1第第1717讲讲 抗抗 生生 素素 发发 酵酵 生生 产产 技技 术术Antibiotics Fermentation Production21.概述概述;2.生产前期研究生产前期研究;3.生产菌改良生产菌改良;4.生产工艺过程生产工艺过程;5.发酵条件的控制发酵条件的控制;6.提取和精制提取和精制.主要内容主要内容3 生存竞争说：生存竞争说：共生与拮抗，抗生素是拮抗菌分泌共生与拮抗，抗生素是拮抗菌分泌的用来与别的微生物战斗的武器。的用来与别的微生物战斗的武器。 代谢说：代谢说：抗生素的产生是由于生物的代谢功能，抗生素的产生是由于生物的代谢功能，而抗生素的抗生现象，只是其作用表现。而抗生素的抗生现象，只是其作用表现。 证据：证据：生产中一定要求纯培养；抗生素生产一般生产中一定要求纯培养；抗生素生产一般不用诱导物；抗生素生产可加入一些前体；某些微生不用诱导物；抗生素生产可加入一些前体；某些微生物在人工合成的培养基才能生产抗生素；有时抗生素物在人工合成的培养基才能生产抗生素；有时抗生素的生产也不一定使菌体达到竞争的目的。的生产也不一定使菌体达到竞争的目的。第第1717讲讲 抗生素发酵生产工艺学抗生素发酵生产工艺学1. 概述概述41.2 1.2 抗生素的定义和命名抗生素的定义和命名（1）抗生素的定义抗生素的定义 早期：早期：一般认为来源于微生物，且主要作用于细一般认为来源于微生物，且主要作用于细菌感染。故认为菌感染。故认为抗生素抗生素(antibiotics)是微生物在代谢过是微生物在代谢过程中产的，在低浓度下就能抑制它种微生物生长和活程中产的，在低浓度下就能抑制它种微生物生长和活动，甚至杀死他种微生物的化学物质。由于抗生素的动，甚至杀死他种微生物的化学物质。由于抗生素的这种杀菌能力，我们曾经把这类物质叫做这种杀菌能力，我们曾经把这类物质叫做抗菌素抗菌素。5现在：现在： 来源：随着抗生素研究和生产的发展，新的抗生来源：随着抗生素研究和生产的发展，新的抗生素的来源正在扩大。可以是微生物、植物（如蒜素、素的来源正在扩大。可以是微生物、植物（如蒜素、常山碱、黄连素、长春花碱、鱼腥草素等）常山碱、黄连素、长春花碱、鱼腥草素等） 、动物、动物（如鱼素、红血球素等）。（如鱼素、红血球素等）。 但抗生素的工业化生产主要是来自微生物的大量但抗生素的工业化生产主要是来自微生物的大量发酵法，微生物是抗生素舞台上的主角。发酵法，微生物是抗生素舞台上的主角。 作用对象：病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生作用对象：病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫、藻类、肿瘤细胞等。因此不能把抗生素仅仅作为虫、藻类、肿瘤细胞等。因此不能把抗生素仅仅作为抗菌药物。抗菌药物。 6定义：定义： 虽然抗生素已被广泛使用，但是由于抗生素的多虽然抗生素已被广泛使用，但是由于抗生素的多样性，关于抗生素的定义在专家中一直存在着分歧。样性，关于抗生素的定义在专家中一直存在着分歧。 目前，一个目前，一个大多数专家所接受的定义大多数专家所接受的定义是：抗生素是：抗生素是由生物（包括某些微生物、植物和动物在内）在其是由生物（包括某些微生物、植物和动物在内）在其生命活动过程中产生的，能在低浓度下有选择地抑制生命活动过程中产生的，能在低浓度下有选择地抑制他种生物机能的低分子量的有机物质。他种生物机能的低分子量的有机物质。 狭义的定义是：抗生素是低分子量的微生物代谢狭义的定义是：抗生素是低分子量的微生物代谢产物，能在很低的浓度下抑制其他微生物的生长。产物，能在很低的浓度下抑制其他微生物的生长。7 掌握狭义的抗生素这个概念，需要把握以下几点：掌握狭义的抗生素这个概念，需要把握以下几点：A A、低分子量、低分子量 分子量一般不超过几千。如溶菌酶这类酶及其他分子量一般不超过几千。如溶菌酶这类酶及其他复杂的蛋白质分子虽然也具有抗菌活性，但由于它们复杂的蛋白质分子虽然也具有抗菌活性，但由于它们的分子量很大，因而在习惯上不将它们归入抗生素一的分子量很大，因而在习惯上不将它们归入抗生素一类。类。8B B、天然代谢产物、天然代谢产物 只有微生物的天然代谢产物才能称为抗生素，通只有微生物的天然代谢产物才能称为抗生素，通过化学修饰的只能称为半合成抗生素，根据天然抗生过化学修饰的只能称为半合成抗生素，根据天然抗生素的结构完全采用化学合成方法制造的则称为全合成素的结构完全采用化学合成方法制造的则称为全合成抗生素。抗生素。C C、抑制其他微生物生长、抑制其他微生物生长 是指抑制细胞的繁殖，因此是针对微生物群体而是指抑制细胞的繁殖，因此是针对微生物群体而不是个别细胞而言的。这种抑制作用一类是永久性的，不是个别细胞而言的。这种抑制作用一类是永久性的，例如杀细菌剂和杀霉菌剂等可以将微生物杀死；另一例如杀细菌剂和杀霉菌剂等可以将微生物杀死；另一类抗生素只能起到抑制微生物繁殖生长的作用，但不类抗生素只能起到抑制微生物繁殖生长的作用，但不能将它们杀死。能将它们杀死。9D D、低浓度、低浓度 因为在高浓度下，即使是正常的细胞组分，如因为在高浓度下，即使是正常的细胞组分，如甘甘氨酸和亮氨酸氨酸和亮氨酸，也会对细菌的生长产生抑制作用。基，也会对细菌的生长产生抑制作用。基于同样的理由，一些厌氧发酵产物，如乙醇和丁醇，于同样的理由，一些厌氧发酵产物，如乙醇和丁醇，虽然在高浓度下也有杀菌或抑菌作用，也不属于抗生虽然在高浓度下也有杀菌或抑菌作用，也不属于抗生素。典型的抗生素的抗菌活性非常高，只要在微摩尔素。典型的抗生素的抗菌活性非常高，只要在微摩尔甚至纳摩尔浓度时就会有显著的抗菌活性。甚至纳摩尔浓度时就会有显著的抗菌活性。 自从自从A. FlemingA. Fleming于于19291929年发现第一种广泛用于医疗年发现第一种广泛用于医疗上的抗生素以来，至今已找到上的抗生素以来，至今已找到1 1万种以上新抗生素万种以上新抗生素（19841984）和合成了）和合成了7 7万多种的半合成抗生素，但真正得万多种的半合成抗生素，但真正得到临床应用的常用抗生素仅约五六十种。到临床应用的常用抗生素仅约五六十种。10第第1717讲讲 抗生素发酵生产工艺学抗生素发酵生产工艺学历史历史19291929年，英国弗莱明发现青霉素年，英国弗莱明发现青霉素二战期间，大规模发酵生产二战期间，大规模发酵生产世界上最早用于临床的抗菌素世界上最早用于临床的抗菌素 11 治疗和发展治疗和发展我国的发展：我国的发展： 19531953年年5 5月月1 1日，建立了第一个生产青霉素的抗日，建立了第一个生产青霉素的抗生素工厂（上海第三制药厂）；生素工厂（上海第三制药厂）； 19581958年年6 6月月3 3日，最大的抗生素联合企业建成投日，最大的抗生素联合企业建成投产（华北制药厂产（华北制药厂, ,石家庄）石家庄） 目前，多为原料药基地。但在半合成及成品药目前，多为原料药基地。但在半合成及成品药的剂型方面与国外相比差距很大。的剂型方面与国外相比差距很大。12第第1717讲讲 抗生素发酵生产工艺学抗生素发酵生产工艺学 抗生素的分类主要是便于研究，不同学科和抗生素的分类主要是便于研究，不同学科和科研人员因出发点不同有不同的分类体系。科研人员因出发点不同有不同的分类体系。 可根据可根据生物来源生物来源、作用对象作用对象、化学结构化学结构、作作用机制用机制、生物合成途径生物合成途径等方面对抗生素进行分类。等方面对抗生素进行分类。13第第1717讲讲 抗生素发酵生产工艺学抗生素发酵生产工艺学1.4.1 1.4.1 根据抗生素的生物来源分类根据抗生素的生物来源分类 ( (生物学家生物学家) ) （1 1）放线菌产生的抗生素：）放线菌产生的抗生素：如链霉素、四环类如链霉素、四环类（如四环素）、大环内酯类（如红霉素）、多烯类（如四环素）、大环内酯类（如红霉素）、多烯类（如制霉菌素）（如制霉菌素） 、放线菌素类（如放线菌素、放线菌素类（如放线菌素D D）等。）等。（其中链霉菌属最多，诺卡氏菌属、小单孢菌次之）（其中链霉菌属最多，诺卡氏菌属、小单孢菌次之） （2 2）真菌产生的抗生素：）真菌产生的抗生素：如青霉菌属和头孢菌属如青霉菌属和头孢菌属等分别产生一些很重要的抗生素（青霉素、灰黄霉素、等分别产生一些很重要的抗生素（青霉素、灰黄霉素、头孢菌素）。头孢菌素）。14（3 3）细菌产生的抗生素：）细菌产生的抗生素：如多粘杆菌、枯草杆菌、如多粘杆菌、枯草杆菌、芽孢杆菌等。如多粘菌素。芽孢杆菌等。如多粘菌素。（4 4）植物或动物产生的抗生素：）植物或动物产生的抗生素：从被子植物蒜中从被子植物蒜中制得的蒜素；从动物脏器中制得的鱼素等。制得的蒜素；从动物脏器中制得的鱼素等。151.4.2 1.4.2 根据抗生素的作用对象分类（医生、病理学家）根据抗生素的作用对象分类（医生、病理学家）（1 1）广谱抗生素：如氨卞青霉素既抑制）广谱抗生素：如氨卞青霉素既抑制G G+ +，又抑制，又抑制G G- -（2 2）抗）抗G G+ +的抗生素：如青霉素，的抗生素：如青霉素，（3 3）抗）抗G G- -的抗生素：如链霉素的抗生素：如链霉素（4 4）抗真菌的抗生素：如制霉菌素）抗真菌的抗生素：如制霉菌素（5 5）抗病毒的抗生素：如四环类抗生素对立克次氏）抗病毒的抗生素：如四环类抗生素对立克次氏体及较大病毒有一定作用。体及较大病毒有一定作用。（6 6）抗癌的抗生素：如阿霉素）抗癌的抗生素：如阿霉素161.4.3 1.4.3 根据抗生素的化学结构分类（化学家）根据抗生素的化学结构分类（化学家） 目前已确定结构的抗生素习惯如下分类：目前已确定结构的抗生素习惯如下分类：（1 1）- -内酰胺类抗生素：包括青霉素类，头孢菌素内酰胺类抗生素：包括青霉素类，头孢菌素类等；类等；（2 2）氨基糖苷类抗生素：包括链霉素、庆大霉素等；）氨基糖苷类抗生素：包括链霉素、庆大霉素等；（3 3）大环内脂类抗生素：如红霉素、麦迪加霉素；）大环内脂类抗生素：如红霉素、麦迪加霉素；（4 4）四环类抗生素：如四环素、土霉素；）四环类抗生素：如四环素、土霉素；（5 5）多肽类抗生素：如多粘菌素、杆菌肽；）多肽类抗生素：如多粘菌素、杆菌肽；（6 6）蒽环类抗生素：如阿霉素、柔红霉素；）蒽环类抗生素：如阿霉素、柔红霉素；（7 7）喹诺酮类抗生素：如环丙沙星、诺氟沙星。）喹诺酮类抗生素：如环丙沙星、诺氟沙星。17 HNONSCH3CH3HCOO-H-lactam ring -内酰胺内酰胺 环环Rnatural penicillin R =CH2-CO-18-内酰胺内酰胺 环环19两性霉素两性霉素Antibiotics are so complex they can only be synthesized in a living system201.4.4 1.4.4 根据抗生素的作用机制分类根据抗生素的作用机制分类 此种分类的优点：便于进行理论研究，有助于了此种分类的优点：便于进行理论研究，有助于了解抗生素影响病原体新陈代谢的哪些环节，从而找出解抗生素影响病原体新陈代谢的哪些环节，从而找出治疗的规律，使抗生素的使用更为合理。治疗的规律，使抗生素的使用更为合理。（1 1）抑制细胞壁合成抑制细胞壁合成的抗生素：如青霉素。的抗生素：如青霉素。（2 2）影响）影响细胞膜功能细胞膜功能的抗生素：多烯类抗生素。的抗生素：多烯类抗生素。（3 3）抑制病原菌）抑制病原菌蛋白质合成蛋白质合成的抗生素：四环素。的抗生素：四环素。（4 4）抑制核酸合成抑制核酸合成的抗生素：如影响的抗生素：如影响DNADNA结构和功能结构和功能的丝裂霉素的丝裂霉素C C。（5 5）抑制）抑制生物能生物能作用的抗生素：如抑制电子转移的作用的抗生素：如抑制电子转移的抗霉素抗霉素。211.4.5 1.4.5 根据抗生素的合成途径分类根据抗生素的合成途径分类（1 1）氨基酸、肽类衍生物抗生素：如青霉素类、头）氨基酸、肽类衍生物抗生素：如青霉素类、头孢菌素等寡肽抗生素。孢菌素等寡肽抗生素。（2 2）糖类衍生物抗生素：如链霉素等糖苷类抗生素。）糖类衍生物抗生素：如链霉素等糖苷类抗生素。（3 3）以乙酸、丙酸为单位的衍生物抗生素：红霉素）以乙酸、丙酸为单位的衍生物抗生素：红霉素等丙酸衍生物。等丙酸衍生物。问题：一种抗生素可能有几种机制，机制非常清楚的问题：一种抗生素可能有几种机制，机制非常清楚的不多。不多。22第第1717讲讲 抗生素发酵生产工艺学抗生素发酵生产工艺学1.5.1 1.5.1 抗生素的剂量表示法抗生素的剂量表示法 抗抗生生素素应应用用时时剂剂量量小小，因因此此除除重重量量外外，常常用用特特定的效价单位表示定的效价单位表示（1 1）稀稀释释单单位位：无无法法制制得得纯纯品品，最最初初的的表表示示方方法法，一定基于稀释法定的基准单位。一定基于稀释法定的基准单位。 一一个个青青霉霉素素的的效效价价单单位位：为为能能在在50mL50mL肉肉汤汤培培养养基基中中完完全全抑抑制制金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌标标准准菌菌株株的的发发育育的的最最小青霉素剂量。小青霉素剂量。 一一个个链链霉霉素素效效价价单单位位：能能在在1mL1mL肉肉汤汤培培养养基基中中完完全抑制大肠杆菌（全抑制大肠杆菌（ATCC9637ATCC9637）发育的最小剂量。）发育的最小剂量。 23 （2 2）重量单位：）重量单位：以抗生素的有效成分（生以抗生素的有效成分（生理活性成分）的重量作为抗生素的基准单位。理活性成分）的重量作为抗生素的基准单位。（大多数使用）（大多数使用） 一般定义一般定义1mg=14001mg=1400单位。对于各种酸、碱、单位。对于各种酸、碱、盐，指定其中的一个。如链霉素、氯霉素等以盐，指定其中的一个。如链霉素、氯霉素等以游离碱计，又如金霉素、氯霉素以盐酸盐计。游离碱计，又如金霉素、氯霉素以盐酸盐计。241.6 抗生素的体外抗菌作用抗生素的体外抗菌作用 判断药物有无抗菌作用及其抗菌作用的强弱，有体外和体内判断药物有无抗菌作用及其抗菌作用的强弱，有体外和体内两种试验方法。一般先进行体外抗菌试验，若发现药物有抗菌作两种试验方法。一般先进行体外抗菌试验，若发现药物有抗菌作用，可再进行体内抗菌试验。用，可再进行体内抗菌试验。 体外抗菌试验主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏体外抗菌试验主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性，所以也称为感性，所以也称为药敏试验药敏试验，常用最低抑菌浓度（，常用最低抑菌浓度（MICMIC）表示，）表示，是指药物完全抑制某种微生物的最低浓度。是指药物完全抑制某种微生物的最低浓度。（1 1）抑菌、杀菌作用）抑菌、杀菌作用 抑菌作用：抗生素存在时细菌的繁殖受到抑制，去除抗生素抑菌作用：抗生素存在时细菌的繁殖受到抑制，去除抗生素后，对细菌的抑制作用消失。后，对细菌的抑制作用消失。 杀菌作用：对细菌的不可逆损害，导致死亡。杀菌作用：对细菌的不可逆损害，导致死亡。（2 2）菌种的最低药物敏感度测定。）菌种的最低药物敏感度测定。25 最小抑菌浓度（最小抑菌浓度（MICMIC）：）：培养培养24h24h以最低浓度无菌体生长者。以最低浓度无菌体生长者。用来表示抗生素的抗菌活性作用，单位是用来表示抗生素的抗菌活性作用，单位是g/mLg/mL。 最小杀菌浓度（最小杀菌浓度（ MBCMBC）：次代继续孵化：次代继续孵化24h24h以最低浓度无菌以最低浓度无菌生长者。即当药物浓度在稍高于生长者。即当药物浓度在稍高于MICMIC值浓度下的抑菌作用是不可值浓度下的抑菌作用是不可逆的，称为杀菌作用。最低抑菌浓度与最低杀菌浓度可以相同，逆的，称为杀菌作用。最低抑菌浓度与最低杀菌浓度可以相同，也可以有所不同。也可以有所不同。 最低杀菌浓度的确定即依次将未见细菌生长的各管培养物各最低杀菌浓度的确定即依次将未见细菌生长的各管培养物各吸取吸取0.1mL0.1mL涂布于合适的琼脂培养基平板上，在规定的温度下培涂布于合适的琼脂培养基平板上，在规定的温度下培养养181824h24h，平板上的菌落数小于，平板上的菌落数小于5 5个的最小稀释度的药物浓度即个的最小稀释度的药物浓度即为最低杀菌浓度。为最低杀菌浓度。 （3 3）抗菌谱）抗菌谱：某种抗生素所能抑制或杀灭病原体的范围，称：某种抗生素所能抑制或杀灭病原体的范围，称之为该种抗生素的抗菌谱。之为该种抗生素的抗菌谱。261.7 1.7 医疗用抗生素应具备的条件医疗用抗生素应具备的条件 （1 1）抗生素在低浓度下对多种病原菌有效）抗生素在低浓度下对多种病原菌有效高效高效 （2 2）难以使病原菌产生耐药性）难以使病原菌产生耐药性交叉用药，交叉用药，防止最重要防止最重要 （3 3）较大的差异毒性）较大的差异毒性副作用小副作用小27产生菌的筛选；产生菌的筛选；抗菌性试验；抗菌性试验；提取、精制、鉴定；提取、精制、鉴定；毒性试验；毒性试验；药理和临床试验。药理和临床试验。 2 2生产前期研究生产前期研究 28 Agar diffusion assayagar plate琼脂培养基琼脂培养基lawn of test bacteria测测 试试 菌菌 苔苔filter papers soakedwith test compounds含含 药药 物物 滤滤 纸纸zones of inhibition(no growth)抑菌圈抑菌圈29分分 析析 仪仪 器器Analytical instrumentsAnalytical instruments现代分析仪器：现代分析仪器：核磁共振核磁共振毛细管电泳毛细管电泳气相色谱气相色谱高效液相色谱高效液相色谱质谱质谱Modern analytical instruments:Nuclear magnetic resonance (NMR)Capillary electrophoresis(CE)Gas chromatography (GC)High performance liquid chromatography (HPLC)Mass spectroscopy (MS) AutomationSensitivityAccuracy自动灵敏准确自动灵敏准确30人工诱变法：人工诱变法：紫外线、紫外线、X-X-线、线、r-r-线线照射照射亚硝基胍、亚硝酸、亚硝基胍、亚硝酸、秋水仙素、氮芥等秋水仙素、氮芥等诱变剂处理诱变剂处理 3. 3. 抗生素抗生素生产菌改良生产菌改良 31基因工程基因工程Genetic EngineeringGenetic Engineering Recombinant DNA Recombinant DNA Technology Technology （DNADNA重组技术）重组技术）克隆克隆32Strain Improvement Scale-upStrain出发菌株出发菌株Agar plate平板技术平板技术Primaryshake flaskEvaluation摇瓶培养摇瓶培养Secondary shake flask evaluationdifferent media二级摇瓶培养二级摇瓶培养各种培养基各种培养基Lab fermentor evaluationProductionCondition小型发酵罐小型发酵罐模拟生产条件模拟生产条件Mastercell bankWorkingcell bankInoculumDevelopment菌种扩大培养菌种扩大培养Pilot plantEvaluation中试生产中试生产ProductionEvaluation生产生产60003003031Possiblerecycle33第第17讲讲 抗生素发酵生产抗生素发酵生产工艺学工艺学models models EL Gadden Jr 200 m3Same productivity ?Limitations ?模模 拟拟34摇瓶发酵摇瓶发酵 Shake-flask fermentation装液量：装液量：10% (-250ml)10% (-250ml)间歇培养间歇培养温控受限制温控受限制代谢碳水化合物慢代谢碳水化合物慢常压常压缓冲液控制缓冲液控制pHpH在线取样难在线取样难容量减少容量减少瓶壁上结垢瓶壁上结垢无需消泡无需消泡搅拌受限制搅拌受限制无法控制溶解氧无法控制溶解氧35搅搅 拌拌 罐罐 发发 酵酵 Stirred tank fermentation10-100,00010-100,000升容量升容量间歇和补料培养间歇和补料培养连续控制：连续控制：pHpH，温度，温度需要铵盐或氨气需要铵盐或氨气2 2 大气压大气压无需缓冲液无需缓冲液在线取样易在线取样易补料补料, ,容量增加容量增加 生长均匀一致生长均匀一致需消泡需消泡多种搅拌多种搅拌 控制溶解氧控制溶解氧: :通气通气, ,加压加压36摇摇 瓶瓶 发发 酵酵 Shake-flask 装液量：装液量：10% (250ml)间歇培养间歇培养温控受限制温控受限制代谢碳水化合物慢代谢碳水化合物慢常压常压缓冲液控制缓冲液控制pHpH在线取样难在线取样难容量减少容量减少瓶壁上结垢瓶壁上结垢无需消泡无需消泡搅拌受限制搅拌受限制无法控制溶解氧无法控制溶解氧10-100,000升容量升容量间歇和补料培养间歇和补料培养连续控制：连续控制：pH，温度温度需要铵盐或氨气需要铵盐或氨气2 2 大气压大气压无需无需缓冲液缓冲液在线取样易在线取样易补料补料, ,容量增加容量增加 生长均匀一致生长均匀一致需消泡需消泡多种搅拌多种搅拌 控制溶解氧控制溶解氧: :通气通气, ,加压加压搅搅 拌拌 罐罐 发发 酵酵 Stirred tank 37菌种菌种 种子制备种子制备 发酵发酵 发酵液预处理发酵液预处理 提取及精制提取及精制 成品包装成品包装4. 4. 抗生素生产工艺过程抗生素生产工艺过程Antibiotics Production Processing38A scheme of the material flow in an antibiotic production 连消连消发酵罐发酵罐缓冲罐缓冲罐种子罐种子罐39发酵生产原料发酵生产原料 Materials for FermentationCarbon source:Beet & cane molassesGlucose, lactose, starchEthanol, methanol GlycerolMaltose syrup, corn syrupCottonseed oil, peanut oil, soy oilLard oil Methyl oleate Tallow碳源碳源: :甜菜和甘蔗糖蜜甜菜和甘蔗糖蜜葡萄糖，乳糖，淀粉葡萄糖，乳糖，淀粉乙醇，甲醇乙醇，甲醇甘油甘油麦芽糖浆，玉米糖浆麦芽糖浆，玉米糖浆绵籽油，花生油，豆油绵籽油，花生油，豆油猪油猪油油酸甲酯油酸甲酯油脂油脂40氮源氮源:绵绵籽籽粉粉玉米粉和玉米浸出液玉米粉和玉米浸出液大豆粉和大豆面大豆粉和大豆面花生粉花生粉菜籽粉菜籽粉牛血，酪蛋白水解液牛血，酪蛋白水解液乳清乳清鱼粉鱼粉酵母酵母酵母膏酵母膏肉粉和骨粉肉粉和骨粉 Nitrogen source:Cotton seed meal Corn meal & steep liquorSoybean meal & flour Peanut meal Rapeseed mealBeef blood, Casein hydrolysate Whey Fish mealWhole yeastYeast extractMeat & bone meal 发酵生产原料发酵生产原料 Materials for Fermentation41 培培 养养 基基Media for Cell Growth & Final productionComponents Range % 组组 成成Glucose/ sucrose 3.0-5.0 葡萄糖/ 蔗糖Starch 淀粉 3.0-5.0Corn steep liquor 3.0-5.0Calcium carbonate 0.5-1.0 碳酸钙Phosphate 磷酸盐 0.1-0.5Ammonium sulphate 0.1-1.0 硫酸胺Urea 尿素 0.1-0.5Oil 油 0.1-0.5Fermentation 发酵培养基发酵培养基 Components Range % 组组 成成Glucose 0.5-1.0Starch 0.5-5.0Corn steep liquor 5.0-8.0 玉米浸提液Soy flour 1.0-5.0Phosphate 0.1-1.0Ammonium sulphate 0.5-1.0and fed periodicallyOil 1.0 and fed continuouslyCorn syrup fed continuously 玉米糖浆 连续加料 Tank seed 种子培养基种子培养基42第第17讲讲 抗生素发酵生产工艺学抗生素发酵生产工艺学435. 5. 发发 酵酵 控控 制制Fermentation ControlFermentation Control Pressure probeLevel probepH probeTemp. probeDO probeAntifoamAcid/BaseCoolingAir/agitationSugar/Oilfeed44ScaleWeight SignalPump SpeedAmplifierControllerSupervisoryComputer Flow Rate Control 流量控制流量控制45第第1717讲讲 抗生素发酵生产工艺学抗生素发酵生产工艺学46菌种菌种 (strain)(strain)：产黄青霉菌：产黄青霉菌 ( (Penicillium chrysogenum)孢子培养孢子培养 ( (spore cultivation) )：25 25 C C, 6-7 d, 6-7 d种子培养种子培养 ( (seed cultivation) )： 25 25 C C，2-3 d 2-3 d 发酵培养发酵培养 ( (fermentation) )： 22-26 22-26 C C,6-7 d,6-7 d加糖控制加糖控制 ( (sugar feeding) )：残糖降至：残糖降至0.60.6 青青 霉霉 素素 发发 酵酵 (1) Penicillin Fermentation47补氮补氮 (nitrogen feeding)：氨控制在：氨控制在 0.01-0.05前体前体 (precursor)：残余苯乙酰胺：残余苯乙酰胺 0.05-0.08温度控制温度控制 (temperature)：前期：前期 25-26 C 后期后期 23 C通气与搅拌通气与搅拌 (aeration & stir)：1 : 0.8 VVM泡沫泡沫 (foam)：天然油脂：天然油脂, 如豆油如豆油 青青 霉霉 素素 发发 酵酵 (2) (2) Penicillin FermentationPenicillin Fermentation48Penicillin Fermentation Profile 变化曲线变化曲线49生产方法：生产方法： 6.16.1、生物合成法：、生物合成法： 传统方法传统方法 “工程菌工程菌”制造法制造法 细胞融合技术法细胞融合技术法 6.26.2、化学合成法；、化学合成法； 6.36.3、生物合成加化学合成法。、生物合成加化学合成法。 第第1717讲讲 抗生素发酵生产工艺学抗生素发酵生产工艺学50 6.1 1、生物合成法：、生物合成法： 传统方法传统方法 大多数抗生素是由放线菌和霉菌产生的。菌种是大多数抗生素是由放线菌和霉菌产生的。菌种是通过从土壤中分离、筛选获得，一般采用深层通风搅通过从土壤中分离、筛选获得，一般采用深层通风搅拌发酵罐生产。拌发酵罐生产。 传统方法目前存在很多不足，因此，人们采用基传统方法目前存在很多不足，因此，人们采用基因工程和细胞融合技术，对抗生素产生菌进行了改造因工程和细胞融合技术，对抗生素产生菌进行了改造和重新设计，不仅可以制造出许多高效低毒的新型抗和重新设计，不仅可以制造出许多高效低毒的新型抗生素，还可改革工艺，使抗生素产量成倍地增长。生素，还可改革工艺，使抗生素产量成倍地增长。 51 “工程菌工程菌”制造法制造法 第一次由第一次由“工程菌工程菌”制造的全新抗生素制造的全新抗生素麦迪紫红麦迪紫红素素A，是美国报道的。他们将产放线紫红素的部分基因，是美国报道的。他们将产放线紫红素的部分基因插入产麦迪霉素的放线菌中，构建的插入产麦迪霉素的放线菌中，构建的“工程菌工程菌”产生产生了全新的抗生素。了全新的抗生素。 我国新构建的生产丁胺卡那霉素的我国新构建的生产丁胺卡那霉素的“工程菌工程菌”，就是把酰化酶基因克隆到卡那霉素产生菌中获得的。就是把酰化酶基因克隆到卡那霉素产生菌中获得的。新的新的“工程菌工程菌” 生产的新抗生素毒副作用小，对耐卡生产的新抗生素毒副作用小，对耐卡那霉素、庆大霉素致病菌临床疗效显著。那霉素、庆大霉素致病菌临床疗效显著。52细胞融合技术法细胞融合技术法 对抗生素产生菌采用细胞融合技术的成果更为突出。对抗生素产生菌采用细胞融合技术的成果更为突出。橄榄色无孢小单孢菌细胞融合株抗生素产率比原菌株提橄榄色无孢小单孢菌细胞融合株抗生素产率比原菌株提高高140倍。倍。 目前目前DNA重组技术已广泛用于红霉素、链霉素等重组技术已广泛用于红霉素、链霉素等20多种抗生素的育种工作，可以预见不久将来会有更多的多种抗生素的育种工作，可以预见不久将来会有更多的由由“工程菌工程菌”生产的新型抗生素问世生产的新型抗生素问世。536.2 6.2 化学合成法化学合成法 根据某种根据某种抗生素的化学组成和结构，通过抗生素的化学组成和结构，通过化化学合成的方法，可生产部分学合成的方法，可生产部分抗生素。抗生素。 如：氯霉素、磷霉素等。如：氯霉素、磷霉素等。 经过经过化学合成方法和控制条件的不断深入研化学合成方法和控制条件的不断深入研究，越来越多的究，越来越多的抗生素可用抗生素可用化学合成法生产。化学合成法生产。546.3 6.3 生物合成加化学合成法生物合成加化学合成法 许多细菌逐渐出现了抗药性，已经证实某些抗药性因许多细菌逐渐出现了抗药性，已经证实某些抗药性因子位于细菌内的质粒上，质粒可以在细菌之间转移，结子位于细菌内的质粒上，质粒可以在细菌之间转移，结果抗性菌日益增多，抗生素疗效就越来越低。果抗性菌日益增多，抗生素疗效就越来越低。 为了对付细菌的抗药性，科学家对原有的抗生素进行为了对付细菌的抗药性，科学家对原有的抗生素进行了了“整容手术整容手术”，细菌因再无法识别改头换面的抗生素，细菌因再无法识别改头换面的抗生素而被抑制或杀死。而被抑制或杀死。 现在已能使用克隆了酰化酶基因的现在已能使用克隆了酰化酶基因的“工程菌工程菌”（大（大肠杆菌）高效率的生产半合成抗生素。临床现在使用的肠杆菌）高效率的生产半合成抗生素。临床现在使用的贵重特效药物先锋霉素（头孢菌素类）、氨苄青霉素，贵重特效药物先锋霉素（头孢菌素类）、氨苄青霉素，就是这类半合成抗生素类药物。国外已有几十种这类药就是这类半合成抗生素类药物。国外已有几十种这类药物在实验室研制成功。物在实验室研制成功。55A scheme of the material flow in an antibiotic production