无菌操作技术组员：赵华 赵诣 陈珩 杜宇菲 高宝才 高瑞钰讲解：高宝才PPT制作：杜宇菲 高瑞钰资料查找人：赵华 赵诣 陈珩无菌操作技术无菌操作技术无菌无菌：在科学研究和生产实践中使用的在科学研究和生产实践中使用的微生物必须是单一的纯种或菌株，不能微生物必须是单一的纯种或菌株，不能存在杂菌（非目的菌）。存在杂菌（非目的菌）。无菌操作无菌操作防止微生物进入机体或物体的方法防止微生物进入机体或物体的方法在微生物操作过程中，除了使用的容器、用具在微生物操作过程中，除了使用的容器、用具（试管、三角烧瓶、平皿和吸管等）和培养基必（试管、三角烧瓶、平皿和吸管等）和培养基必须进行严格的灭菌处理外，还要通过一定的技术须进行严格的灭菌处理外，还要通过一定的技术来保证目的微生物在转移过程中不被环境中的微来保证目的微生物在转移过程中不被环境中的微生物污染，这些技术包括用接种环（针）、吸管、生物污染，这些技术包括用接种环（针）、吸管、涂棒等工具进行接种、稀释、涂片、计数和划线涂棒等工具进行接种、稀释、涂片、计数和划线分离等。分离等。实验目的实验目的 1. 1.学习掌握培养基的配制原理，同时学习掌握培养基的配制原理，同时通过对几种培养基的配制掌握配通过对几种培养基的配制掌握配 制制培养基的一般方法和步骤。培养基的一般方法和步骤。 2. 2.了解高压蒸汽灭菌的原理和应用范了解高压蒸汽灭菌的原理和应用范围，学习高压蒸汽灭菌的操作技术。围，学习高压蒸汽灭菌的操作技术。 3. 3.证实实验室环境与人体表面存在微证实实验室环境与人体表面存在微生物，体会无菌操作的重要性。生物，体会无菌操作的重要性。实验目的实验目的 4. 4.熟练掌握从固体培养物和液体培养熟练掌握从固体培养物和液体培养物中转接微生物的无菌操作技术，熟知各物中转接微生物的无菌操作技术，熟知各种菌种保藏方法，以及各个方法的特点和种菌种保藏方法，以及各个方法的特点和区别。区别。 5. 5.学习并掌握微生物的制片和简单染学习并掌握微生物的制片和简单染色的基本技术，初步了解细菌的形态特征。色的基本技术，初步了解细菌的形态特征。巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。实验原理实验原理1. 1. 培养基是人工按一定比例配制的供微生物培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。类和配制方法。实验原理实验原理2 2高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气急剧隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气急剧地将锅内地冷空气从排气阀中驱尽，然后关地将锅内地冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时，由于蒸汽不能闭排气阀，继续加热，此时，由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于点增高，得到高于100100摄氏度的温度。导致菌摄氏度的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的实验原理实验原理3 3要知道我们周围存在看得见的微生物可以要知道我们周围存在看得见的微生物可以通过两种方法：一种是通过放大微生物个体，通过两种方法：一种是通过放大微生物个体，是我们能够看到它们；另一种方法是通过是我们能够看到它们；另一种方法是通过“放大放大”成子细胞群体（菌落），使我们看到成子细胞群体（菌落），使我们看到它们的存在，即通过培养的方法使肉眼看不它们的存在，即通过培养的方法使肉眼看不见的单个菌体在固体培养基上，经过生长繁见的单个菌体在固体培养基上，经过生长繁殖形成几百万个菌聚集在一起的肉眼可见的殖形成几百万个菌聚集在一起的肉眼可见的菌落。菌落。实验原理实验原理4. 4. 高温对微生物具有致死效应，因此在微生高温对微生物具有致死效应，因此在微生物的转接过程中，一般在火焰旁进行，并用物的转接过程中，一般在火焰旁进行，并用火焰直接灼烧接种环（针、铲），以达到灭火焰直接灼烧接种环（针、铲），以达到灭菌的目的，但一定要保证其冷却后方可进行菌的目的，但一定要保证其冷却后方可进行转接，以免烫死微生物。如果是转接液体培转接，以免烫死微生物。如果是转接液体培养物，则用预先已灭菌的玻璃吸管或吸嘴；养物，则用预先已灭菌的玻璃吸管或吸嘴；如果只取少量而且勿需定量也可用接种环，如果只取少量而且勿需定量也可用接种环，视实验目的而定。视实验目的而定。实验原理实验原理5.5.通过分离纯化得到的微生物纯培养物，还通过分离纯化得到的微生物纯培养物，还必须通过各种保藏技术使其在一定时间内不必须通过各种保藏技术使其在一定时间内不死亡，不会被其他微生物污染，不会因发生死亡，不会被其他微生物污染，不会因发生变异而丢失重要的生物学形状，否则就无法变异而丢失重要的生物学形状，否则就无法真正保证微生物研究和应用工作的顺利进行。真正保证微生物研究和应用工作的顺利进行。保藏菌种的方法包括传代培养保藏、冷冻保保藏菌种的方法包括传代培养保藏、冷冻保藏和干燥保藏。藏和干燥保藏。实验原理实验原理 6. 6.对个体较小的细菌进行制片时采取涂片法，对个体较小的细菌进行制片时采取涂片法，通过涂抹使细胞个体在载玻片上均匀分布，通过涂抹使细胞个体在载玻片上均匀分布，避免菌体堆积而无法观察个体形态，通过加避免菌体堆积而无法观察个体形态，通过加热固定使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片热固定使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上，这种加热处理还可以杀死大多数细菌而上，这种加热处理还可以杀死大多数细菌而且不破坏细胞形态。且不破坏细胞形态。实验原理实验原理7.7.利用单一燃料对菌体进行染色的方法称为简单染色。利用单一燃料对菌体进行染色的方法称为简单染色。用于染色的燃料是一类苯环上带有发色基因和助色基用于染色的燃料是一类苯环上带有发色基因和助色基因的有机化合物。发色基因赋予燃料颜色特征，而助因的有机化合物。发色基因赋予燃料颜色特征，而助色基因使燃料能够形成盐。不含助色基因而仅具有发色基因使燃料能够形成盐。不含助色基因而仅具有发色基因的苯化合物（色原）即使具有颜色也不能用作色基因的苯化合物（色原）即使具有颜色也不能用作燃料，因为它不能电离，不能与酸或碱形成盐，难以燃料，因为它不能电离，不能与酸或碱形成盐，难以与微生物细胞结合使其着色。常用的微生物细胞燃料与微生物细胞结合使其着色。常用的微生物细胞燃料都是盐，分碱性染料和酸性燃料，前者包括美蓝、结都是盐，分碱性染料和酸性燃料，前者包括美蓝、结晶紫、碱性复红、沙黄及孔雀绿等，后者包括酸性复晶紫、碱性复红、沙黄及孔雀绿等，后者包括酸性复红、伊红及刚果红等。通常采用碱性燃料进行简单染红、伊红及刚果红等。通常采用碱性燃料进行简单染色，原因在于微生物细胞在碱性、中性及弱酸性溶液色，原因在于微生物细胞在碱性、中性及弱酸性溶液中通常带负电荷，而燃料电离之后染色部分带正电荷，中通常带负电荷，而燃料电离之后染色部分带正电荷，很容易与细胞结合使其着色；当细胞处于酸性条件下很容易与细胞结合使其着色；当细胞处于酸性条件下所带正电荷增加时，可采用酸性燃料染色。所带正电荷增加时，可采用酸性燃料染色。实验材料实验材料1.1.牛肉膏，蛋白胨，牛肉膏，蛋白胨，NaClNaCl，可溶性淀粉，可溶性淀粉，KNO3,K2HPO4.3H2O,MgSO4.7H2O,FeSO4.7H2O,KNO3,K2HPO4.3H2O,MgSO4.7H2O,FeSO4.7H2O,KH2PO4,KH2PO4,葡萄糖，孟加拉红（葡萄糖，孟加拉红（1%1%的水溶液），的水溶液），链霉素（链霉素（1%1%水溶液），水溶液），1 mol/L NaOH,1mol/L 1 mol/L NaOH,1mol/L HCLHCL，3%3%5%5%石炭酸或石炭酸或2%2%3 3来苏尔溶液，来苏尔溶液，2%2%的葡萄糖溶液，无菌水，金黄色葡萄球菌的葡萄糖溶液，无菌水，金黄色葡萄球菌24h24h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，草酸铵结牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，草酸铵结晶紫染液，齐氏石炭酸复红染液，吕氏碱性晶紫染液，齐氏石炭酸复红染液，吕氏碱性美蓝染液，革兰氏染色用碘液，乳酸石炭酸美蓝染液，革兰氏染色用碘液，乳酸石炭酸棉蓝染液等。棉蓝染液等。实验材料实验材料2.2.试管，三角烧瓶，量筒，玻璃棒，培养基分装试管，三角烧瓶，量筒，玻璃棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，器，天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，PHPH试纸，试纸，棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布，培养皿，棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布，培养皿，吸管，电热干燥箱，紫外线灯，注射器，微孔滤吸管，电热干燥箱，紫外线灯，注射器，微孔滤膜过滤器，膜过滤器，0.22um0.22um滤膜，镊子，玻璃刮棒，灭菌滤膜，镊子，玻璃刮棒，灭菌棉签，试管架，煤气灯或酒精灯，废物缸，接种棉签，试管架，煤气灯或酒精灯，废物缸，接种环，无菌玻璃吸管，吸气器，载玻片，盖玻片，环，无菌玻璃吸管，吸气器，载玻片，盖玻片，显微镜，双层瓶，擦镜纸，平皿，显微镜，双层瓶，擦镜纸，平皿，u u型玻棒，滴型玻棒，滴管，解剖针，解剖刀，生理盐水，管，解剖针，解剖刀，生理盐水，5050乙醇，乙醇，20%20%甘油甘油 ，高氏一号培养基平板，马铃薯琼脂薄，高氏一号培养基平板，马铃薯琼脂薄层平板等。层平板等。实验步骤实验步骤一、牛肉膏蛋白胨培养基的制备一、牛肉膏蛋白胨培养基的制备 牛肉膏牛肉膏 3.0g 3.0g 蛋白胨蛋白胨 10.0g 10.0g NaCl 5.0g NaCl 5.0g 水水 1000mL 1000mL pH 7.47.6 pH 7.47.6实验步骤实验步骤1.1.称量：按培养基配方比例依次准确地称取牛肉称量：按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、膏、蛋白胨、NaClNaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻璃放入烧杯中。牛肉膏常用玻璃棒挑取，放在小烧杯或玻璃皿中称量，用热水融棒挑取，放在小烧杯或玻璃皿中称量，用热水融化后倒入烧杯。也可以放在纸上称量，称量后直化后倒入烧杯。也可以放在纸上称量，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。量纸分离，然后立即取出纸片。2.2.融化：在上述烧杯中先加入少许所需要的水量，融化：在上述烧杯中先加入少许所需要的水量，用玻璃棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，用玻璃棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解。或在磁力搅拌器上加热溶解。实验步骤实验步骤3.3.调调pHpH：在未调：在未调pHpH之前，先用精密之前，先用精密pHpH试纸测量培试纸测量培养基原始养基原始pHpH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入加入1mol/L NaOH1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用，边加边搅拌，并随时用pHpH试试纸测其纸测其pHpH，直到，直到pHpH达到达到7.47.67.47.6。反之，用。反之，用1mol/L HCl1mol/L HCl进行调节。进行调节。4.4.过滤：趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些过滤：趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这实验结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验勿需过滤）。一步可以省去（本实验勿需过滤）。实验步骤实验步骤5.5.分装：按实验要求，可将配置的培养基分装入分装：按实验要求，可将配置的培养基分装入试管内和三角烧杯内。试管内和三角烧杯内。 液体分装：分装高度以试管高度的液体分装：分装高度以试管高度的1/41/4左右左右为宜。分装三角烧瓶的量则根据需要而定，一般为宜。分装三角烧瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角烧瓶容积的以不超过三角烧瓶容积的1/21/2为宜，如果是用于为宜，如果是用于振荡培养，则应根据通气量的要求酌情减少；有振荡培养，则应根据通气量的要求酌情减少；有的液体培养基在灭菌后，须要补加一定量的无菌的液体培养基在灭菌后，须要补加一定量的无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。成分，如抗生素等，则装量一定要准确。 固体分装：试管分装，其装量不超过管高的固体分装：试管分装，其装量不超过管高的1/51/5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶的容积的超过三角烧瓶的容积的1/21/2为宜。为宜。 半固体分装：试管一般以试管高度的半固体分装：试管一般以试管高度的1/31/3为为宜，灭菌后垂直待凝。宜，灭菌后垂直待凝。实验步骤实验步骤6.6.加塞：培养基分装完毕后，在试管口或三角烧加塞：培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料及试管帽等），以瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料及试管帽等），以阻止外界微生物进入培养基而造成污染。阻止外界微生物进入培养基而造成污染。7.7.包扎：加塞后，将全部试管用麻绳捆绑好，再包扎：加塞后，将全部试管用麻绳捆绑好，再在面塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润在面塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳包好。用记号笔注明湿棉塞，其外再用一道麻绳包好。用记号笔注明培养基名称、组别、配置日期。三角烧瓶加塞后，培养基名称、组别、配置日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、配置日期。配置日期。实验步骤实验步骤8.8.灭菌：将上述培养基以灭菌：将上述培养基以0.1MPa0.1MPa，121121，20min20min高压蒸汽灭菌。高压蒸汽灭菌。9.9.搁置斜面：将灭菌的试管培养基冷至搁置斜面：将灭菌的试管培养基冷至5050左右左右（以防斜面上冷凝水太多）将试管口端搁在玻璃（以防斜面上冷凝水太多）将试管口端搁在玻璃棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长度的一般为宜。不超过试管总长度的一般为宜。10.10.无菌检查：将灭菌培养基放在无菌检查：将灭菌培养基放在3737的温室中的温室中培养培养2448h2448h，以检查灭菌是否彻底。，以检查灭菌是否彻底。实验步骤实验步骤二、无菌试验二、无菌试验1.1.标记标记分别在两套平板的底部划分出四个小区，并在其分别在两套平板的底部划分出四个小区，并在其边缘上写上自己的名字和日期，在四个小区内分边缘上写上自己的名字和日期，在四个小区内分别标明待接种的样品名称，为了不影响观察，可别标明待接种的样品名称，为了不影响观察，可用符号或数字代表。在另外两套平板的底部，用用符号或数字代表。在另外两套平板的底部，用记号笔写上姓名、日期以及记号笔写上姓名、日期以及“空气空气1”1”和和“空气空气2”2”。2.2.人体表面微生物的观察人体表面微生物的观察手指表面：在火焰旁，半开皿盖，用洗前的手指手指表面：在火焰旁，半开皿盖，用洗前的手指在平板的在平板的A A区域轻轻按一下，迅速盖上皿盖。然区域轻轻按一下，迅速盖上皿盖。然后用肥皂洗手两次，自然干燥后，在后用肥皂洗手两次，自然干燥后，在B B区轻轻按区轻轻按一下，迅速盖上皿盖。一下，迅速盖上皿盖。实验步骤实验步骤3.3.实验室环境的检查实验室环境的检查将标有将标有“空气空气1”1”的平板在实验室打开皿盖，的平板在实验室打开皿盖，使琼脂培养基表面完全暴露在空气中；将另一个使琼脂培养基表面完全暴露在空气中；将另一个标有标有“空气空气2”2”的平板放在已灭菌的无菌操作箱的平板放在已灭菌的无菌操作箱（室）内，打开皿盖，（室）内，打开皿盖，1h1h后盖上两个皿盖。后盖上两个皿盖。取出灭菌湿棉签，在实验台面擦拭约取出灭菌湿棉签，在实验台面擦拭约2cm22cm2的范的范围，然后将棉签从平板的开启出伸进平板表面，围，然后将棉签从平板的开启出伸进平板表面，在在E E区滚动一下，立即闭合皿盖，放回棉签。用区滚动一下，立即闭合皿盖，放回棉签。用同样的方法将擦拭了门旋钮的棉签在同样的方法将擦拭了门旋钮的棉签在F F区进行滚区进行滚动接种，将沾有灰尘的棉签在动接种，将沾有灰尘的棉签在G G区接种。将灭菌区接种。将灭菌棉签在棉签在H H区接种。区接种。实验步骤实验步骤4.4.培养培养将所有的琼脂平板翻转，使皿底朝上，置将所有的琼脂平板翻转，使皿底朝上，置3737培培养养12d12d。实验步骤实验步骤三、接种三、接种（一）、用接种环转接菌种（一）、用接种环转接菌种1.1.用记号笔分别标记用记号笔分别标记3 3支肉汤营养琼脂斜面为支肉汤营养琼脂斜面为A A（接菌）、（接菌）、B B（接无菌水）、（接无菌水）、C C（非无菌操作）和（非无菌操作）和3 3支液体培养基为支液体培养基为D D（接菌）、（接菌）、E E（接无菌水）和（接无菌水）和F F（不接种）。（不接种）。2.2.左手持大肠杆菌斜面培养物，右手持接种环，左手持大肠杆菌斜面培养物，右手持接种环，将接种环进行火焰灼烧灭菌将接种环进行火焰灼烧灭菌( (烧至发红），然后烧至发红），然后在火焰旁打开斜面培养物的试管帽（管帽不能放在火焰旁打开斜面培养物的试管帽（管帽不能放在桌上），并将管口在火焰上烧一下。在桌上），并将管口在火焰上烧一下。实验步骤实验步骤3.3.在火焰旁，将接种环轻轻插入斜面培养物试管在火焰旁，将接种环轻轻插入斜面培养物试管的上半部（此时不要接触斜面培养物），至少冷的上半部（此时不要接触斜面培养物），至少冷却却5s5s后，挑取少许培养物（菌苔）后，再烧一下后，挑取少许培养物（菌苔）后，再烧一下管口，盖上管帽并将其放回试管架中。管口，盖上管帽并将其放回试管架中。实验步骤实验步骤4.4.用左手迅速从试管架上取出用左手迅速从试管架上取出A A管，在火焰旁取管，在火焰旁取下管帽，管口在火焰上烧一下，将沾有少量菌苔下管帽，管口在火焰上烧一下，将沾有少量菌苔的接种环迅速放进的接种环迅速放进A A管斜面的底部（接种环不要管斜面的底部（接种环不要碰到试管口边）并从下至上划一直线，然后再从碰到试管口边）并从下至上划一直线，然后再从其底部开始向上作蛇形划线接种。完毕后，同样其底部开始向上作蛇形划线接种。完毕后，同样烧一下管口，盖上管帽，将接种环在火焰上灼烧烧一下管口，盖上管帽，将接种环在火焰上灼烧后放回原处。如果是向盛有液体培养基的试管和后放回原处。如果是向盛有液体培养基的试管和三角烧瓶中接种，则应将挑有菌苔的接种环首先三角烧瓶中接种，则应将挑有菌苔的接种环首先在液体表面的管内壁上轻轻摩擦，使菌体分散从在液体表面的管内壁上轻轻摩擦，使菌体分散从环上脱开，进入液体培养基中。环上脱开，进入液体培养基中。实验步骤实验步骤5.5.按上述方法从盛有无菌水的试管中取一环无菌按上述方法从盛有无菌水的试管中取一环无菌水于水于B B管中，同样划线接种。管中，同样划线接种。6.6.以非无菌操作为对照：在无酒精灯或煤气灯的以非无菌操作为对照：在无酒精灯或煤气灯的条件下，用未经灭菌的接种环从另一盛有无菌水条件下，用未经灭菌的接种环从另一盛有无菌水的试管中取一环水划线接种到的试管中取一环水划线接种到C C管中。管中。上述无菌操作技术也可将待接和被接的上述无菌操作技术也可将待接和被接的2 2支试管支试管同时拿在左手上进行。同时拿在左手上进行。实验步骤实验步骤（二）、用吸管转接菌液（二）、用吸管转接菌液1.1.轻轻摇动盛菌液的试管（不要溅到管口或管帽轻轻摇动盛菌液的试管（不要溅到管口或管帽上），暂放回试管架上。上），暂放回试管架上。2.2.从已灭菌的吸管筒中取出一支吸管，将其插入从已灭菌的吸管筒中取出一支吸管，将其插入吸气器下端，然后按无菌操作要求，将吸管插入吸气器下端，然后按无菌操作要求，将吸管插入已摇匀的菌液中，吸取已摇匀的菌液中，吸取0.5ml0.5ml菌液并迅速转移至菌液并迅速转移至D D管中。管中。3.3.取下吸气器，将用过的吸管放入废物筒中。筒取下吸气器，将用过的吸管放入废物筒中。筒底必须垫有泡沫塑料等软垫，以防吸管嘴破损。底必须垫有泡沫塑料等软垫，以防吸管嘴破损。4.4.换另一支无菌吸管，按上述同样方法从盛无菌换另一支无菌吸管，按上述同样方法从盛无菌水的试管中吸取吸取水的试管中吸取吸取0.5ml0.5ml菌液转移至菌液转移至E E管中。管中。在使用吸管操作过程中，手指不要接触其下端。在使用吸管操作过程中，手指不要接触其下端。实验步骤实验步骤五、细菌制片及简单染色五、细菌制片及简单染色1.1.涂片涂片取一块载玻片，用记号笔平均分为两个区域并标取一块载玻片，用记号笔平均分为两个区域并标记；各滴一小滴生理盐水于两个区域中央；用接记；各滴一小滴生理盐水于两个区域中央；用接种环无菌操作分别由枯草芽孢杆菌营养琼脂斜面种环无菌操作分别由枯草芽孢杆菌营养琼脂斜面和金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面挑取适量菌苔，和金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面挑取适量菌苔，将沾有菌苔的接种环置于载玻片的生理盐水中涂将沾有菌苔的接种环置于载玻片的生理盐水中涂抹，使菌悬液在载玻片上形成均匀薄膜。若用液抹，使菌悬液在载玻片上形成均匀薄膜。若用液体培养基涂片，可用接种环蘸取体培养基涂片，可用接种环蘸取1212环菌液直接环菌液直接涂于载玻片上。涂于载玻片上。实验步骤实验步骤2.2.干燥干燥自然干燥或用电吹风干燥。自然干燥或用电吹风干燥。3.3.固定固定涂菌面朝上，通过火焰涂菌面朝上，通过火焰2323次。次。4.4.染色染色将载玻片平放于载玻片支架上，滴加染液覆盖涂将载玻片平放于载玻片支架上，滴加染液覆盖涂菌部位即可，吕氏碱性美篮菌部位即可，吕氏碱性美篮1.5min1.5min，草酸铵结晶，草酸铵结晶紫染液或齐氏石炭酸复红染液紫染液或齐氏石炭酸复红染液1min1min。5.5.水洗水洗倾去染液，自来水冲洗，水流不宜过急、过大，倾去染液，自来水冲洗，水流不宜过急、过大，勿直接冲涂片处，至洗出无色水为止。勿直接冲涂片处，至洗出无色水为止。实验步骤实验步骤6.6.干燥干燥用吸水纸吸去多余水分，自然干燥或用电吹风干用吸水纸吸去多余水分，自然干燥或用电吹风干燥。燥。7.7.镜检镜检将制备好的样片置于显微镜下进行观察、记录。将制备好的样片置于显微镜下进行观察、记录。实验结果实验结果试管试管ABCDEF生长状况有单一菌落无菌落有多种菌落显微镜下只能观察到大肠杆菌无菌体可观察到多种形态的菌种简要说明菌落边缘整齐，圆形，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰白色未接种目的菌，也无杂菌污染非无菌操作，有杂菌污染两端钝圆的短小杆菌未接种目的菌，也无杂菌污染非无菌操作，有杂菌污染注意事项注意事项1.1.要严格按配方配制。要严格按配方配制。2.2.调调pHpH不要过头。不要过头。3.3.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。空气，到时降压回零取物。4 4无菌操作需要在火焰旁进行，因此，在操作无菌操作需要在火焰旁进行，因此，在操作时要小心，不要将手烫伤。时要小心，不要将手烫伤。5.5.禁止用嘴吸取菌液禁止用嘴吸取菌液6.6.用接种环将菌体与染液混合时不要剧烈涂抹，用接种环将菌体与染液混合时不要剧烈涂抹，以免破坏细胞。以免破坏细胞。7.7.滴加染液要适中，否则用盖玻片覆盖时，染液滴加染液要适中，否则用盖玻片覆盖时，染液过多会溢出，过少会产生大量气泡。过多会溢出，过少会产生大量气泡。8.8.盖玻片要缓慢倾斜覆盖，以免产生气泡。盖玻片要缓慢倾斜覆盖，以免产生气泡。思考思考因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。如果压力未降到如果压力未降到0 0时，打开排气阀，就会因锅内时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。染培养基而发生污染。1. 1. 高压蒸汽灭菌开始之前为什么要将锅高压蒸汽灭菌开始之前为什么要将锅内的冷空气排尽？内的冷空气排尽？思考思考首先要记住：没有一种条件或培养基能使所有首先要记住：没有一种条件或培养基能使所有的微生物生长。本实验中所用的培养基是一种的微生物生长。本实验中所用的培养基是一种丰富培养基，可以支持大量不同的微生物生长，丰富培养基，可以支持大量不同的微生物生长，因此可以满足本实验的要求。因此可以满足本实验的要求。2.2.为什么用肉膏蛋白胨琼脂培养基？为什么用肉膏蛋白胨琼脂培养基？思考思考答：防止菌种污染环境，违背无菌操作技术原答：防止菌种污染环境，违背无菌操作技术原则。则。3. 3. 为什么接种完毕后，接种环还必须灼为什么接种完毕后，接种环还必须灼烧后再放回原处，吸管也必须放进废物筒烧后再放回原处，吸管也必须放进废物筒中？中？思考思考答：答：1.1.产生的高温可以消灭细胞，避免细胞交产生的高温可以消灭细胞，避免细胞交叉污染叉污染 2. 2.火焰的温度能够使气流形成负压，在酒火焰的温度能够使气流形成负压，在酒精灯周围精灯周围10cm10cm处形成一个无菌区。处形成一个无菌区。4. 4. 为什么酒精灯外焰可以形成无菌区域为什么酒精灯外焰可以形成无菌区域小结小结1.1.获得试验成功的关键获得试验成功的关键牢固树立无菌牢固树立无菌概念，细心、认真体会无菌操作的要领。概念，细心、认真体会无菌操作的要领。2.2.了解掌握不同菌落形态了解掌握不同菌落形态细菌细菌细菌是原核微生物，故形成的菌细菌是原核微生物，故形成的菌落也小；细菌个体之间充满着水落也小；细菌个体之间充满着水分，所以整个菌落显得湿润，易分，所以整个菌落显得湿润，易被接种环挑起；球菌形成隆起的被接种环挑起；球菌形成隆起的菌落；有鞭毛细菌常形成边缘不菌落；有鞭毛细菌常形成边缘不规则的菌落；具有荚膜的菌落表规则的菌落；具有荚膜的菌落表面较透明，边缘光滑整齐；有芽面较透明，边缘光滑整齐；有芽孢孢 的菌落表面干燥皱褶；有些能的菌落表面干燥皱褶；有些能产生色素的细菌菌落还显出鲜艳产生色素的细菌菌落还显出鲜艳的颜色。较难挑起。的颜色。较难挑起。霉菌霉菌常呈绒毛状、絮状或蜘蛛网状，有时还能常呈绒毛状、絮状或蜘蛛网状，有时还能呈红、褐、绿、黑、黄等不同颜色呈红、褐、绿、黑、黄等不同颜色酵母菌酵母菌大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。大肠杆菌大肠杆菌在普通琼脂培养基上面都是一样的在普通琼脂培养基上面都是一样的, ,圆形圆形边缘整齐，表面光滑，半透明，小凸起。边缘整齐，表面光滑，半透明，小凸起。典型的大肠杆菌在伊红美蓝琼脂平板上的典型的大肠杆菌在伊红美蓝琼脂平板上的特征为：深紫黑色、光滑、湿润、带有金特征为：深紫黑色、光滑、湿润、带有金属光泽的圆形菌落。镜检为革兰氏阴性属光泽的圆形菌落。镜检为革兰氏阴性（红色）无芽孢杆菌。（红色）无芽孢杆菌。金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌在在BPBP培养基上，圆形，光滑，凸起湿润，培养基上，圆形，光滑，凸起湿润，颜色呈黑灰色，边缘整齐、周边浑浊，外颜色呈黑灰色，边缘整齐、周边浑浊，外层有一透明带。在血平板上，圆形，金黄层有一透明带。在血平板上，圆形，金黄色，凸起，表面光滑，有溶血圈。镜检为色，凸起，表面光滑，有溶血圈。镜检为革兰氏阳性，呈葡萄状排列。革兰氏阳性，呈葡萄状排列。谢谢THANKS！