不相容性不相容性不相容性4. 4. 4. 4. 转移性转移性转移性转移性5. 5. 5. 5. 选择的标记选择的标记选择的标记选择的标记6. 6. 6. 6. 限制性内切酶单一切口限制性内切酶单一切口限制性内切酶单一切口限制性内切酶单一切口第76页/共152页第七十七页，共153页。常用常用(chn yn)质粒质粒载体载体pBR322pBR322 pBR322 pBR322是一种使用是一种使用(shyng)(shyng)最广泛的质粒，全长为最广泛的质粒，全长为4363bp4363bp，由，由3 3种野生型质粒成分组成，种野生型质粒成分组成，amprampr基因来自基因来自pRSF2124pRSF2124，tetrtetr来自来自pSCl01pSCl01，复制起始点来自，复制起始点来自pM9pM9。核苷酸的序次号，以。核苷酸的序次号，以EcoRIEcoRI序列序列GAATTCGAATTC的第一个的第一个T T为为第一个核苷酸。第一个核苷酸。 第77页/共152页第七十八页，共153页。第78页/共152页第七十九页，共153页。 pUC系统系统(xtng) 如pUCl8和pUCI9，由pBR322的ampr基因和复制子，以及大肠杆菌部分1acZ基因和一个多种限制性内切酶单一位点的接头构成，全长2 666bp，pUCl8和pUCl9所含多位点接头的方向(fngxing)正好相反。 第79页/共152页第八十页，共153页。第80页/共152页第八十一页，共153页。质粒质粒质粒质粒DNADNADNADNA的提取的提取的提取的提取(tq)(tq)(tq)(tq)和纯化和纯化和纯化和纯化 1 1细菌的培养细菌的培养 先分离单个菌落，接种先分离单个菌落，接种(jizhng)(jizhng)到含少量适当抗生到含少量适当抗生素的培养基中扩增，随着细菌素的培养基中扩增，随着细菌的生长，质粒的生长，质粒DNADNA也在自主复也在自主复制。制。第81页/共152页第八十二页，共153页。 对于松弛型质粒，由于它的对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程度复制在一定程度(chngd)(chngd)上上不受到宿主细胞的控制，故在不受到宿主细胞的控制，故在细菌对数生长后期，加入氯霉细菌对数生长后期，加入氯霉素抑制宿主蛋白质的合成和染素抑制宿主蛋白质的合成和染色体色体DNADNA的复制。质粒的复制。质粒DNADNA的复的复制不受影响而大量扩增。制不受影响而大量扩增。第82页/共152页第八十三页，共153页。 使使用用氯氯霉霉素素的的主主要要目目的的，是是在在不不减减低低质质粒粒产产量量的的前提下，减少细菌的培养体积和细菌的数量前提下，减少细菌的培养体积和细菌的数量 有有时时质质粒粒在在细细菌菌中中的的扩扩增增状状况况很很差差，常常是是由由于于质质粒携带粒携带(xidi)(xidi)外源基因或质粒分子量过大所致。外源基因或质粒分子量过大所致。第83页/共152页第八十四页，共153页。2 2 2 2细菌细菌细菌细菌(xjn)(xjn)(xjn)(xjn)的收集与裂解的收集与裂解的收集与裂解的收集与裂解n n细胞生长过程中，排出大量代谢产物，为了提高质粒DNA的纯度，离心弃上清，细菌沉淀最好(zu ho)用STE或生理盐水悬浮，漂洗l-2次，离心管壁上的液体也应该仔细去除干净n n 第84页/共152页第八十五页，共153页。n n细细胞胞的的裂裂解解方方法法很很多多，如如去去污污剂剂法法，沸沸水水热热裂裂法法、碱碱变变性性法法，有有机机溶溶剂剂法法和和溶溶菌菌酶酶法法等等。不不同同方方法法各各有有利利弊弊，一一般般(ybn)(ybn)要要根根据据质质粒粒性性质质、宿宿主主菌菌的的特特性性及及后后继继的的纯纯化化方方法法等等多多种因素综合后加以选择。种因素综合后加以选择。 n n 第85页/共152页第八十六页，共153页。 质粒质粒DNADNA的小量的小量(xi(xi oling)oling)制备制备 2-5ml 2-5ml 质粒质粒DNADNA的大量制备的大量制备 500ml 500ml 碱裂解法碱裂解法 方法方法 煮沸法煮沸法 SDS SDS裂解法裂解法 Triton- Triton-溶菌酶法溶菌酶法 第86页/共152页第八十七页，共153页。质粒质粒质粒质粒DNADNADNADNA提取方法提取方法提取方法提取方法(fngf)(fngf)(fngf)(fngf)的选择的选择的选择的选择 常用的煮沸法，碱法,SDS法均可获得较满意效果至于有人采用碱法提取小量细菌培养(piyng)物的质粒， 用煮沸法或SDS法进行质粒DNA的大量分离， 只是各个实验室的习惯问题.第87页/共152页第八十八页，共153页。选择哪种方法制备质粒选择哪种方法制备质粒选择哪种方法制备质粒选择哪种方法制备质粒DNADNADNADNA，应考虑以下因素：，应考虑以下因素：，应考虑以下因素：，应考虑以下因素： 1 1 1 1菌株类型菌株类型菌株类型菌株类型 2 2 2 2质粒的大小质粒的大小质粒的大小质粒的大小 3 3 3 3 细细细细 菌菌菌菌 染染染染 色色色色 体体体体 DNADNADNADNA变变变变 性性性性 条条条条 件件件件 强强强强 弱弱弱弱 的的的的 控控控控 制制制制(kngzh)(kngzh)(kngzh)(kngzh) 4 4 4 4细菌的培养与收集细菌的培养与收集细菌的培养与收集细菌的培养与收集第88页/共152页第八十九页，共153页。第三节第三节第三节第三节 质粒质粒质粒质粒DNADNADNADNA的提取的提取的提取的提取(tq)(tq)(tq)(tq)与纯化与纯化与纯化与纯化二、煮沸裂解法三、SDS裂解(liji)法四、其它(qt)方法一、 碱裂解法五、质粒DNA的纯化第89页/共152页第九十页，共153页。一、碱裂解法一、碱裂解法一、碱裂解法一、碱裂解法n n在在NaOHNaOH存存在在的的强强碱碱性性（12.612.6）条条件件(tiojin)(tiojin)下下，用用SDSSDS破破坏坏细细胞胞壁壁和和裂裂解解细细胞胞，并并使使细细胞胞的的蛋蛋白白质质与与DNADNA发生变性，释放出质粒发生变性，释放出质粒DNADNA。第90页/共152页第九十一页，共153页。一、碱裂解法一、碱裂解法一、碱裂解法一、碱裂解法n n细细胞胞被被裂裂解解后后，细细胞胞壁壁、膜膜的的碎碎片片、变变性性的的蛋蛋白白质质和染色体和染色体DNADNA形成大的复合物形成大的复合物n n当当pHpH调至中性，质粒调至中性，质粒DNADNA重新恢复天然的超螺旋重新恢复天然的超螺旋n n在在高高盐盐条条件件下下沉沉淀淀(chndin)(chndin)，经经离离心心分分离离，质质粒粒DNADNA保留在上清液中保留在上清液中第91页/共152页第九十二页，共153页。一、碱裂解法一、碱裂解法碱裂解法示意图第92页/共152页第九十三页，共153页。二、煮沸裂解法二、煮沸裂解法二、煮沸裂解法二、煮沸裂解法n n将将细细菌菌(xjn)(xjn)悬悬浮浮于于含含TritonX-100TritonX-100和和溶溶菌菌酶酶的的缓缓冲冲液液中中，TritonX-100TritonX-100和和溶溶菌菌酶酶能能破破坏坏细细胞胞壁壁，再再用用沸沸水水浴浴裂裂解解细细胞，并使宿主细胞的蛋白质与胞，并使宿主细胞的蛋白质与DNADNA变性。变性。第93页/共152页第九十四页，共153页。二、煮沸裂解法二、煮沸裂解法二、煮沸裂解法二、煮沸裂解法n n质质粒粒DNADNA因因结结构构紧紧密密不不会会解解链链，当当温温度度下下降降后后，可可重新重新(chngxn)(chngxn)恢复其天然超螺旋结构。恢复其天然超螺旋结构。n n通通过过离离心心去去除除变变性性的的蛋蛋白白质质和和染染色色体体DNA, DNA, 然然后后回回收上清液中的质粒收上清液中的质粒DNADNA。第94页/共152页第九十五页，共153页。n n煮沸裂解法比较剧烈，只用于提取小质粒。对于会释放出大量糖类(tn li)的菌株不适宜。如HB101及衍生菌第95页/共152页第九十六页，共153页。三、三、三、三、SDSSDSSDSSDS裂解裂解裂解裂解(li ji)(li ji)(li ji)(li ji)法法法法n n将将细细菌菌悬悬浮浮于于等等渗渗的的蔗蔗糖糖溶溶液液中中，用用溶溶菌菌酶酶和和EDTAEDTA处处理理以以破破坏坏细细胞胞壁壁，再再用用SDSSDS裂裂解解去去壁壁细细胞胞，从从而而温温和和地地释释放放质质粒粒到到等等渗渗液液中中，然然后后酚酚/ /氯氯仿仿(l (l fn)fn)抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNADNA。第96页/共152页第九十七页，共153页。三、三、三、三、SDSSDSSDSSDS裂解裂解裂解裂解(li (li (li (li ji)ji)ji)ji)法法法法由由于于条条件件温温和和，该该法法特特别别(tbi)(tbi)适适用用于于大大质质粒粒DNADNA（15kb15kb）的的提提取取。但有一部分质粒但有一部分质粒DNADNA会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。第97页/共152页第九十八页，共153页。第98页/共152页第九十九页，共153页。四、其它四、其它四、其它四、其它(qt)(qt)方法方法方法方法（二）牙签(yqin)少量制备法(一) 小量(xioling)一步提取法第99页/共152页第一百页，共153页。四、其它四、其它四、其它四、其它(qt)(qt)方法方法方法方法( (一一) ) 小量一步提取法小量一步提取法 直接将酚直接将酚/ /氯仿与细菌培养物混合，然后离氯仿与细菌培养物混合，然后离心去除心去除(q ch)(q ch)大部分蛋白质和染色体大部分蛋白质和染色体DNADNA，最，最后从上清液中回收质粒后从上清液中回收质粒DNADNA。本法简单快捷、成。本法简单快捷、成本低，提取的质粒可用于限制性内切酶图谱分析。本低，提取的质粒可用于限制性内切酶图谱分析。第100页/共152页第一百零一页，共153页。四、其它四、其它四、其它四、其它(qt)(qt)方法方法方法方法n n（二）牙签少量制备法（二）牙签少量制备法n n 用牙签直接挑取生长在琼脂平板上的细菌菌落用牙签直接挑取生长在琼脂平板上的细菌菌落(jnlu)(jnlu)制备质粒制备质粒DNADNA。n n 由于制备的质粒由于制备的质粒DNADNA有较多污染，不能用于分子有较多污染，不能用于分子克隆中的酶学反应，但可用于质粒的鉴定。克隆中的酶学反应，但可用于质粒的鉴定。第101页/共152页第一百零二页，共153页。五、质粒五、质粒五、质粒五、质粒DNADNADNADNA的纯化的纯化的纯化的纯化(chn hu)(chn hu)(chn hu)(chn hu). .CsCl-EBCsCl-EB法法. .聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法. .柱层析法柱层析法第102页/共152页第一百零三页，共153页。 质粒从细菌中分离出来以后，为满足有些实验质粒从细菌中分离出来以后，为满足有些实验质粒从细菌中分离出来以后，为满足有些实验质粒从细菌中分离出来以后，为满足有些实验(shyn)(shyn)(shyn)(shyn)的要求还应进一步纯化。的要求还应进一步纯化。的要求还应进一步纯化。的要求还应进一步纯化。CsClCsClCsClCsCl溴乙锭平衡超溴乙锭平衡超溴乙锭平衡超溴乙锭平衡超速离心法是纯化质粒的可靠经典方法。速离心法是纯化质粒的可靠经典方法。速离心法是纯化质粒的可靠经典方法。速离心法是纯化质粒的可靠经典方法。 但是由于此法费用昂贵及流程长，近年来，发展了几但是由于此法费用昂贵及流程长，近年来，发展了几但是由于此法费用昂贵及流程长，近年来，发展了几但是由于此法费用昂贵及流程长，近年来，发展了几种不同的方法取代了超离法。如离子交换层析法或排种不同的方法取代了超离法。如离子交换层析法或排种不同的方法取代了超离法。如离子交换层析法或排种不同的方法取代了超离法。如离子交换层析法或排阻层析法，分级聚乙二醇沉淀法等，也可获得较好质阻层析法，分级聚乙二醇沉淀法等，也可获得较好质阻层析法，分级聚乙二醇沉淀法等，也可获得较好质阻层析法，分级聚乙二醇沉淀法等，也可获得较好质量的质粒量的质粒量的质粒量的质粒DNADNADNADNA。第103页/共152页第一百零四页，共153页。 转基因动物，真核细胞转染及转基因动物，真核细胞转染及DNADNA外切酶酶切缺失等外切酶酶切缺失等实验，对闭合环状双链实验，对闭合环状双链DNADNA的要求较高，一般还是用的要求较高，一般还是用超速离心法纯化质粒。超速离心法纯化质粒。 对于对于DNADNA片段酶切回收，内切酶图谱片段酶切回收，内切酶图谱(t(t pp )分析、分析、细菌转化、亚克隆及探针放射性标记等实验，直接用细菌转化、亚克隆及探针放射性标记等实验，直接用小量或中量提取的小量或中量提取的DNADNA样品，并不需要超速离心纯化，样品，并不需要超速离心纯化，一般可满足实验要求。一般可满足实验要求。第104页/共152页第一百零五页，共153页。EBCsClEBCsCl密度梯度离心法密度梯度离心法密度梯度离心法密度梯度离心法n nEBEB插入相邻的碱基之间，降低了插入相邻的碱基之间，降低了DNADNA的浮力密度，但的浮力密度，但超螺旋的超螺旋的DNADNA结合结合EBEB浮力密度降低较小，仅有浮力密度降低较小，仅有g/cm3g/cm3。n nCsClCsCl可以可以(ky)(ky)用丁醇抽提，透析除去。纯度可达用丁醇抽提，透析除去。纯度可达100%100%。五、质粒五、质粒DNADNA的纯化的纯化(chn hu)(chn hu)第105页/共152页第一百零六页，共153页。 超速离心将介质超速离心将介质CsClCsCl形成一形成一连续的密度梯度，在过量连续的密度梯度，在过量EBEB存存在下，蛋白质的密度最小位于在下，蛋白质的密度最小位于最上层；最上层；RNARNA密度最大沉于管密度最大沉于管底；底；DNADNA位于中间，由于不同位于中间，由于不同结构结构(jigu)(jigu)的的DNADNA与与EBEB结合结合度不一致，因此密度下降不一度不一致，因此密度下降不一致，故将线性、开环、闭环的致，故将线性、开环、闭环的DNADNA区分开区分开第106页/共152页第一百零七页，共153页。简述溴化乙锭简述溴化乙锭简述溴化乙锭简述溴化乙锭- - - -氯化铯密度梯度离心氯化铯密度梯度离心氯化铯密度梯度离心氯化铯密度梯度离心(lxn)(lxn)(lxn)(lxn)纯化质粒纯化质粒纯化质粒纯化质粒DNADNADNADNA的原理的原理的原理的原理？1 1 1 1 氯化铯是一种重金属，在高速离心后信成一定的浓度梯度氯化铯是一种重金属，在高速离心后信成一定的浓度梯度氯化铯是一种重金属，在高速离心后信成一定的浓度梯度氯化铯是一种重金属，在高速离心后信成一定的浓度梯度2 2 2 2 溶液中不同的大分子在离心时，根据自身的分子的浮力密溶液中不同的大分子在离心时，根据自身的分子的浮力密溶液中不同的大分子在离心时，根据自身的分子的浮力密溶液中不同的大分子在离心时，根据自身的分子的浮力密度形成度形成度形成度形成(xngchng)(xngchng)(xngchng)(xngchng)不同的致密带，蛋白质密度低位于上不同的致密带，蛋白质密度低位于上不同的致密带，蛋白质密度低位于上不同的致密带，蛋白质密度低位于上层，层，层，层，RNARNARNARNA位于最下层。位于最下层。位于最下层。位于最下层。3 EB3 EB3 EB3 EB存在时，由于存在时，由于存在时，由于存在时，由于EBEBEBEB可以插入到可以插入到可以插入到可以插入到DNADNADNADNA双螺旋分子中，使得双螺旋分子中，使得双螺旋分子中，使得双螺旋分子中，使得DNADNADNADNA部分解旋，浮力密度下降，而超螺旋的质粒部分解旋，浮力密度下降，而超螺旋的质粒部分解旋，浮力密度下降，而超螺旋的质粒部分解旋，浮力密度下降，而超螺旋的质粒DNADNADNADNA，EBEBEBEB不能不能不能不能插入少，故可将不同结构的插入少，故可将不同结构的插入少，故可将不同结构的插入少，故可将不同结构的DNADNADNADNA分子分离。分子分离。分子分离。分子分离。第107页/共152页第一百零八页，共153页。EBCsCl密度梯度离心法示意图五、质粒五、质粒DNADNA的纯化的纯化(chn hu)(chn hu)第108页/共152页第一百零九页，共153页。五、质粒五、质粒DNADNA的纯化的纯化(chn hu)(chn hu)第109页/共152页第一百一十页，共153页。第四节第四节 真核细胞真核细胞RNARNA的分离的分离(fnl)(fnl)纯化纯化第110页/共152页第一百一十一页，共153页。第111页/共152页第一百一十二页，共153页。每个细胞每个细胞每个细胞每个细胞(xbo)(xbo)的的的的RNARNA量约为量约为量约为量约为10-5 g10-5 g 80%-85% rRNA 80%-85% rRNA 10%-15% tRNA 10%-15% tRNA 1%-5% mRNA 1%-5% mRNA 其他其他其他其他RNARNA：hnRNAhnRNA、 snRNA snRNA 、snoRNAsnoRNA第112页/共152页第一百一十三页，共153页。一、关于一、关于一、关于一、关于(guny)RNase(guny)RNase(guny)RNase(guny)RNase酶酶酶酶n nRNARNA易易被被RNaseRNase水水解解，RNaseRNase除除胞胞内内还还广广泛泛存存在在于于人人的的皮皮肤、唾液肤、唾液(tuy)(tuy)、汗液及周围的环境中。、汗液及周围的环境中。n nRNaseRNase具有水解核糖残基和磷酸二酯键具有水解核糖残基和磷酸二酯键n nRNaseRNase分分子子结结构构中中的的二二硫硫键键使使其其生生物物学学活活性性非非常常稳稳定定，去除变性剂后，去除变性剂后，RNaseRNase的活性又可恢复。的活性又可恢复。n nRnaseRnase不需要二价阳离子激活不需要二价阳离子激活第113页/共152页第一百一十四页，共153页。n n去去除除RNaseRNase的的污污染染及及强强有有力力地地抑抑制制其其活活性性是是RNARNA制制备备(zhbi)(zhbi)成功与否的关键。成功与否的关键。n n必必须须在在总总RNARNA提提取取分分离离的的最最初初阶阶段段，尽尽可可能能地地灭灭活活胞内胞内RNaseRNase的活性。的活性。内源性内源性RNA酶酶第114页/共152页第一百一十五页，共153页。外源性外源性RNA酶酶主要来源：主要来源： 被污染被污染(wrn)的缓冲液的缓冲液 细菌或微生物污染细菌或微生物污染(wrn)，高压不能去除高压不能去除RNA酶，酶， 必须丢弃。必须丢弃。 自动移液装置自动移液装置第115页/共152页第一百一十六页，共153页。实验室采取实验室采取(ciq)(ciq)避免避免RNARNA酶酶污染的措施污染的措施设置专门设置专门RNARNA移液装置移液装置小份保存缓冲液小份保存缓冲液设置专门的设置专门的RNARNA电泳装置电泳装置准备溶液或缓冲液时，使用无准备溶液或缓冲液时，使用无RNARNA酶的器皿、酶的器皿、 DEPC DEPC处理水等处理水等分离分离RNARNA过程中使用过程中使用RNARNA酶抑制酶抑制剂剂第116页/共152页第一百一十七页，共153页。 变性剂变性剂选选择择性性地地使使用用RNaseRNase的的变变性性剂剂（如如酚酚、氯氯仿仿(l (l fn)fn)及及强强烈烈的的胍胍类变性剂）类变性剂）使用蛋白酶使用蛋白酶K K 使使用用阴阴离离子子去去污污剂剂如如SDSSDS、十十二二烷烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠二、二、二、二、RNARNARNARNA酶抑制剂和变性剂酶抑制剂和变性剂酶抑制剂和变性剂酶抑制剂和变性剂第117页/共152页第一百一十八页，共153页。n n胍类变性剂：胍盐是破坏蛋白质三维结构的离液胍类变性剂：胍盐是破坏蛋白质三维结构的离液剂。剂。n n蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍和盐酸蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍和盐酸胍，使蛋白质转换成随机卷曲状态。胍，使蛋白质转换成随机卷曲状态。n n盐酸胍抑制盐酸胍抑制RNARNA酶作用强，变性作用较异硫氰酸胍酶作用强，变性作用较异硫氰酸胍弱。异硫氰酸胍自身可形成氢键弱。异硫氰酸胍自身可形成氢键(qn jin)(qn jin)，在，在还原剂存在下断裂氢键还原剂存在下断裂氢键(qn jin)(qn jin)。第118页/共152页第一百一十九页，共153页。联联合合使使用用(sh(sh yng)RNaseyng)RNase的的特特异异抑抑制制剂剂（如如RNasinRNasin与与DEPCDEPC等等）能能极极大大地地防防止止内内源源性性RNaseRNase对对RNARNA的降解。的降解。RNARNARNARNA酶抑制剂酶抑制剂酶抑制剂酶抑制剂第119页/共152页第一百二十页，共153页。（1）DEPC（焦碳酸二乙酯）高度活化(huhu)的烷基化试剂，破坏RNA酶活性。用来灭活缓冲液或器皿中的RNA酶。 OC-CH2-CH3OC-CH2-CH3O=DEPC水制备：0.1%DEPC在37C处理(chl)1h，并高压灭菌15min。玻璃制品和塑料制品应浸泡在0.1%的DEPC水溶液中， 37C处理(chl)1h或室温下过夜。DEPC非选择性的修饰蛋白质和RNA，且与一些(yxi)缓冲液不相容，故在分离和纯化RNA的过程中不使用DEPC。第120页/共152页第一百二十一页，共153页。（2 2 2 2）RNARNARNARNA酶的蛋白酶的蛋白酶的蛋白酶的蛋白(dnbi)(dnbi)(dnbi)(dnbi)抑制剂抑制剂抑制剂抑制剂n n许多RNA酶可以与该类蛋白(dnbi)质结合形成非共价复合物从而是RNA酶失活。n nRNA酶蛋白(dnbi)抑制剂与靶蛋白(dnbi)的亲和力大。n n商品化的RNA酶蛋白(dnbi)抑制剂的名称各异（如RNAsin等）。第121页/共152页第一百二十二页，共153页。n n加入-疏基乙醇(y chn)、二硫苏糖醇（DTT）等还原剂可以还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活。第122页/共152页第一百二十三页，共153页。第四节第四节第四节第四节 真核细胞真核细胞真核细胞真核细胞RNARNARNARNA的分离的分离的分离的分离(fnl)(fnl)(fnl)(fnl)纯纯纯纯化化化化二、酸性二、酸性(sun xn)(sun xn)异硫氰酸胍异硫氰酸胍- -酚酚- -氯仿一氯仿一步法步法三、商品化的单相裂解三、商品化的单相裂解(li ji)(li ji)试剂法分试剂法分RNARNA四、mRNA的分离纯化一、RNA制备的条件与环境第123页/共152页第一百二十四页，共153页。一、一、一、一、RNARNARNARNA制备制备制备制备(zhbi)(zhbi)(zhbi)(zhbi)的条件与环境的条件与环境的条件与环境的条件与环境n nRNARNA易易被被RNaseRNase水水解解，RNaseRNase除除胞胞内内还还广广泛泛存存在在于于人的皮肤、唾液、汗液人的皮肤、唾液、汗液(hny)(hny)及周围的环境中。及周围的环境中。n nRNaseRNase分分子子结结构构中中的的二二硫硫键键使使其其生生物物学学活活性性非非常常稳定，去除变性剂后，稳定，去除变性剂后，RNaseRNase的活性又可恢复。的活性又可恢复。第124页/共152页第一百二十五页，共153页。一、一、一、一、RNARNARNARNA制备的条件制备的条件制备的条件制备的条件(tiojin)(tiojin)(tiojin)(tiojin)与环境与环境与环境与环境n n去去除除RNaseRNase的的污污染染及及强强有有力力地地抑抑制制其其活活性性是是RNARNA制备成功制备成功(chnggng)(chnggng)与否的关键。与否的关键。n n必必须须在在总总RNARNA提提取取分分离离的的最最初初阶阶段段，尽尽可可能能地地灭活胞内灭活胞内RNaseRNase的活性。的活性。第125页/共152页第一百二十六页，共153页。 选选择择性性地地使使用用(sh(sh yng)RNaseyng)RNase的的变变性性剂剂（如如酚酚、氯氯仿仿及强烈的胍类变性剂）及强烈的胍类变性剂）使用使用(sh(sh yng)yng)蛋白酶蛋白酶K K 使使用用(sh(sh yng)yng)阴阴离离子子去去污污剂剂如如SDSSDS、十十二二烷烷基基肌肌氨氨酸钠或脱氧胆酸钠酸钠或脱氧胆酸钠一、一、一、一、RNARNARNARNA制备制备制备制备(zhbi)(zhbi)(zhbi)(zhbi)的条件与的条件与的条件与的条件与环境环境环境环境第126页/共152页第一百二十七页，共153页。联合使用RNase的特异抑制剂（如RNasin与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的降解。加入-疏基乙醇(y chn)、二硫苏糖醇（DTT）等还原剂可以还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活。一、一、一、一、RNARNARNARNA制备制备制备制备(zhbi)(zhbi)(zhbi)(zhbi)的条件与环的条件与环的条件与环的条件与环境境境境第127页/共152页第一百二十八页，共153页。二、酸性二、酸性二、酸性二、酸性(sun xn)(sun xn)(sun xn)(sun xn)异硫氰酸胍异硫氰酸胍异硫氰酸胍异硫氰酸胍- - - -酚酚酚酚- - - -氯仿一步法氯仿一步法氯仿一步法氯仿一步法n n首首先先以以含含异异硫硫氰氰酸酸胍胍、-疏疏基基乙乙醇醇和和十十二二烷烷基基肌肌氨氨酸酸钠的变性溶液裂解钠的变性溶液裂解(li ji)(li ji)细胞。细胞。n n然后在的条件下，酚然后在的条件下，酚/ /氯仿抽提细胞裂解氯仿抽提细胞裂解(li ji)(li ji)溶液。溶液。n n最后通过异丙醇沉淀与最后通过异丙醇沉淀与75%75%的乙醇洗涤而获得总的乙醇洗涤而获得总RNARNA。第128页/共152页第一百二十九页，共153页。二、酸性二、酸性二、酸性二、酸性(sun xn)(sun xn)(sun xn)(sun xn)异硫氰酸胍异硫氰酸胍异硫氰酸胍异硫氰酸胍- - - -酚酚酚酚- - - -氯仿一步氯仿一步氯仿一步氯仿一步法法法法n n本本法法具具有有简简便便、快快速速、经经济济、高高效效及及提提取取的的RNARNA质质量量高高等等优优点点，能能在在3 3小小时时内内迅迅速速(xn (xn s)s)处处理理多多个个标本。标本。n n总总RNARNA产产量量取取决决于于标标本本的的起起始始量量，每每mgmg组组织织大大约约能能制备制备4 47 7 g g总总RNARNA，每，每106106个细胞大约为个细胞大约为4 41010 g g。 第129页/共152页第一百三十页，共153页。三、商品化的单相裂解三、商品化的单相裂解三、商品化的单相裂解三、商品化的单相裂解(li ji)(li ji)(li ji)(li ji)试剂法分试剂法分试剂法分试剂法分RNARNARNARNAn n本本法法是是异异硫硫氰氰酸酸胍胍- -酚酚- -氯氯仿仿一一步步法法的的改改进进(gijn)(gijn)方案。方案。n n以以异异硫硫氰氰酸酸胍胍- -酚酚的的单单相相裂裂解解液液裂裂解解细细胞胞，再再加加入入氯氯仿后形成两相。仿后形成两相。第130页/共152页第一百三十一页，共153页。三、商品化的单相裂解三、商品化的单相裂解三、商品化的单相裂解三、商品化的单相裂解(li ji)(li ji)(li ji)(li ji)试剂法分试剂法分试剂法分试剂法分RNARNARNARNAn n变变性性的的DNADNA与与蛋蛋白白质质介介于于两两相相的的交交界界面面，可可使使用用乙乙醇醇和和异异丙丙醇醇分级分级(fn j)(fn j)沉淀出来。沉淀出来。n n保保留留于于上上层层水水相相的的RNARNA，通通过过异异丙丙醇醇沉沉淀淀与与75%75%乙乙醇醇洗洗涤涤而而制制备。备。第131页/共152页第一百三十二页，共153页。三、商品化的单相三、商品化的单相三、商品化的单相三、商品化的单相(dn xin)(dn xin)(dn xin)(dn xin)裂解试剂法分裂解试剂法分裂解试剂法分裂解试剂法分RNARNARNARNAn n目目前前，该该法法已已成成为为实实验验室室最最常常用用的的总总RNARNA提提取取法，其产量及质量法，其产量及质量(zhling)(zhling)与前法相当。与前法相当。第132页/共152页第一百三十三页，共153页。四、四、四、四、mRNAmRNAmRNAmRNA的分离的分离的分离的分离(fnl)(fnl)(fnl)(fnl)纯化纯化纯化纯化n n除除血血红红蛋蛋白白及及组组蛋蛋白白的的mRNAmRNA外外，绝绝大大多多数数mRNAmRNA在在其其3 3 末端带有长短末端带有长短(chngdun)(chngdun)不同的不同的polypoly（A A）尾巴。）尾巴。n n利利用用碱碱基基配配对对原原则则，通通过过oligooligo（dTdT）- -纤纤维维素素或或polypoly（U U）- -琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶的的亲亲和和层层析析，可可以以很很容容易易地地从从总总RNARNA制品中分离纯化制品中分离纯化mRNAmRNA。第133页/共152页第一百三十四页，共153页。1. oligo1. oligo（dTdT）- -纤维素柱层析法纤维素柱层析法2. oligo2. oligo（dTdT）- -纤维素柱离心法纤维素柱离心法3. oligo3. oligo（dTdT）- -纤维素液相结合纤维素液相结合(jih)(jih)离心法离心法4. 4. 磁性球珠分离法磁性球珠分离法四、四、四、四、mRNAmRNAmRNAmRNA的分离的分离的分离的分离(fnl)(fnl)(fnl)(fnl)纯化纯化纯化纯化第134页/共152页第一百三十五页，共153页。第135页/共152页第一百三十六页，共153页。第136页/共152页第一百三十七页，共153页。第137页/共152页第一百三十八页，共153页。5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5+总RNA中的poly(A) +RNA分子退火形成杂交体 5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5链亲和素标记的磁珠+Streptavidin- 磁5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin- 磁生物素与链亲和素的特异性结合 磁性分离5m7G AAAAAAAAAAAA3 磁铁3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin- 磁洗涤与洗脱水相(含纯化的mRNA)固相生物素标记的oligo(dT)磁铁5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin- 磁磁珠分离法纯化(chn hu)poly(A) +RNA的原理四、四、mRNAmRNA的分离的分离(fnl)(fnl)纯化纯化第138页/共152页第一百三十九页，共153页。问题问题(wnt)从细胞或组织从细胞或组织(zzh)(zzh)中分离中分离DNADNA时，常用蔗时，常用蔗糖，目的是（糖，目的是（ ） A A 抑制核酸酶抑制核酸酶 B B 保护保护DNADNA，防止断裂，防止断裂 C C 加速蛋白质变性加速蛋白质变性 D D 有利于细胞破碎有利于细胞破碎第139页/共152页第一百四十页，共153页。异戊醇的作用是（异戊醇的作用是（ ）A A 使蛋白质脱水使蛋白质脱水B B 使使DNADNA进入水相进入水相C C 帮助帮助DNADNA进入水相进入水相D D 减少气泡减少气泡(qpo)(qpo)，促进分，促进分相相第140页/共152页第一百四十一页，共153页。变色的酚中含有氧化物，这种变色的酚中含有氧化物，这种酚不能用于酚不能用于DNADNA分离，原因主分离，原因主要是（要是（ ）A A 氧化物可使氧化物可使DNADNA磷酸二酯键断磷酸二酯键断裂裂B B 氧化物会改变氧化物会改变PHPH值值C C 氧化物同氧化物同DNADNA形成复合物形成复合物D D氧化物在氧化物在DNADNA分离后不易分离后不易(b (b y)y)除去除去第141页/共152页第一百四十二页，共153页。n n在细胞核内，核酸常与哪一种物质(wzh)结合形成复合物n n A、糖n n B、蛋白质n n C、脂类n n D、水n n E、无机盐第142页/共152页第一百四十三页，共153页。n n在RNA纯化时，为了既利于DNA变性又利于RNA的分离(fnl)，常使用的水饱和酚的PH值n n 第143页/共152页第一百四十四页，共153页。n n在利用在利用CsCl-EBCsCl-EB法纯化质粒法纯化质粒DNADNA的过程中，离的过程中，离心后位于试管中部的物质是心后位于试管中部的物质是n n A A 蛋白质蛋白质 n n B B 油或铯油或铯n n C DNA C DNAn n D RNA D RNAn n E E 复合复合(fh)(fh)糖类糖类第144页/共152页第一百四十五页，共153页。通过紫外分光光度法可对核酸纯度进行通过紫外分光光度法可对核酸纯度进行通过紫外分光光度法可对核酸纯度进行通过紫外分光光度法可对核酸纯度进行(jnxng)(jnxng)鉴定，下列说法不正确的是鉴定，下列说法不正确的是鉴定，下列说法不正确的是鉴定，下列说法不正确的是A A A A 主要通过主要通过主要通过主要通过A260A260A260A260与与与与A280A280A280A280的比值来判断有无蛋白质的污染的比值来判断有无蛋白质的污染的比值来判断有无蛋白质的污染的比值来判断有无蛋白质的污染(wrn)(wrn)(wrn)(wrn)B B B B 在在在在TETETETE缓冲液中，纯缓冲液中，纯缓冲液中，纯缓冲液中，纯DNADNADNADNA的的的的A260/A280A260/A280A260/A280A260/A280C TEC TEC TEC TE缓冲液中，纯缓冲液中，纯缓冲液中，纯缓冲液中，纯RNARNARNARNA的的的的A260/A280A260/A280A260/A280A260/A280D A260/A280D A260/A280D A260/A280D A260/A280的的的的DNADNADNADNA溶液是纯的溶液是纯的溶液是纯的溶液是纯的DNADNADNADNA溶液溶液溶液溶液E E E E 蛋白质在蛋白质在蛋白质在蛋白质在280nm280nm280nm280nm的吸收峰和酚在的吸收峰和酚在的吸收峰和酚在的吸收峰和酚在270nm270nm270nm270nm的吸收峰可以鉴定是蛋白质还是酚的吸收峰可以鉴定是蛋白质还是酚的吸收峰可以鉴定是蛋白质还是酚的吸收峰可以鉴定是蛋白质还是酚污染污染污染污染(wrn)(wrn)(wrn)(wrn)第145页/共152页第一百四十六页，共153页。目前使用最广泛的质粒目前使用最广泛的质粒目前使用最广泛的质粒目前使用最广泛的质粒DNADNADNADNA小量提取小量提取小量提取小量提取(tq)(tq)(tq)(tq)的方法是的方法是的方法是的方法是A A A A 煮沸裂解法煮沸裂解法煮沸裂解法煮沸裂解法B SDSB SDSB SDSB SDS裂解法裂解法裂解法裂解法C C C C 小量一步提取法小量一步提取法小量一步提取法小量一步提取法D D D D 碱裂解法碱裂解法碱裂解法碱裂解法E E E E 牙签少量牙签少量牙签少量牙签少量(sholing)(sholing)(sholing)(sholing)制备法制备法制备法制备法第146页/共152页第一百四十七页，共153页。酚抽提法可用于高分子量酚抽提法可用于高分子量酚抽提法可用于高分子量酚抽提法可用于高分子量DNADNADNADNA的分离纯化，所用试剂分别的分离纯化，所用试剂分别的分离纯化，所用试剂分别的分离纯化，所用试剂分别(fnbi)(fnbi)(fnbi)(fnbi)有不同的功能，下列不正确的是有不同的功能，下列不正确的是有不同的功能，下列不正确的是有不同的功能，下列不正确的是A SDSA SDSA SDSA SDS为生物阴离子去污剂，主要引起细胞膜降解并能乳化脂质和蛋白质为生物阴离子去污剂，主要引起细胞膜降解并能乳化脂质和蛋白质为生物阴离子去污剂，主要引起细胞膜降解并能乳化脂质和蛋白质为生物阴离子去污剂，主要引起细胞膜降解并能乳化脂质和蛋白质B EDTAB EDTAB EDTAB EDTA为二价金属离子螯合剂，可以抑制为二价金属离子螯合剂，可以抑制为二价金属离子螯合剂，可以抑制为二价金属离子螯合剂，可以抑制DnaseDnaseDnaseDnase的活性，同时降低细胞膜的活性，同时降低细胞膜的活性，同时降低细胞膜的活性，同时降低细胞膜稳定性稳定性稳定性稳定性C C C C 蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶K K K K可消化可消化可消化可消化DnaseDnaseDnaseDnase和细胞中的蛋白质并裂解细胞和细胞中的蛋白质并裂解细胞和细胞中的蛋白质并裂解细胞和细胞中的蛋白质并裂解细胞D D D D 酚可使蛋白质变性沉淀，但无抑制酚可使蛋白质变性沉淀，但无抑制酚可使蛋白质变性沉淀，但无抑制酚可使蛋白质变性沉淀，但无抑制DnaseDnaseDnaseDnase的活性的活性的活性的活性E E E E 无无无无DnaseDnaseDnaseDnase的的的的RnaseRnaseRnaseRnase可有效地水解可有效地水解可有效地水解可有效地水解RNARNARNARNA和避免和避免和避免和避免(bmin)DNA(bmin)DNA(bmin)DNA(bmin)DNA消化消化消化消化第147页/共152页第一百四十八页，共153页。大多数质粒的结构大多数质粒的结构大多数质粒的结构大多数质粒的结构(jigu)(jigu)均为均为均为均为A A A A 双链线性双链线性双链线性双链线性DNADNADNADNAB B B B 单链线性单链线性单链线性单链线性DNADNADNADNAC C C C 闭合闭合闭合闭合(b h)(b h)(b h)(b h)环状双链环状双链环状双链环状双链DNADNADNADNAD D D D 闭合闭合闭合闭合(b h)(b h)(b h)(b h)环状单链环状单链环状单链环状单链DNADNADNADNAE DNA-RNAE DNA-RNAE DNA-RNAE DNA-RNA杂交体杂交体杂交体杂交体第148页/共152页第一百四十九页，共153页。n n对于HB101及其衍生物不宜使用(shyng)煮沸法，其原因是第149页/共152页第一百五十页，共153页。n n简述酚简述酚-氯仿氯仿(l fn)抽提基因组抽提基因组DNA和碱和碱裂解法抽提质粒的原理裂解法抽提质粒的原理第150页/共152页第一百五十一页，共153页。复习题复习题DNA的原理？各种试剂的原理？各种试剂(shj)的主要作用的主要作用.2.核酸抽提的基本原则核酸抽提的基本原则.4.抽提质粒的方法有哪些？碱裂解法的基本原抽提质粒的方法有哪些？碱裂解法的基本原理理.ilike666 第151页/共152页第一百五十二页，共153页。内容(nirng)总结会计学。需考虑制备核酸所需的时间与成本。4或-20存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。1.异丙醇沉淀法:仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态）。胍类变性剂：胍盐是破坏蛋白质三维结构的离液剂。RNA酶蛋白抑制剂与靶蛋白的亲和力大。以异硫氰酸胍-酚的单相裂解液裂解细胞，再加入(jir)氯仿后形成两相。3TTTTTTTTTTTT-Biotin5。ilike666第一百五十三页，共153页。