第九章高效液相色谱法第九章高效液相色谱法第一节高效液相色谱法概述第一节高效液相色谱法概述 高高效效液液相相色色谱谱法法是是继继气气相相色色谱谱之之后后，70年年代代初初期期发发展展起起来来的的一一种种以以液液体体做做流流动动相相的的新新色色谱谱技技术术。随随着着不不断断改改进进与与发发展展，目目前前已已成成为为应应用用极极为为广广泛泛的的化化学学分分离离分分析析的的重重要要手手段。段。高效液相色谱法(15)课件n 高高效效液液相相色色谱谱是是在在气气相相色色谱谱和和经经典典色色谱谱的的基基础础上上发发展展起起来来的的。现现代代液液相相色色谱谱和和经经典典液液相相色色谱谱没没有有本本质质的的区区别别。不不同同点点仅仅仅仅是是现现代代液液相相色色谱谱比比经经典典液液相相色色谱谱有有较较高高的的效效率率和和实实现现了了自自动动化化操操作作。经经典典的的液液相相色色谱谱法法，流流动动相相在在常常压压下下输输送送，所所用用的的固定相柱效低，分析周期长。固定相柱效低，分析周期长。 n现现代代液液相相色色谱谱法法引引用用了了气气相相色色谱谱的的理理论论，流流动动相相改改为为高高压压输输送送（最最高高输输送送压压力力可可达达4.9 107Pa）;色色谱谱柱柱是是以以特特殊殊的的方方法法用用小小粒粒径径的的填填料料填填充充而而成成，从从而而使使柱柱效效大大大大高高于于经经典典液液相相色色谱谱（每每米米塔塔板板数数可可达达几几万万或或几几十十万万）；同同时时柱柱后后连连有有高高灵灵敏敏度度的的检检测测器器，可可对对流流出出物物进进行行连连续续检检测测。因因此此，高高效效液液相相色色谱谱具具有有分分析析速速度度快快、分分离离效效能能高高、高高灵灵敏敏度度、自自动动化化等等特特点。所以人们称它为点。所以人们称它为高压高压、高速高速、高效高效或现代液相色谱法。或现代液相色谱法。 高效液相色谱法(15)课件 1. 原理原理 和和气气相相色色谱谱一一样样，液液相相色色谱谱分分离离系系统统也也由由两两相相固固定定相相和和流流动动相相组组成成。液液相相色色谱谱的的固固定定相相可可以以是是吸吸附附剂剂、化化学学键键合合固固定定相相（或或在在惰惰性性载载体体表表面面涂涂上上一一层层液液膜膜）、离离子子交交换换树树脂脂或或多多孔孔性性凝凝胶胶；流流动动相相是是各各种种溶溶剂剂。被被分分离离混混合合物物由由流流动动相相液液体体推推动动进进入入色色谱谱柱柱。根根据据各各组组分分在在固固定定相相及及流流动动相相中中的的吸吸附附能能力力、分分配配系系数数、离离子子交交换换作作用用或或分分子子尺尺寸寸大大小小的的差差异异进进行行分分离离。色色谱谱分分离离的的实实质质是是样样品品分分子子（以以下下称称溶溶质质）与与溶溶剂剂（即即流流动动相相或或洗洗脱脱液液）以以及及固固定定相相分分子子间间的的作作用用，作作用用力力的大小，决定色谱过程的保留行为。的大小，决定色谱过程的保留行为。一、液相色谱分离原理及分类一、液相色谱分离原理及分类高效液相色谱法(15)课件2. 分类分类根据根据分离机制分离机制不同，液相色谱可分为：不同，液相色谱可分为：u液固吸附色谱液固吸附色谱u液液分配色谱液液分配色谱u化合键合色谱化合键合色谱u离子交换色谱离子交换色谱u分子排阻色谱分子排阻色谱高效液相色谱法(15)课件u液液相相色色谱谱所所用用基基本本概概念念：保保留留值值、塔塔板板数数、塔塔板板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。u液液相相色色谱谱所所用用基基本本理理论论：塔塔板板理理论论与与速速率率方方程程也也与气相色谱基本一致。与气相色谱基本一致。u由由于于在在液液相相色色谱谱中中以以液液体体代代替替气气相相色色谱谱中中的的气气体体作为流动相，而液体和气体的性质不相同。作为流动相，而液体和气体的性质不相同。u液液相相色色谱谱所所用用的的仪仪器器设设备备和和操操作作条条件件也也与与气气相相色色谱不同。谱不同。二、液相色谱与气相色谱的比较二、液相色谱与气相色谱的比较高效液相色谱法(15)课件1. 应用范围不同应用范围不同n气气相相色色谱谱仅仅能能分分析析在在操操作作温温度度下下能能气气化化而而不不分分解解的的物物质质。对对高高沸沸点点化化合合物物、非非挥挥发发性性物物质质、热热不不稳稳定定化化合合物物、离离子子型型化化合合物物及及高高聚聚物物的的分分离离、分分析析较较为为困困难难。致致使使其其应应用用受受到到一一定定程程度度的的限限制制，只只有有大大约约20%的有机物能用气相色谱分析；的有机物能用气相色谱分析；n液液相相色色谱谱不不受受样样品品挥挥发发度度和和热热稳稳定定性性的的限限制制，它它非非常常适适合合分分子子量量较较大大、高高沸沸点点、热热稳稳定定性性差差的的有有机机化化合合物物；离离子子型型化化合合物物及及高高聚聚物物的的分分离离分分析析，大大约约占占有机物的有机物的70 80%。高效液相色谱法(15)课件n气气相相色色谱谱的的流流动动相相载载气气是是色色谱谱惰惰性性的的，不不参参与与分分配配平平衡衡过过程程，与与样样品品分分子子无无亲亲和和作作用用，样样品品分分子子只只与与固固定定相相相相互互作作用用。而而在在液液相相色色谱谱中中流流动动相相液液体体也也与与固固定定相相争争夺夺样样品品分分子子，为为提提高高选选择择性性增增加加了了一一个个因因素素。也也可可选选用用不不同同比比例例的的两两种种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。n液液相相色色谱谱固固定定相相类类型型多多，如如离离子子交交换换色色谱谱和和排排阻阻色色谱谱等等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。n液液相相色色谱谱通通常常在在室室温温下下操操作作，较较低低的的温温度度，一一般般有有利利于于色色谱分离条件的选择。谱分离条件的选择。2.液相色谱能完成难度较高的分离工作液相色谱能完成难度较高的分离工作高效液相色谱法(15)课件 由由于于液液体体的的扩扩散散性性比比气气体体的的小小105倍倍，因因此此，溶溶质质在在液液相相中中的的传传质质速速率率慢慢，柱柱外外效效应应就就显显得得特特别别重重要要；而而在在气气相相色色谱谱中中，柱柱外外区区域域扩扩张张可可以以忽忽略不计。略不计。3. 传质速率不同传质速率不同4. 液相色谱中制备样品简单液相色谱中制备样品简单 液液相相色色谱谱中中制制备备样样品品简简单单，回回收收样样品品也也比比较较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。5. 液液相相色色谱谱尚尚缺缺乏乏通通用用的的检检测测器器，仪仪器器比比较较复复杂，价格昂贵。杂，价格昂贵。高效液相色谱法(15)课件三、高效液相色谱法的特点和应用三、高效液相色谱法的特点和应用 1. 特点特点 高高效效液液相相色色谱谱法法具具有有高高柱柱效效、高高选选择择性性、分分析析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。 2. 应用应用 目目前前在在化化学学、化化工工、医医药药、生生化化、环环保保、农农业业等科学领域获得广泛的应用。等科学领域获得广泛的应用。高效液相色谱法(15)课件第二节高效液相色谱仪第二节高效液相色谱仪n高压输液系统高压输液系统n进样系统进样系统n分离系统分离系统n检测系统检测系统n记录系统记录系统 等五大部分组成。等五大部分组成。高效液相色谱仪由高效液相色谱仪由高效液相色谱法(15)课件高效液相色谱法(15)课件 分分析析前前，选选择择适适当当的的色色谱谱柱柱和和流流动动相相，开开泵泵，冲冲洗洗柱柱子子，待待柱柱子子达达到到平平衡衡而而且且基基线线平平直直后后，用用微微量量注注射射器器把把样样品品注注入入进进样样口口，流流动动相相把把试试样样带带入入色色谱谱柱柱进进行行分分离离，分分离离后后的的组组分分依依次次流流入入检检测测器器的的流流通通池池，最最后后和和洗洗脱脱液液一一起起排排入入流流出出物物收收集集器器。当当有有样样品品组组分分流流过过流流通通池池时时，检检测测器器把把组组分分浓浓度度转转变变成成电电信信号号，经经过过放放大大，用用记记录录器器记记录录下下来来就就得得到到色色谱谱图图。色色谱谱图图是是定定性性、定定量量和和评评价价柱柱效高低的依据。效高低的依据。高效液相色谱法(15)课件一、高压输液系统一、高压输液系统 高压输液系统由高压输液系统由 溶剂贮存器、高压泵、梯度洗溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置和压力表脱装置和压力表 等组成。等组成。1. 溶剂贮存器溶剂贮存器 溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为容量为1到到2 L，用来贮存足够数量、符合要求的流，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。动相。高效液相色谱法(15)课件2. 高压输液泵高压输液泵 高高压压输输液液泵泵是是高高效效液液相相色色谱谱仪仪中中关关键键部部件件之之一一，其其功功能能是是将将溶溶剂剂贮贮存存器器中中的的流流动动相相以以高高压压形形式式连连续续不不断断地地送送入入液液路路系系统统，使使样样品品在在色色谱谱柱柱中中完完成成分分离离过过程程。由由于于液液相相色色谱谱仪仪所所用用色色谱谱柱柱径径较较细细，所所填填固固定定相相粒粒度度很很小小，因因此此，对对流流动动相相的的阻阻力力较较大大，为为了了使使流流动动相相能能较较快快地地流流过过色色谱谱柱柱，就就需要高压泵注入流动相。需要高压泵注入流动相。高效液相色谱法(15)课件n输出压力高输出压力高n流量范围大流量范围大n流量恒定流量恒定n无脉动，流量精度和重复性为无脉动，流量精度和重复性为0.5%左右左右n耐腐蚀，密封性好。耐腐蚀，密封性好。A、对泵的要求：、对泵的要求：高效液相色谱法(15)课件 高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。泵两大类。n恒流泵恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和柱渗透无关。粘度和柱渗透无关。n恒压泵恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。就能提供恒定的流量。B、分类：、分类：高效液相色谱法(15)课件 3. 梯度洗脱装置梯度洗脱装置 梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。目的。高效液相色谱法(15)课件n一类是一类是外梯度装置外梯度装置（又称低压梯度），流动相（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。需一台泵即可。n另一类是另一类是内梯度装置内梯度装置（又称高压梯度），将两（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。 梯度洗脱装置分为两类：梯度洗脱装置分为两类：高效液相色谱法(15)课件n通通过过不不断断地地变变化化流流动动相相的的强强度度，来来调调整整混混合合样样品品中中各各组组分分的的k值值，使使所所有有谱谱带带都都以以最最佳佳平平均均k值值通通过色谱柱。过色谱柱。n在在液液相相色色谱谱中中所所起起的的作作用用相相当当于于气气相相色色谱谱中中的的程程序序升升温温，所所不不同同的的是是，在在梯梯度度洗洗脱脱中中溶溶质质k值值的的变变化化是是通通过过溶溶质质的的极极性性、pH值值和和离离子子强强度度来来实实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。梯度洗脱的梯度洗脱的实质实质高效液相色谱法(15)课件 进进样样系系统统包包括括进进样样口口、注注射射器器和和进进样样阀阀等等，它它的的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。二、进样系统二、进样系统三、分离系统三、分离系统 分分离离系系统统包包括括色色谱谱柱柱、恒恒温温器器和和连连接接管管等等部部件件。色色谱谱柱柱一一般般用用内内部部抛抛光光的的不不锈锈钢钢制制成成。其其内内径径为为2 6mm，柱柱长长为为10 50cm，柱柱形形多多为为直直形形，内内部部充充满微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温。满微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温。高效液相色谱法(15)课件 1. 对检测器的要求对检测器的要求 灵灵敏敏度度高高，重重复复性性好好、线线性性范范围围宽宽、死死体体积积小小以以及及对对温温度和流量的变化不敏感等。度和流量的变化不敏感等。 2. 检测器类型检测器类型u一一类类是是溶溶质质性性检检测测器器，它它仅仅对对被被分分离离组组分分的的物物理理或或物物理理化化学学特特性性有有响响应应。属属于于此此类类检检测测器器的的有有紫紫外外、荧荧光光、电电化化学学检检测测器等器等u一一类类是是总总体体检检测测器器，它它对对试试样样和和洗洗脱脱液液总总的的物物理理和和化化学学性性质质响应。属于此类检测器有示差折光检测器等。响应。属于此类检测器有示差折光检测器等。四、检测器四、检测器高效液相色谱法(15)课件第三节高效液相色谱的固定相和流动相第三节高效液相色谱的固定相和流动相一、固定相一、固定相 高高效效液液相相色色谱谱固固定定相相以以承承受受高高压压能能力力来来分分类类，可可分分为为刚刚性固体和硬胶两大类。性固体和硬胶两大类。n刚刚性性固固体体以以二二氧氧化化硅硅为为基基质质，可可承承受受7.0 1081.0 109Pa的的高高压压，可可制制成成直直径径、形形状状、孔孔隙隙度度不不同同的的颗颗粒粒。如如果果在在二二氧氧化化硅硅表表面面键键合合各各种种官官能能团团，可可扩扩大大应应用用范范围围，是是目目前前最最广广泛使用的固定相。泛使用的固定相。n硬硬胶胶主主要要用用于于离离子子交交换换和和尺尺寸寸排排阻阻色色谱谱中中，它它由由聚聚苯苯乙乙烯烯与与二二乙乙烯烯苯苯基基交交联联而而成成。可可承承受受压压力力上上限限为为3.5 108Pa。固固定定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相。相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相。高效液相色谱法(15)课件 它它的的基基体体是是实实心心玻玻璃璃球球，在在玻玻璃璃球球外外面面覆覆盖盖一一层层多多孔孔活活性性材材料料，如如硅硅胶胶、氧氧化化硅硅、离离子子交交换换剂剂、分分子子筛筛、聚聚酰酰胺胺等等。这这类类固固定定相相的的多多孔孔层层厚厚度度小小、孔孔浅浅，相相对对死死体体积积小小，出出峰峰迅迅速速、柱柱效效亦亦高高；颗颗粒粒较较大大，渗渗透透性性好好，装装柱柱容容易易，梯梯度度淋淋洗洗时时能能迅迅速速达达到到平平衡衡，较较适适合合做做常常规规分分析析。由由于于多多孔层厚度薄，最大允许量受到限制。孔层厚度薄，最大允许量受到限制。1. 表面多孔型固定相表面多孔型固定相高效液相色谱法(15)课件2. 全多孔型固定相全多孔型固定相 由直径为由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。这类固的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗粒很细（定相由于颗粒很细（510 m），孔仍然较浅，传），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。物分离及痕量分析。高效液相色谱法(15)课件 由由于于高高效效液液相相色色谱谱中中流流动动相相是是液液体体，它它对对组组分分有有亲亲合合力力，并并参参与与固固定定相相对对组组分分的的竞竞争争，因因此此，正正确确选选择择流流动动相相直直接接影影响响组组分分的的分离度。分离度。二、流动相二、流动相高效液相色谱法(15)课件n 1.溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。n 2.溶剂与检测器匹配。溶剂与检测器匹配。n 3.高纯度高纯度 由由于于高高效效液液相相色色谱谱灵灵敏敏度度高高，对对流流动动相相溶溶剂剂的的纯纯度度也也要要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰伪峰”。n 4.化学稳定性好化学稳定性好n5.低粘度（粘度适中）低粘度（粘度适中） 若若使使用用高高粘粘度度溶溶剂剂，势势必必增增高高压压力力，不不利利于于分分离离。常常用用的的低低粘粘度度溶溶剂剂有有丙丙酮酮、甲甲醇醇和和乙乙腈腈等等；但但粘粘度度过过低低的的溶溶剂剂也也不不宜宜采采用用，例例如如戊戊烷烷和和乙乙醚醚等等，它它们们容容易易在在色色谱谱柱柱或或检检测测器器内形成气泡，影响分离。内形成气泡，影响分离。对流动相溶剂的要求：对流动相溶剂的要求：高效液相色谱法(15)课件第四节高效液相色谱的类型第四节高效液相色谱的类型一、液一、液固色谱法固色谱法 液液固固色色谱谱的的固固定定相相是是固固体体吸吸附附剂剂。吸吸附附剂剂是是一一些些多多孔孔的的固固体体颗颗粒粒物物质质，位位于于其其表表面面的的原原子子、离离子子或或分分子子的的性性质质是是不不同同于于在在内内部部的的原原子子、离离子子或或分分子子的的性性质质的的。表表层层的的键键因因缺缺乏乏覆覆盖盖层层结结构构而而受受到到扰扰动动。因因此此，表表层层一一般般处处于于较较高高的的能能级级，存存在在一一些些分分散散的的具具有有表表面面活活性性的的吸吸附附中中心心。因因此此，液液固固色色谱谱法法是是根根据据各各组组分分在在固固定定相相上上的的吸吸附附能能力力的的差差异异进进行行分分离离，故也称为液固吸附色谱。故也称为液固吸附色谱。 高效液相色谱法(15)课件 吸吸附附剂剂吸吸附附试试样样的的能能力力，主主要要取取决决于于吸吸附附剂剂的的比比表表面面积积和和理理化化性性质质，试试样样的的组组成成和和结结构构以以及及洗洗脱脱液液的的性性质质等等。组组分分与与吸吸附附剂剂的的性性质质相相似似时时，易易被被吸吸附附，呈呈现现高高的的保保留留值值；当当组组分分分分子子结结构构与与吸吸附附剂剂表表面面活活性性中中心心的的刚刚性性几几何何结结构构相相适适应应时时，易易于于吸吸附附。从从而而使使吸吸附附色色谱谱成成为为分分离离几几何何异异构构体体的的有有效效手手段段；不不同同的的官官能能团团具具有有不不同同的的吸吸附附能能，因因此此，吸吸附附色色谱谱可可按按族族分分离离化化合合物物。吸吸附附色色谱谱对对同同系系物物没没有有选选择择性性（对对分分子子量量的的选选择择性性小小），不不能能用用该该法法分分离离分分子子量量不同的化合物。不同的化合物。高效液相色谱法(15)课件 液固色谱法采用的固体吸附剂可分为极性和非极性两种。液固色谱法采用的固体吸附剂可分为极性和非极性两种。u极极性性吸吸附附剂剂包包括括硅硅胶胶、氧氧化化铝铝、氧氧化化镁镁、硅硅酸酸镁镁、分分子子筛筛及及聚酰胺等。聚酰胺等。u非非极极性性吸吸附附剂剂最最常常见见的的是是活活性性炭炭。极极性性吸吸附附剂剂可可分分为为酸酸性性吸吸附附剂剂和和碱碱性性吸吸附附剂剂。酸酸性性吸吸附附剂剂包包括括硅硅胶胶和和硅硅酸酸镁镁等等，碱碱性性吸吸附附剂剂有有氧氧化化铝铝、氧氧化化镁镁和和聚聚酰酰胺胺等等。酸酸性性吸吸附附剂剂适适于于分分离离碱碱，如如脂脂肪肪胺胺和和芳芳香香胺胺。碱碱性性吸吸附附剂剂则则适适于于分分离离酸酸性性溶溶质质，如酚、羧和吡咯衍生物等。如酚、羧和吡咯衍生物等。u各各种种吸吸附附剂剂中中，最最常常用用的的吸吸附附剂剂是是硅硅胶胶，其其次次是是氧氧化化铝铝。在在现现代代液液相相色色谱谱中中，硅硅胶胶不不仅仅作作为为液液固固吸吸附附色色谱谱固固定定相相，还还可可作为液液分配色谱的载体和键合相色谱填料的基体。作为液液分配色谱的载体和键合相色谱填料的基体。1. 液固色谱法固定相液固色谱法固定相高效液相色谱法(15)课件液相色谱的流动相必须符合下列液相色谱的流动相必须符合下列要求要求：（1）能溶解样品，但不能与样品发生反应。）能溶解样品，但不能与样品发生反应。（2）与固定相不互溶，也不发生不可逆反应。）与固定相不互溶，也不发生不可逆反应。（3）粘粘度度要要尽尽可可能能小小，这这样样才才能能有有较较高高的的渗渗透透性性和和柱效。柱效。（4）应应与与所所用用检检测测器器相相匹匹配配。例例如如利利用用紫紫外外检检测测器器时，溶剂要不吸收紫外光。时，溶剂要不吸收紫外光。（5）容容易易精精制制、纯纯化化、毒毒性性小小，不不易易着着火火、价价格格尽尽量便宜等。量便宜等。2. 液液-固吸附色谱固吸附色谱流动相流动相高效液相色谱法(15)课件n极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相。低极性流动相。n为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、三种或更为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、三种或更多种不同极性的溶剂混合起来使用，如果样品组分多种不同极性的溶剂混合起来使用，如果样品组分的分配比的分配比k值范围很广则使用梯度洗脱。值范围很广则使用梯度洗脱。液液-固色谱选择流动相的固色谱选择流动相的基本原则基本原则高效液相色谱法(15)课件 液液液液色色谱谱又又称称液液液液分分配配色色谱谱。在在液液液液色色谱谱中中，一一个个液液相相作作为为流流动动相相，而而另另一一个个液液相相则则涂涂渍渍在在很很细细惰惰性性载载体体或或硅硅胶胶上上作作为为固固定定相相。流流动动相相与与固固定定相相应应互不相溶，两者之间应有一明显的分界面。互不相溶，两者之间应有一明显的分界面。 与与气气液液分分配配色色谱谱法法一一样样，分分配配平平衡衡的的总总结结果果导导致各组分的差速迁移，从而实现分离。致各组分的差速迁移，从而实现分离。 分分配配系系数数（K）或或分分配配比比（k）小小的的组组分分，保保留留值值小小，先先流流出出柱柱。然然而而与与气气相相色色谱谱法法不不同同的的是是，流流动相的种类对分配系数有较大的影响。动相的种类对分配系数有较大的影响。二、液液色谱法二、液液色谱法高效液相色谱法(15)课件液液色谱的固定相由载体和固定液组成。液液色谱的固定相由载体和固定液组成。常用的载体有下列几类：常用的载体有下列几类：n表面多孔型载体（薄壳型微珠载体），由直径为表面多孔型载体（薄壳型微珠载体），由直径为30 40 m的实心玻璃球和厚度约为的实心玻璃球和厚度约为1 2 m的多孔性外层所组的多孔性外层所组成。成。n全多孔型载体，由硅胶、硅藻土等材料制成，直径全多孔型载体，由硅胶、硅藻土等材料制成，直径30 50 m的多孔型颗粒的多孔型颗粒n全多孔型微粒载体，由全多孔型微粒载体，由nm级的硅胶微粒堆积而成，又称堆级的硅胶微粒堆积而成，又称堆积硅珠。这种载体粒度为积硅珠。这种载体粒度为5 10 m。由于颗粒小，所以柱。由于颗粒小，所以柱效高，是目前使用最广泛的一种载体。效高，是目前使用最广泛的一种载体。1. 固定相固定相高效液相色谱法(15)课件n在液液色谱中，要求流动相对固定相的溶解度尽可在液液色谱中，要求流动相对固定相的溶解度尽可能小，因此固定液和流动相的性质往往相反。能小，因此固定液和流动相的性质往往相反。n当选择固定液是极性物质时，所选用的流动相通常当选择固定液是极性物质时，所选用的流动相通常是极性很小的溶剂或非极性溶剂。以极性物质作为是极性很小的溶剂或非极性溶剂。以极性物质作为固定相，非极性溶剂作流动相的液液色谱，称为固定相，非极性溶剂作流动相的液液色谱，称为正正相分配色谱相分配色谱，适合于分离极性化合物。，适合于分离极性化合物。n如选用非极性物质为固定相，而极性溶剂为流动相如选用非极性物质为固定相，而极性溶剂为流动相的液液色谱称为的液液色谱称为反相分配色谱反相分配色谱，这种色谱方法适合，这种色谱方法适合于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物。于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物。2. 流动相流动相高效液相色谱法(15)课件 将将固固定定液液机机械械地地涂涂渍渍在在担担体体上上组组成成固固定定相相。尽尽管管选选用用与与固固定定液液不不互互溶溶的的溶溶剂剂作作流流动动相相，但但在在色色谱谱过过程程中中固固定定液液仍仍会会有有微微量量溶溶解解。以以及及流流动动相相经经过过色色谱谱柱柱的的机机械械冲冲击击，固固定定相相会会不不断断流流失失，即即使使将将流流动动相相预预先先用用固固定定相相液液体体饱饱和和或或在在色色谱谱柱柱前前加加一一个个前前置置柱柱，使使流流动动相相先先通通过过前前置置柱柱，再再进进入色谱柱，但仍难以完全避免固定液的流失。入色谱柱，但仍难以完全避免固定液的流失。三、化学键合相色谱三、化学键合相色谱 上上世世纪纪70年年代代初初发发展展了了一一种种新新型型的的固固定定相相化化学学键键合合固固定定相相。这这种种固固定定相相是是通通过过化化学学反反应应把把各各种种不不同同的的有有机机基基团团键键合合到到硅硅胶胶（载载体体）表表面面的的游游离离羟羟基基上上，代代替替机机械械涂涂渍渍的的液液体体固固定定相相。这这不不仅仅避避免免了了液液体体固固定定相相流流失失的的困困扰扰，还还大大大大改改善善了了固固定定相相的的功功能能，提提高高了了分分离离的的选选择择性性，化化学学键键合色谱适用于分离几乎所有类型的化合物。合色谱适用于分离几乎所有类型的化合物。高效液相色谱法(15)课件n根根据据键键合合相相与与流流动动相相之之间间相相对对极极性性的的强强弱弱，可可将将键键合相色谱分为合相色谱分为极性键合相色谱极性键合相色谱和和非极性键合相色谱。非极性键合相色谱。n在在极极性性键键合合相相色色谱谱中中，由由于于流流动动相相的的极极性性比比固固定定相相极极性性要要小小，所所以以极极性性键键合合相相色色谱谱属属于于正正相相色色谱谱。弱弱极极性性键键合合相相既既可可作作为为正正相相色色谱谱，也也可可作作为为反反相相色色谱谱。但但通通常常所所说说的的反反相相色色谱谱系系指指非非极极性性键键合合色色谱谱。反反相相色谱在现代液相色谱中应用最为广泛。色谱在现代液相色谱中应用最为广泛。高效液相色谱法(15)课件化学键合色谱具有下列化学键合色谱具有下列优点优点：n适适用用于于分分离离几几乎乎所所有有类类型型的的化化合合物物。原原因因：通通过过控控制制化化学学键键合合反反应应，可可以以把把不不同同的的有有机机基基团团键键合合到到硅硅胶胶表表面面上上，从从而而大大大大提提高高了了分分离离的的选选择择性性；通通过过改改变变流流动动相相的的组组成成合合乎乎种种类类来来有有效效地地分分离离非非极极性性、极极性和离子型化合物。性和离子型化合物。n键键合合到到载载体体上上的的基基团团不不易易被被剪剪切切而而流流失失，解解决决了了由由于于固固定定液液流流失失所所带带来来的的困困扰扰，特特别别适适合合于于梯梯度度洗洗脱脱，为复杂体系的分离创造了条件。为复杂体系的分离创造了条件。n键键合合固固定定相相对对不不太太强强的的酸酸及及各各种种极极性性的的溶溶剂剂都都有有很很好的化学稳定性和热稳定性。好的化学稳定性和热稳定性。n固定相柱效高，使用寿命长，分析重现性好。固定相柱效高，使用寿命长，分析重现性好。高效液相色谱法(15)课件 离子交换色谱以离子交换树脂为固定相，树脂离子交换色谱以离子交换树脂为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交换，根据子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交换，根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。四、离子交换色谱法四、离子交换色谱法高效液相色谱法(15)课件1. 固定相固定相 离子交换色谱常用的固定相为离子交换树脂。离子交换色谱常用的固定相为离子交换树脂。常用的离子交换树脂分为三种形式：常用的离子交换树脂分为三种形式：n纯离子交换树脂；纯离子交换树脂；n玻璃珠等硬芯子表面涂一层树脂薄层构成的表面层玻璃珠等硬芯子表面涂一层树脂薄层构成的表面层离子交换树脂；离子交换树脂；n大孔径网络型树脂。大孔径网络型树脂。 高效液相色谱法(15)课件 2. 流动相流动相 离离子子交交换换树树脂脂的的流流动动相相最最常常使使用用水水缓缓冲冲溶溶液液，有有时时也也使使用用有有机机溶溶剂剂如如甲甲醇醇或或乙乙醇醇同同水水缓缓冲冲溶溶液液混混合合使使用用，以以提提高高特特殊殊的的选选择择性性，并并改改善善样样品品的的溶溶解解度。度。高效液相色谱法(15)课件五、排阻色谱法五、排阻色谱法 排排阻阻色色谱谱法法也也称称空空间间排排阻阻色色谱谱或或凝凝胶胶渗渗透透色色谱谱法法，是是一一种种根根据据试试样样分分子子的的尺尺寸寸进进行行分分离离的的色色谱谱技技术术。排排阻阻色色谱谱的的色色谱谱柱柱的的填填料料是是凝凝胶胶，它它是是一一种种表表面面惰惰性性，含含有有许许多多不不同同尺尺寸寸的的孔孔穴穴或或立立体体网网状状物物质质。凝凝胶胶的的孔孔穴穴仅仅允允许许直直径径小小于于孔孔开开度度的的组组分分分分子子进进入入，这这些些孔孔对对于于流流动动相相分分子子来来说说是是相相当当大大的的，以以致流动相分子可以自由地扩散出入。致流动相分子可以自由地扩散出入。 高效液相色谱法(15)课件 对对不不同同大大小小的的组组分分分分子子，可可分分别别渗渗入入到到凝凝胶胶孔孔内内的的不不同同深深度度，大大个个的的组组分分分分子子可可以以渗渗入入到到凝凝胶胶的的大大孔孔内内，但但进进不不了了小小孔孔甚甚至至于于完完全全被被排排斥斥。小小个个的的组组分分分分子子，大大孔孔小小孔孔都都可可以以渗渗入入，甚甚至至进进入入很很深深，一一时时不不易易洗洗脱脱出出来来。因因此此，大大的的组组分分分分子子在在色色谱谱柱柱中中停停留留时时间间较较短短，很很快快被被洗洗脱脱出出来来，它它的的洗洗脱脱体体积积很很小小，小小的的组组分分分分子子在在色色谱谱柱柱中中停停留留时时间间较较长长，洗洗脱脱体体积积较较大大，直直到到所所有有孔孔内内的的最最小小分分子子到到达达柱柱出出口口，完完成成按按分分子子大大小小而而分分离离的的洗洗脱脱过过程程。尺尺寸寸排排阻阻色色谱谱被被广广泛泛应应用用于于大大分分子子的的分分级级，即即用用来来分分析析大大分分子子物物质相对分子质量的分布。质相对分子质量的分布。 高效液相色谱法(15)课件六、离子色谱六、离子色谱 离离子子色色谱谱是是20世世纪纪70年年代代发发展展起起来来的的一一项项新新型型液液相相色色谱谱法法。这这种种方方法法用用离离子子交交换换树树脂脂为为固固定定相相，电电解解质质溶溶液液为为流流动动相相，用用电电导导检检测测器器进进行行检检测测。为为消消除除流流动动相相中中强强电电解解质质背背景景离离子子的的干干扰扰，也也设设置置了了化化学学抑抑制制柱柱。试试样样组组分分在在分分离离柱柱和和抑抑制制柱柱上上的的反反应应原理和离子交换法相同。原理和离子交换法相同。高效液相色谱法(15)课件第五节色谱分离方法的选择第五节色谱分离方法的选择 要要正正确确地地选选择择色色谱谱分分离离方方法法，首首先先必必须须尽尽可可能能多多的的了了解解样样品品的的有有关关性性质质，其其次次必必须须熟熟悉悉各各种种色色谱谱方方法法的的主主要要特特点点及及其其应应用用范范围围。选选择择色色谱谱分分离离方方法法的的主主要要根根据据 是是样样品品的的相相对对分分子子质质量量的的大大小小，在在水水中中和和有有机机溶溶剂剂中中的的溶溶解解度度，极极性性和和稳稳定定程程度度以以及及化化学学结构等物理、化学性质。结构等物理、化学性质。高效液相色谱法(15)课件一、相对分子质量一、相对分子质量 对对于于相相对对分分子子质质量量较较低低（一一般般在在200以以下下），挥挥发发性性比比较较好好，加加热热又又不不易易分分解解的的样样品品，可可以以选选择择气气相相色色谱谱法法进进行行分分析析。相相对对分分子子质质量量在在200 2000的的化化合合物物，可可用用液液固固吸吸附附、液液-液液分分配配和和离离子子交交换换色色谱谱法法。相相对对分分子子质质量量高高于于2000，则则可可用用空空间间排排阻色谱法。阻色谱法。高效液相色谱法(15)课件二、溶解度二、溶解度 水溶性样品最好用离子交换色谱法和液液分水溶性样品最好用离子交换色谱法和液液分配色谱法；微溶于水，但在酸或碱存在下能很好配色谱法；微溶于水，但在酸或碱存在下能很好电离的化合物，也可用离子交换色谱法；油溶性电离的化合物，也可用离子交换色谱法；油溶性样品或相对非极性的混合物，可用液样品或相对非极性的混合物，可用液-固色谱法。固色谱法。高效液相色谱法(15)课件三、化学结构三、化学结构 若若样样品品中中包包含含离离子子型型或或可可离离子子化化的的化化合合物物，或或者者能能与与离离子子型型化化合合物物相相互互作作用用的的化化合合物物（例例如如配配位位体体及及有有机机螯螯合合剂剂），可可首首先先考考虑虑用用离离子子交交换换色色谱谱，但但空空间间排排阻阻和和液液液液分分配配色色谱谱也也都都能能顺顺利利地地应应用用于于离离子子化化合合物物；异异构构体体的的分分离离可可用用液液固固色色谱谱法法；具具有有不不同同官官能能团团的的化化合合物物、同同系系物物可可用用液液液液分分配配色色谱谱法法；对于高分子聚合物，可用空间排阻色谱法。对于高分子聚合物，可用空间排阻色谱法。高效液相色谱法(15)课件衷心感谢全体同学衷心感谢全体同学在本学期的教学中在本学期的教学中给予的合作和支持给予的合作和支持高效液相色谱法(15)课件