1.2启动子启动子编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNA聚合聚合酶结合位点酶结合位点 基因包括编码区和非编码区基因包括编码区和非编码区 -转录时的关键转录时的关键RNA聚合酶的作用聚合酶的作用 -转录时转录时,非编码区和非编码区和RNA聚合酶结合聚合酶结合,催催 化编码区转录化编码区转录编码蛋白质编码蛋白质(编码序列编码序列)调控遗传信息表达的核苷酸序列调控遗传信息表达的核苷酸序列调控遗传信息表达的核苷酸序列调控遗传信息表达的核苷酸序列(调控序列调控序列)终止终止子子一、原核细胞的基因结构一、原核细胞的基因结构 二、真核细胞的基因结构二、真核细胞的基因结构编码区编码区编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区编码区下游编码区下游调控遗传信息的表达调控遗传信息的表达调控遗传信息的表达调控遗传信息的表达( (调控序列调控序列调控序列调控序列) )外显子外显子外显子外显子( (能编码蛋白质能编码蛋白质能编码蛋白质能编码蛋白质) )内含子内含子内含子内含子( (不能编码蛋白质不能编码蛋白质不能编码蛋白质不能编码蛋白质) )编码区上游编码区上游启动子启动子终止终止子子三、基因工程的操作过程三、基因工程的操作过程1、什么叫目的基因：、什么叫目的基因： 主要指编码蛋白质的主要指编码蛋白质的结构基因结构基因，也可，也可以是一些具有以是一些具有调控调控作用的作用的因子因子 如苏云金芽孢杆菌的如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因抗虫基因， 植物的植物的抗病抗病（抗病毒抗病毒、抗细菌抗细菌）基因基因、 种子种子贮藏蛋白的基因贮藏蛋白的基因，以及人的以及人的胰岛素胰岛素基因基因、干扰素基因干扰素基因等等。第一步、目的基因的获取 .从基因文库中获取目的基因 . 利用PCR技术扩增目的基因 2、怎样获取目的基因获取目的基因是实施基因工程的第一步获取目的基因是实施基因工程的第一步 从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为含有这种生物的不同基因，称为基因文库基因文库1.1.什么叫基因文库？什么叫基因文库？寻根问底寻根问底 为什么要构建基因文库？直接从含有目的基为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？因的生物体内提取不行吗？ 提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过以通过PCR方式从含有该基因的生物的方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，中，直接获得，也可以通过反转录，用也可以通过反转录，用PCR方式从方式从mRNA中获得，不一定中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。组序列，往往就需要构建基因文库。2、基因文、基因文库的分类库的分类 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如:cDNA文库）文库）包含了一种生物所有的基因包含了一种生物所有的基因包含了一种生物的一部分基因包含了一种生物的一部分基因基因组基因组文库与文库与部分基部分基因文库因文库的关系的关系3、部分部分 怎样从基因文库怎样从基因文库中得到我们所需的目中得到我们所需的目的基因呢的基因呢? ?4.4.基因文库的构建方法基因文库的构建方法 鸟鸟枪法枪法：反转录法：反转录法：直接合成法直接合成法 根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 ：人工合成基因法人工合成基因法直接分离基因直接分离基因用限制用限制酶切断成酶切断成许多片段许多片段将供体生物的将供体生物的DNADNA用限制酶切用限制酶切割为许多片段，再用运载体将这割为许多片段，再用运载体将这些片段都运载到受体生物的不同些片段都运载到受体生物的不同细胞中去。只要有一个细胞获得细胞中去。只要有一个细胞获得了需要的目的基因并得以表达，了需要的目的基因并得以表达，基因工程就算成功了。该法最大基因工程就算成功了。该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能将真作量大，成功率低。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中核生物的基因转移到原核生物中去。去。直接分离基因直接分离基因鸟枪法鸟枪法鸟枪法：鸟枪法：供体细胞中的供体细胞中的DNADNA许多许多DNADNA片段片段运载体运载体限制酶限制酶与载体连接与载体连接载入载入受体细胞受体细胞产生特定性状产生特定性状导入导入外源外源DNADNA扩增扩增目的基因目的基因分离分离( (直接分离法直接分离法) )的过程的过程人工合成基因法人工合成基因法DNADNA合成仪合成仪直接合成法：根直接合成法：根据蛋白质的氨基酸顺序据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使推算出信使RNARNA核苷酸核苷酸顺序，再据此推算出基顺序，再据此推算出基因因DNADNA的脱氧核苷酸顺的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。直接合成相应的基因。 逆转录法：以信使逆转录法：以信使RNARNA为模板，在逆转录酶为模板，在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合成合成的作用下将脱氧核苷酸合成合成DNA(DNA(基因基因) )。反转录法的过程：反转录法的过程： 以目的基因转录以目的基因转录成的信使成的信使RNARNA为模为模板，反转录成互补板，反转录成互补的单链的单链DNADNA，然后，然后在酶的作用下合成在酶的作用下合成双链双链DNADNA，从而获，从而获得所需的基因。得所需的基因。目的基因的目的基因的mRNAmRNA杂交双链杂交双链( (单链单链RNA/RNA/单链单链DNA)DNA)单链单链DNADNA反转录酶反转录酶核酸酶核酸酶H HDNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNADNA( (目的基因目的基因) )根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 ： 根据已知蛋白质根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测的氨基酸序列，推测出相应的信使出相应的信使RNARNA序序列，然后按照碱基互列，然后按照碱基互补配对原则，推测出补配对原则，推测出它的结构基因的核苷它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点优点缺点缺点鸟枪法鸟枪法反转录法反转录法根据已知氨基根据已知氨基酸合成酸合成DNADNA法法操作简便操作简便广泛使用广泛使用工作量大，盲目，工作量大，盲目，分离出来的有时并分离出来的有时并非一个基因非一个基因专一性强专一性强操作过程麻烦，操作过程麻烦，mRNAmRNA很不稳定，要很不稳定，要求的技术条件较高求的技术条件较高专一性最强专一性最强仅限于合成核苷酸仅限于合成核苷酸对较少的简单基因对较少的简单基因提问：你能推测出由mRNA反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗？第一步，反转录酶以第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与为模板合成一条与RNA互互补的补的DNA单链，形成单链，形成RNA DNA杂交分子。杂交分子。第二步，核酸酶第二步，核酸酶H使使RNADNA杂交分子中的杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链第三步，以单链DNA为模板，在为模板，在DNA聚合酶的作用聚合酶的作用下合成另一条互补的下合成另一条互补的DNA链，形成双链链，形成双链DNA分子。分子。由由由由mRNAmRNA反转录形成反转录形成反转录形成反转录形成cDNAcDNA的过程的过程的过程的过程第一步，反转录酶以第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与为模板合成一条与RNA互互补的补的DNA单链，形成单链，形成RNA DNA杂交分子。杂交分子。第二步，核酸酶第二步，核酸酶H使使RNADNA杂交分子中的杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链第三步，以单链DNA为模板，在为模板，在DNA聚合酶的作用聚合酶的作用下合成另一条互补的下合成另一条互补的DNA链，形成双链链，形成双链DNA分子。分子。.如何从基因文库中找到所需要的基因？如何从基因文库中找到所需要的基因？ 从基因文库中找到目的基因是一件比较复杂从基因文库中找到目的基因是一件比较复杂的事情，要根据目的基因已有的某些信息来进的事情，要根据目的基因已有的某些信息来进行。下面介绍一种根据基因的部分核苷酸序列行。下面介绍一种根据基因的部分核苷酸序列找到目的基因的方法。找到目的基因的方法。 第一步，通过第一步，通过PCR方法将目的基因已知的方法将目的基因已知的部分核苷酸序列扩增出来，进行放射性同位素部分核苷酸序列扩增出来，进行放射性同位素标记（也可以用别的标记方法进行，如生物素、标记（也可以用别的标记方法进行，如生物素、荧光素等），即用标记了放射性同位素的目的荧光素等），即用标记了放射性同位素的目的DNA片段作为探针，与扩增出来的片段作为探针，与扩增出来的DNA杂交。杂交。 第二步，将基因文库中的所有菌落转移至硝酸第二步，将基因文库中的所有菌落转移至硝酸纤维膜上（也可以用其他类型的膜），然后，通过纤维膜上（也可以用其他类型的膜），然后，通过处理溶解消化掉细菌中的蛋白质，并使处理溶解消化掉细菌中的蛋白质，并使DNA固定在固定在膜上。膜上。 第三步，按第三步，按Southern (DNA与与DNA分子分子)杂交的杂交的方法进行杂交。方法进行杂交。 第四步，在第四步，在X光底片上出现黑斑的菌落，这表明光底片上出现黑斑的菌落，这表明这个菌落中含有所需要的目的基因（若选用别的标这个菌落中含有所需要的目的基因（若选用别的标记方法，有阳性信号的菌落则含有所需要的目的基记方法，有阳性信号的菌落则含有所需要的目的基因）。因）。 第五步，从该菌落中再提取目的基因第五步，从该菌落中再提取目的基因。 利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、 _ _、_ (_ (做启动子做启动子) )、 _._.前提条件：前提条件：原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增过程：过程：a a、DNADNA变性（变性（90-9690-96）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火（、退火（复性复性25-6525-65）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端延伸，合成与模板互补端延伸，合成与模板互补 的的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链 解释：解释： PCR的扩增过程是怎样的？的扩增过程是怎样的？ PCR扩增是获取目的基因的一种非常有用的方法，也是进行扩增是获取目的基因的一种非常有用的方法，也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。PCR的扩增反应过程包括的扩增反应过程包括以下几个主要过程。以下几个主要过程。 第一步：将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的第一步：将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）加热至加热至9095 ，使双链，使双链DNA模板两条链之间的氢键打开，变模板两条链之间的氢键打开，变成单链成单链DNA，作为互补链聚合反应的模板。，作为互补链聚合反应的模板。 第二步：将反应体系降温至第二步：将反应体系降温至5560 ，使两种引物分别与模，使两种引物分别与模板板DNA链链3端的互补序列互补配对，这个过程称为复性。端的互补序列互补配对，这个过程称为复性。 第三步：将反应体系升温至第三步：将反应体系升温至7075 ，在耐高温的，在耐高温的DNA聚合聚合酶催化作用下，将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的酶催化作用下，将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的3-OH上，使上，使DNA链延伸，产生一条与模板链互补的链延伸，产生一条与模板链互补的DNA链。链。上述三步反应完成后，一个上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个分子就变成了两个DNA分子，随分子，随着重复次数的增多，着重复次数的增多，DNA分子就以分子就以2n的形式增加。的形式增加。PCR的反应的反应过程都是在过程都是在PCR扩增仪中完成的。扩增仪中完成的。看看p11p11 第二步、基因表达载体的构建：第二步、基因表达载体的构建： 目的基因与运载体的结合过程，实际目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。上是不同来源的基因重组的过程。基因表达载体构建过程基因表达载体构建过程第二步、第二步、. .基因表达载体的构建：基因表达载体的构建：它们有什么作用？它们有什么作用？目的基因目的基因启动子启动子终止子终止子标记基因标记基因复制原点复制原点标记基因标记基因位于基因的首端的一段特殊的位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，片断，它是它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录了它才能驱动基因转录mRNA，最终获，最终获得蛋白质得蛋白质启动子：启动子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，片断，能终止能终止mRNA的转录的转录标记基因标记基因终止子终止子是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来从而将有目的基因的细胞筛选出来 基因工程载体的构建需要考虑哪些方面的因素？基因工程载体的构建需要考虑哪些方面的因素？ 道理何在？道理何在？ 主要考虑以下几方面的因素。主要考虑以下几方面的因素。（1）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的的cDNA。基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核。基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌无这些细胞器。无这些细胞器。（2）要选择强）要选择强启动子启动子或组织特异性启动子。启动子有强有弱，或组织特异性启动子。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。选择种子中特异表达的启动子。（3）要有选择）要有选择标记基因标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。转基因生物。1.1.用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。填空：基因表达载体的构建填空：基因表达载体的构建 核心核心3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNA DNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒） 核心核心同一种同一种基因表达载体的构建基因表达载体的构建图解图解 将所有将所有DNA直接导入受体细胞不是更直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？简便吗？如果这么做，结果会怎样？提示：有人采用总提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总化，即将一个生物中的总DNA提取出来，提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。格来讲不算基因工程。第三步第三步 将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞转化转化 方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达将目的基因导入植物细胞的方法：将目的基因导入植物细胞的方法： 农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法基基 因因 枪枪 法：法：适用于单子叶植物，但成本高适用于单子叶植物，但成本高花粉管通道法：花粉管通道法：简便经济简便经济花粉管通道法花粉管通道法程序：程序：程序：程序：先提纯目的基因，再先提纯目的基因，再先提纯目的基因，再先提纯目的基因，再体外注射入卵细胞或受精卵体外注射入卵细胞或受精卵体外注射入卵细胞或受精卵体外注射入卵细胞或受精卵中，最后将含目的基因的受中，最后将含目的基因的受中，最后将含目的基因的受中，最后将含目的基因的受精卵移植到输卵管或子宫中精卵移植到输卵管或子宫中精卵移植到输卵管或子宫中精卵移植到输卵管或子宫中发育成新个体。发育成新个体。发育成新个体。发育成新个体。方法：方法：显微注射法显微注射法将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞（1）思考：为什么选用微生物作为受体细胞？）思考：为什么选用微生物作为受体细胞？ 首先用首先用CaCa2+2+ 处理细胞处理细胞, ,以增大细菌细胞壁的以增大细菌细胞壁的以增大细菌细胞壁的以增大细菌细胞壁的通透性通透性通透性通透性, , , ,使细胞处于一种能吸收周围环境中使细胞处于一种能吸收周围环境中DNADNA分分子的生理状态子的生理状态, ,这种细胞称为这种细胞称为感受态细胞感受态细胞. . 大肠杆菌细胞最常用的转化大肠杆菌细胞最常用的转化方法方法是是: 第二步第二步使含有目的基因的重组质粒进入受体使含有目的基因的重组质粒进入受体使含有目的基因的重组质粒进入受体使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。细胞。细胞。细胞。将重组表达载体将重组表达载体DNADNA分子溶于缓冲液中与感分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合受态细胞混合, ,在一定的温度下促进感受态细胞吸在一定的温度下促进感受态细胞吸收收DNADNA分子分子, ,完成转化过程完成转化过程. . 第三步第三步目的基因在受体细胞内，随其繁殖而目的基因在受体细胞内，随其繁殖而目的基因在受体细胞内，随其繁殖而目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。间内就能获得大量的目的基因。间内就能获得大量的目的基因。间内就能获得大量的目的基因。（2）方法：）方法：1、导入到植物细胞常用的方法有农杆菌感染、导入到植物细胞常用的方法有农杆菌感染法（双子叶植物和祼子植物）、基因枪法（单法（双子叶植物和祼子植物）、基因枪法（单子叶植物）和花粉管通道法子叶植物）和花粉管通道法2、导入到动物细胞常用的方法是显微注射法、导入到动物细胞常用的方法是显微注射法3、导入到大肠杆菌时先用、导入到大肠杆菌时先用Ca2+处理成感受态，处理成感受态，后与溶有载体后与溶有载体DNA的缓冲液混合的缓冲液混合,吸收吸收DNA分分子子,完成转化完成转化目的基因导入受体细胞小结目的基因导入受体细胞小结第四步第四步 目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）（注意与上不同之处）抗原抗体杂交抗原抗体杂交检测检测检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因方法方法DNADNA分子杂交分子杂交Southern杂交杂交DNA和和DNA分子之间的杂交。目的基因是否分子之间的杂交。目的基因是否整合到受体生物的染色体整合到受体生物的染色体DNA中，这在真核生物中是目的基因中，这在真核生物中是目的基因可否稳定存在和遗传的关键。如何证明这一点，就需要通过可否稳定存在和遗传的关键。如何证明这一点，就需要通过Southern杂交技术。基本做法是：第一步，将受体生物杂交技术。基本做法是：第一步，将受体生物DNA提提取出来，经过适当的酶切后，走琼脂糖凝胶电泳，将不同大小取出来，经过适当的酶切后，走琼脂糖凝胶电泳，将不同大小的片段分开；第二步，将凝胶上的的片段分开；第二步，将凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素片段转移到硝酸纤维素膜上；第三步，用标记了放射性同位素（或生物素）的目的膜上；第三步，用标记了放射性同位素（或生物素）的目的DNA片段作为探针与硝酸纤维素膜上的片段作为探针与硝酸纤维素膜上的DNA进行杂交；第四步，进行杂交；第四步，将将X光底片压在硝酸纤维素膜上，在暗处使底片感光；第五步，光底片压在硝酸纤维素膜上，在暗处使底片感光；第五步，将将X光底片冲洗，如果在底片上出现黑色条带，则表明受体植物光底片冲洗，如果在底片上出现黑色条带，则表明受体植物染色体染色体DNA上有目的基因。上有目的基因。DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。 检测检测检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA方法方法 分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）（注意与上不同之处）Northern杂交杂交DNA和和RNA分子之间的杂分子之间的杂交。它是检测目的基因是否转录出交。它是检测目的基因是否转录出mRNA的方法，具体做法与的方法，具体做法与Southern杂交相同，杂交相同，只是第一步从受体植物中提取的是只是第一步从受体植物中提取的是mRNA而不是而不是DNA，杂交带的显现也与，杂交带的显现也与Southern(DNA与与DNA)杂交相同。杂交相同。检测检测检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质方法方法 抗原抗体杂交抗原抗体杂交Western杂交杂交蛋白质分子（抗原蛋白质分子（抗原抗体）之间的杂交。它抗体）之间的杂交。它是检测目的基因是否表达出蛋白质的一种方法。具体做法是：是检测目的基因是否表达出蛋白质的一种方法。具体做法是： 第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；第二步，将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗第二步，将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体（一抗）；体，并提取出抗体（一抗）；第三步，从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳；第三步，从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳；第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。由抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。由于这种抗原于这种抗原抗体的结合显示不出条带，所以加入一种称为二抗体的结合显示不出条带，所以加入一种称为二抗的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有特殊的标记。抗的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有特殊的标记。如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。n n什么是什么是什么是什么是DNADNA分子探针？分子探针？分子探针？分子探针？ 在含有目的基因的在含有目的基因的DNA片段上片段上用放射性同位素等作标记，以此作用放射性同位素等作标记，以此作为探针。即叫基因探针。为探针。即叫基因探针。看p14第四步目的基因的检测和表达第四步目的基因的检测和表达大量的受体细胞接受不多的目的基因。处理大量的受体细胞接受不多的目的基因。处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。将它从中检测出来。 将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。无表达产物无表达产物无表达产物无表达产物有表达产物有表达产物无表达产物无表达产物思考与探究思考与探究 1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？成任务吗？为什么？ 答：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发答：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制条件，如启动子、终止子和标记挥作用，还需要有其他控制条件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述条件的主要理由是：基因等。必须构建上述条件的主要理由是：（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；的启动子才能比较有利于基因的表达；（2） 通过通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；码序列导入受体生物中无法转录；（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控条件，如增强启动子等；他调控条件，如增强启动子等；（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。 2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你应该如何做？从理论上说，你应该如何做？ 提示：农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在植物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中。据不完全统计，约有93属643种双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。裸子植物对该菌也敏感。当这些植物被该菌侵染后会诱发肿瘤。近年来，也有报道该菌对单子叶植物也有侵染能力。 根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根瘤农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。近年来还发现一些中性糖，如L-阿拉伯糖、D-木糖等也有诱导作用。酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中Ti质粒上Vir区（毒性区）基因的诱导物，使Vir区基因活化，导致T-DNA的加工和转移，从而侵染植物细胞。 需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力有差别，在基因工程中需要加以选择使用。利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的，同时单子叶植物种类不同，农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。 3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？以用大肠杆菌吗？ 提示：有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，提示：有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。这种糖蛋白是不可能的。 4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋珠蛋白，想一想，应如何进行设计？白，想一想，应如何进行设计？ 提示：基本操作如下：提示：基本操作如下：（1）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。）。（2）将）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其珠蛋白基因已进入其中。中。（4）培养进入了）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取后从中提取-珠蛋白。珠蛋白。1）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （ ） A、所所有有的的限限制制酶酶只只能能识识别别一一种种特特定定的的核核苷苷酸序列酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运运载载体体必必须须具具备备的的条条件件之之一一是是：具具有有多多个限制酶切点，以便与外源基因连接个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来、基因控制的性状都能在后代表现出来C C练习练习2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能能复复制制 （ ） B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNAD D练习练习3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶人工合成目的基因不用限制性内切酶A A练习练习4）有有关关基基因因工工程程的的叙叙述述正正确确的的是是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D、蛋蛋白白质质的的结结构构可可为为合合成成目目的的基基因因提提供供资料资料D D练习练习5）基基因因工工程程是是在在DNA分分子子水水平平上上进进行行设设计计施施工工的的。在在基基因因操操作作的的基基本本步步骤骤中中，不不进进行行碱碱基基互互补补配配对对的的步步骤骤是是 （ ） A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达C C练习练习下课啦!