会计学1方方 血红蛋白血红蛋白(xuhng dnbi)的提取和分离的提取和分离第一页，共53页。第1页/共52页第二页，共53页。根据课题背景回答下列根据课题背景回答下列(xili)问题：问题：第2页/共52页第三页，共53页。2003年年4月月14日宣布人类日宣布人类(rnli)基因组序列图完成基因组序列图完成这标志着进入了这标志着进入了_和和时代。时代。人类人类(rnli)基因组：基因组：蛋白质组：蛋白质组：_主要主要(zhyo)是对是对_后基因组后基因组蛋白质组蛋白质组指指DNA分子所携带的全部遗传信息。分子所携带的全部遗传信息。生物个体表达的蛋白质分子的总和生物个体表达的蛋白质分子的总和蛋白质功能的研究蛋白质功能的研究血红血红蛋白质的主要功能是蛋白质的主要功能是：_。负责血液中负责血液中O2和和CO2的运输的运输第3页/共52页第四页，共53页。思考思考(sko)1 分离生物大分子的基本思路是什么？分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的选用一定的的方法，分离的方法，分离具有具有(jyu)不同不同的生物大分子。的生物大分子。思考思考2 蛋白质的分离和提取的原理蛋白质的分离和提取的原理(yunl)是什么？是什么？根据蛋白质各种根据蛋白质各种_，如，如_、和、和、3、溶解度、溶解度、4、吸附的性质和、吸附的性质和等等，等等，可以用来分离不同蛋白质。可以用来分离不同蛋白质。特性的差异特性的差异1、分子的形状、分子的形状大小大小物理或化学物理或化学物理或化学性质物理或化学性质2、所带电荷的性质和多少、所带电荷的性质和多少5、对其他分子的亲和力、对其他分子的亲和力第4页/共52页第五页，共53页。思考思考3 高温灭菌和酒精高温灭菌和酒精(jijng)消毒分别利用蛋白质消毒分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？的何种作用，作用结果是什么被破坏？变性变性(binxng)思考思考4 人们用鸡的红细胞提取人们用鸡的红细胞提取DNA，用人，用人 的红细胞提取血红蛋白的红细胞提取血红蛋白(xuhng dnbi)的原因是什么？的原因是什么？鸡的红细胞具有鸡的红细胞具有_，含有，含有DNA，便于进行便于进行DNA的提取；人的红细胞无的提取；人的红细胞无_，结构简单，结构简单，_含量丰含量丰富便于提取血红蛋白。富便于提取血红蛋白。变性变性空间结构空间结构细胞核细胞核细胞核细胞核血红蛋白血红蛋白第5页/共52页第六页，共53页。一、基础知识：一、基础知识： 凝胶色谱法（也叫分配凝胶色谱法（也叫分配(fnpi)色色谱法）：谱法）： 2、凝胶：、凝胶：一些一些(yxi)微小多孔的球体微小多孔的球体-分子筛分子筛（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）葡聚糖、琼脂糖） 根据被根据被，利用具有网状结构的，利用具有网状结构的_（分子筛）的作用（分子筛）的作用(zuyng)，来进行分离。，来进行分离。 1、概念：、概念：分离物质的蛋白质相对分子质量的大小分离物质的蛋白质相对分子质量的大小凝胶凝胶第6页/共52页第七页，共53页。3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对_的蛋白质容易进入凝胶的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程内部的通道，路程_，移动，移动(ydng)速度速度_，而，而_的蛋白质无法的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在进入凝胶内部的通道，只能在_移动移动(ydng)，路程，路程_，移动，移动(ydng)速度速度_，相对分子质量不同的蛋白质因此得以，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。分离。4、具体、具体(jt)过程过程相对相对(xingdu)分子质量较小分子质量较小较长较长较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快第7页/共52页第八页，共53页。洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。促使蛋白质分子的差速流动。混合物混合物上上 柱柱洗洗脱脱大分子流动快大分子流动快小分子流动慢小分子流动慢收收 集集大分子大分子收收 集集小分子小分子 第8页/共52页第九页，共53页。也称：洗脱也称：洗脱(x tu)瓶瓶第9页/共52页第十页，共53页。 1、概念、概念(ginin)：由：由溶溶解于水中，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶解于水中，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。液。 缓冲溶液缓冲溶液(hun chn rn y)： 2、缓冲作用：、缓冲作用：在一定在一定(ydng)范围内，能够抵制范围内，能够抵制对溶液对溶液的影响，的影响，维持维持PH基本不变。基本不变。外界的酸、碱或稍加稀释外界的酸、碱或稍加稀释PH值值12种缓冲剂种缓冲剂调节缓冲剂的调节缓冲剂的就可以制得就可以制得使用的缓冲液。使用的缓冲液。使用比例使用比例在不同在不同PH范围内范围内第10页/共52页第十一页，共53页。3、缓冲溶液的正确配制、缓冲溶液的正确配制(pizh)和和PH的准确的准确测定的重要性测定的重要性生物体进行的各种生物化学反应生物体进行的各种生物化学反应(huxu fnyng)都是在一都是在一定的定的PH下进行的，为了能够在实验条件下下进行的，为了能够在实验条件下的过程，就必须保持的过程，就必须保持的基本一致。的基本一致。 思考思考(sko)：说出人体血液中缓冲对。：说出人体血液中缓冲对。 NaH2PO4 / Na2HPO4H2CO3 / NaHCO3准确模拟生物体内准确模拟生物体内体外溶液的体外溶液的PH与体内环境中与体内环境中第11页/共52页第十二页，共53页。电泳电泳(din yn)：1、概念、概念(ginin)：_ _思考：在血红蛋白思考：在血红蛋白(xuhng dnbi)提取和分离的提取和分离的整个实验中使用的缓冲液是什么？它的目的是什整个实验中使用的缓冲液是什么？它的目的是什么？么？使用的是使用的是_，目的是利用缓冲液模，目的是利用缓冲液模拟拟_，保证血红蛋白的，保证血红蛋白的_。）。）磷酸缓冲液磷酸缓冲液细胞内的细胞内的PH环境环境正常结构和功能正常结构和功能只有血红蛋白只有血红蛋白_才能才能保证的材料的保证的材料的科学研究；材料为科学研究；材料为_色色便于便于_。指带电粒子在电场作用下发生指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。迁移的过程。仍具有活性仍具有活性观察观察红红第12页/共52页第十三页，共53页。 2、原理：许多重要的生物大分子，如、原理：许多重要的生物大分子，如_等都具有等都具有_ 在在 _下，这些基团会带上下，这些基团会带上_ 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其其_移动。电泳利用了移动。电泳利用了待分离样品中各种分子待分离样品中各种分子_以以及分子本身的及分子本身的_、_的不同使带的不同使带电分子产生不同的电分子产生不同的_，从而，从而(cng r)实现样品中各种分子的分离。实现样品中各种分子的分离。多肽多肽(du ti)、核酸、核酸可解离可解离(ji l)的基团的基团正电或负电正电或负电所带电荷所带电荷相反相反的电极的电极带电性质的差异带电性质的差异大小大小形状的形状的迁移速度迁移速度一定的一定的PH第13页/共52页第十四页，共53页。第14页/共52页第十五页，共53页。电泳电泳(din yn)方法分类：方法分类：琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳：是用琼脂或琼脂糖作支持介琼脂糖凝胶电泳：是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品(yngpn)，如，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。脂糖凝胶进行电泳分离。聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳(PAGE)第15页/共52页第十六页，共53页。聚丙稀酰胺凝胶电泳：聚丙稀酰胺凝胶电泳：测定测定(cdng)_通通常用：常用：（SDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质相对分子蛋白质相对分子(fnz)质量质量聚丙稀酰胺凝胶：聚丙稀酰胺凝胶：是由单体是由单体(dn t)(dn t)丙烯酰胺和交联剂（丙烯酰胺和交联剂（N,NN,N- -亚甲基双丙烯酰胺）在引发剂亚甲基双丙烯酰胺）在引发剂( (过硫酸铵）和过硫酸铵）和催化剂（四甲基己二胺）的作用下聚合交联催化剂（四甲基己二胺）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶成三维网状结构的凝胶第16页/共52页第十七页，共53页。电泳电泳(din yn)方法分类：方法分类：SDS是一种是一种(y zhn)蛋白质变性剂蛋白质变性剂十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠SDS的作用的作用(zuyng)是什么呢？是什么呢？第17页/共52页第十八页，共53页。为了消除为了消除_对迁移率的影响可以在凝胶中加对迁移率的影响可以在凝胶中加入入_，它能使，它能使_。由几条肽链。由几条肽链组成组成(z chn)的蛋白质复合体在的蛋白质复合体在SDS的作用下会的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是解聚成单条肽链，因此测定的结果只是_。SDS能与各种蛋白质形成能与各种蛋白质形成蛋白质蛋白质SDS复合物，复合物，SDS所带负电荷的量所带负电荷的量_蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的了不同种蛋白质间的_，使电泳迁移率完，使电泳迁移率完全取决于全取决于_。 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它它_以及以及(yj)_等等因素。因素。SDS单条单条(dntio)肽链的分子量肽链的分子量分子的大小分子的大小所带静电荷的多少所带静电荷的多少分子的大小分子的大小静电荷静电荷蛋白质发生完全变性蛋白质发生完全变性大大超过了大大超过了电荷差别电荷差别第18页/共52页第十九页，共53页。二二 实验实验(shyn)操作操作蛋白质的提取和分离一般蛋白质的提取和分离一般(ybn)分为四步：分为四步：1.样品样品(yngpn)处处理理血血液液血浆血浆水分水分固体物质固体物质血浆蛋白血浆蛋白无机盐无机盐磷脂磷脂葡萄糖等葡萄糖等血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红血红蛋白蛋白（ ）两个两个a a肽链肽链两个两个一肽链肽链样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定共四条肽链共四条肽链9090第19页/共52页第二十页，共53页。第20页/共52页第二十一页，共53页。血红素血红素基团基团第21页/共52页第二十二页，共53页。每个肽链环绕每个肽链环绕_，此基团，此基团(j (j tun)tun)可携带可携带_。血红蛋白。血红蛋白因含有因含有_而呈红色。本课题可选用猪、牛、羊而呈红色。本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。一个一个(y )(y )亚铁血红素基团亚铁血红素基团一分子一分子(fnz)(fnz)氧或一分子氧或一分子(fnz)(fnz)二氧化碳二氧化碳血红素血红素(1)(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤血液血液100mL3g柠檬酸钠柠檬酸钠红细胞红细胞血血 浆浆 红细胞红细胞 搅拌搅拌10min重复洗涤重复洗涤3次，次，直至直至表明：表明：红细胞已洗涤干净红细胞已洗涤干净上清液没有黄色上清液没有黄色低速低速短时间短时间离心离心2 min吸出血浆吸出血浆5倍体积生理盐水倍体积生理盐水第22页/共52页第二十三页，共53页。洗涤目的：去除洗涤目的：去除_洗涤方法：洗涤方法：_离心（洗涤速度过高离心（洗涤速度过高和时间过长会使和时间过长会使_等一同沉淀等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层(shngcng)透明的透明的_，将下层，将下层_的红细胞液体倒入的红细胞液体倒入_再加入用再加入用_的的_质量分数为质量分数为_溶液洗涤。溶液洗涤。杂质杂质(zzh)蛋白蛋白低速低速(d s)短时间短时间黄色血浆黄色血浆暗红色暗红色烧杯烧杯白细胞和淋巴细胞白细胞和淋巴细胞五倍体积五倍体积生理盐水生理盐水的氯化钠的氯化钠洗涤次数过少洗涤次数过少：无法除去血浆蛋白无法除去血浆蛋白第23页/共52页第二十四页，共53页。(2)血红蛋白血红蛋白(xuhng dnbi)的释的释放放 加加_到到_体积体积(tj)，再加，再加40体积体积(tj)的的_ ，置于，置于_上充分搅拌上充分搅拌10分钟分钟, 细胞破裂释放出血红蛋白细胞破裂释放出血红蛋白.原血液原血液(xuy)甲苯甲苯磁力搅拌器磁力搅拌器蒸馏水蒸馏水目的分析：目的分析：蒸馏水蒸馏水的作用是的作用是_。加入加入甲苯甲苯的作用是的作用是_。1.充分搅拌充分搅拌10分钟分钟的目的是的目的是_。使红细胞大量吸水胀裂使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂加速红细胞的破裂为什么加入甲苯而不是其他的无机溶剂？为什么加入甲苯而不是其他的无机溶剂？第24页/共52页第二十五页，共53页。 (3)分离血红蛋白溶液：将搅拌分离血红蛋白溶液：将搅拌(jiobn)好混好混合液转移到离心管内，以合液转移到离心管内，以2000r/min的速度的速度离心离心10 min ，试管中的溶液分为，试管中的溶液分为4层层:脂溶性沉脂溶性沉淀淀(chndin)层层分离分离(fnl)过过程程红细胞红细胞混合液混合液离心管离心管烧杯烧杯有机溶有机溶剂剂甲苯甲苯高速离心高速离心10min 10min 滤纸滤纸过滤过滤血红血红蛋白蛋白第25页/共52页第二十六页，共53页。第第1层（最上层）：层（最上层）： （ ）甲苯）甲苯(ji bn)层层第第2层（中上层）：层（中上层）： （ ）的沉淀）的沉淀(chndin)层，层， （ ）色薄层固体）色薄层固体第第3层（中下层）：层（中下层）： （ ）的水溶液层）的水溶液层 （ ）的液体）的液体(yt) 第第4层（最下层）：层（最下层）： 其它杂质（其它杂质（ ）的沉淀层）的沉淀层无色透明无色透明脂溶性物质脂溶性物质白白血红蛋白血红蛋白红色透明红色透明暗红色暗红色第26页/共52页第二十七页，共53页。用湿滤纸过滤，除去用湿滤纸过滤，除去_，于，于中静中静置片刻后，分出下层置片刻后，分出下层(xicng)的红色透明的红色透明液体液体,即为即为。脂溶性沉淀脂溶性沉淀(chndin)层层血红蛋白血红蛋白(xuhng dnbi)分液漏斗分液漏斗第27页/共52页第二十八页，共53页。取取ml的血红蛋白溶液装入的血红蛋白溶液装入中，中，将透析袋放入盛有将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/L的的中，中，pH为为，透析，透析12小时，目的是小时，目的是或用于更换或用于更换样品样品(yngpn)中的中的。透析袋一。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。除去样品除去样品(yngpn)中小分子量的杂质中小分子量的杂质透析袋透析袋磷酸磷酸(ln sun)缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液(4)透析透析1血红蛋白的粗分离血红蛋白的粗分离第28页/共52页第二十九页，共53页。2.凝胶色谱凝胶色谱(s p)制作制作1）凝胶色谱）凝胶色谱(s p)柱的制作柱的制作取长取长4040厘米（不超过厘米（不超过(chogu)1m(chogu)1m），内径厘），内径厘米（不超过米（不超过(chogu)2cm(chogu)2cm）的玻璃管，两端需用）的玻璃管，两端需用砂纸磨平砂纸磨平底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔 挖出凹穴挖出凹穴 安装移液管头部安装移液管头部 覆盖尼龙网覆盖尼龙网，再用，再用100100目尼龙纱包好。目尼龙纱包好。a a、选择合适的的橡皮塞，中间、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；打孔；b b、在橡皮塞顶部切出锅底状的（、在橡皮塞顶部切出锅底状的（ ），在的（），在的（ ）头部切下（）头部切下（ ）长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。橡皮塞的凹穴底面。凹穴凹穴移液管移液管5cm5cm纯化方法纯化方法第29页/共52页第三十页，共53页。底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则的凹穴底面，否则(fuz)，还会导致，还会导致，蛋白，蛋白质分离不彻底。质分离不彻底。c.c.剪剪小圆片覆盖在小圆片覆盖在上，用上，用的尼龙纱将的尼龙纱将橡皮塞橡皮塞包好，插到玻璃管一端。包好，插到玻璃管一端。d d、色谱、色谱(s p)(s p)柱下端用移液头部做柱下端用移液头部做，连接一细的，连接一细的，并用螺旋夹控制尼龙管的并用螺旋夹控制尼龙管的，另一端放入收集，另一端放入收集的收集器内的收集器内橡皮塞的凹面橡皮塞的凹面100100目目上部上部出口出口(ch ku)(ch ku)部位部位尼龙管尼龙管打开与关闭打开与关闭色谱流出液色谱流出液难以铺实尼龙网难以铺实尼龙网液体残留液体残留尼龙网尼龙网第30页/共52页第三十一页，共53页。安装安装(nzhung)其他附属结构。其他附属结构。顶塞的制作顶塞的制作(zhzu)：插入插入(ch r)安装了玻璃管安装了玻璃管的橡皮塞的橡皮塞组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。安装了玻璃管安装了玻璃管第31页/共52页第三十二页，共53页。2）凝胶色谱）凝胶色谱(s p)柱填料的处理柱填料的处理（1 1）凝胶的选择：（）凝胶的选择：（ ）（G-75G-75）：）：“G”“G”表示表示(biosh)(biosh)凝胶的凝胶的、 及及。 75 75表示表示(biosh)(biosh)凝胶的凝胶的，即每克凝胶即每克凝胶膨胀时吸水膨胀时吸水。（2 2）方法：）方法： 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于凝胶浸泡于（也可用洗脱（也可用洗脱(x tu)(x tu)缓冲液）中充分溶胀后，配成缓冲液）中充分溶胀后，配成。蒸馏水蒸馏水凝胶悬浮液凝胶悬浮液交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶交联程度交联程度膨胀程度膨胀程度分离范围分离范围得水值得水值克克第32页/共52页第三十三页，共53页。固定：将色谱柱处置固定：将色谱柱处置(chzh)固定在支固定在支架上架上装填：装填： 将（将（ ）一次性的缓慢倒入（）一次性的缓慢倒入（ ）内，装填时轻轻敲动色谱）内，装填时轻轻敲动色谱(s p)柱，使凝胶填柱，使凝胶填装均匀。装均匀。（3）凝胶色谱）凝胶色谱(s p)柱的装填方法柱的装填方法凝胶悬浮液凝胶悬浮液色谱柱色谱柱注意：注意：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。的洗脱次序，降低分离效果。 第33页/共52页第三十四页，共53页。立刻用磷酸缓冲液洗涤立刻用磷酸缓冲液洗涤(xd)(xd)平平衡衡12h12h洗涤洗涤(xd)平衡平衡一次性缓慢一次性缓慢(hunmn)倒入；轻轻倒入；轻轻敲打敲打装填悬浮液装填悬浮液凝胶颗粒蒸馏水凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液配制悬浮液计算称量凝胶计算称量凝胶固定色谱柱固定色谱柱材料：材料：交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶G-75 20mmol/LG-75 20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液“G”G”表示什么？表示什么？7575代表什么？代表什么？2、凝胶色谱柱的装填、凝胶色谱柱的装填第34页/共52页第三十五页，共53页。洗涤平衡洗涤平衡 装填装填(zhun tin)完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在( )高的操作压下，用高的操作压下，用300ml的的20mmol/l的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液（pH为）充分（为）充分（ ）12小时。小时。 洗涤洗涤(xd)(xd)平衡平衡注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响混入，影响(yngxing)(yngxing)液体在柱内的流动与液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。不能发生洗最终生物大分子物质的分离效果。不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。装。 50cm50cm第35页/共52页第三十六页，共53页。 3 3）样品加入）样品加入(jir)(jir)与洗脱与洗脱加样前加样前 打开下端出口，使柱内凝打开下端出口，使柱内凝胶面上的（胶面上的（ ）缓慢缓慢(hunmn)下降到与下降到与（ ）平齐，关闭）平齐，关闭出口出口缓冲液缓冲液凝胶面凝胶面50cm50cm第36页/共52页第三十七页，共53页。加透析样品加透析样品(yngpn)第37页/共52页第三十八页，共53页。调整缓冲液面：与凝胶面平齐调整缓冲液面：与凝胶面平齐滴加透析样品：用（滴加透析样品：用（ ）将）将1ml（ ）的样品加到色谱柱的（的样品加到色谱柱的（ ）样品渗入凝胶床：（样品渗入凝胶床：（ ）洗脱：打开下端洗脱：打开下端(xi dun)，用磷酸缓冲液，用磷酸缓冲液洗脱洗脱收集：待（收集：待（ ）接近色谱柱底）接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每（端时，用试管收集流出液，每（ ）收集一试管连续收集收集一试管连续收集注意正确的加样操作：注意正确的加样操作： 不要触及不要触及(ch j)(ch j)破坏凝胶面破坏凝胶面 贴壁加样贴壁加样 使吸管管口沿管壁环绕移动使吸管管口沿管壁环绕移动吸管吸管透析液透析液顶端顶端(dngdun)样品完全进凝胶层样品完全进凝胶层5ml红色的蛋白质红色的蛋白质第38页/共52页第三十九页，共53页。血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（ ）；然后）；然后(rnhu)(rnhu)通过凝通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（即样品的（ ）；最后经聚丙烯酰胺凝胶）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（电泳进行（ ）。）。思考思考(sko)样品样品(yngpn)(yngpn)的粗分离的粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定你能描述血红蛋白的提取和分离的你能描述血红蛋白的提取和分离的完整过程吗？完整过程吗？P70 第第4题题第39页/共52页第四十页，共53页。血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集集(shuj)(shuj)洗脱液。这使血红蛋白的分离过洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。程非常直观，大大简化了实验操作。 思考思考(sko)第40页/共52页第四十一页，共53页。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳判断（判断（ ）的蛋白质是否达到要求，）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的纯度需要进行蛋白质的纯度(chnd)鉴定。鉴定。纯化纯化(chn hu)血红血红(xuhng)核蛋白核蛋白纯度鉴定纯度鉴定第41页/共52页第四十二页，共53页。 观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-185-185-185-18），如果分），如果分），如果分），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀(chndin)(chndin)(chndin)(chndin)，也得不，也得不，也得不，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。三、实验结果分析三、实验结果分析三、实验结果分析三、实验结果分析(fnx)(fnx)(fnx)(fnx)与与与与评价评价评价评价 1 1 1 1、你是否、你是否、你是否、你是否(sh fu)(sh fu)(sh fu)(sh fu)完成了对血液样品的处理？你能完成了对血液样品的处理？你能完成了对血液样品的处理？你能完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？描述处理后的样品发生了哪些变化吗？描述处理后的样品发生了哪些变化吗？描述处理后的样品发生了哪些变化吗？2 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？成功吗？你是如何判断的？ 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖例如蓝色葡聚糖20002000或红色葡聚糖，或红色葡聚糖，观察色带移动观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 第42页/共52页第四十三页，共53页。 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着匀、狭窄、平整，随着(su zhe)(su zhe)洗脱液缓慢流出；洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。 3 3 3 3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动(ydng)(ydng)(ydng)(ydng)吗？请描述红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动(ydng)(ydng)(ydng)(ydng)情况，并据此情况，并据此情况，并据此情况，并据此判断分离效果？判断分离效果？判断分离效果？判断分离效果？第43页/共52页第四十四页，共53页。回忆蛋白质的有关回忆蛋白质的有关(yugun)知识知识第44页/共52页第四十五页，共53页。( ( ( (一）蛋白质一）蛋白质一）蛋白质一）蛋白质占细胞占细胞占细胞占细胞(xbo)(xbo)(xbo)(xbo)干重的干重的干重的干重的50505050以上，细胞以上，细胞以上，细胞以上，细胞(xbo)(xbo)(xbo)(xbo)中含量最多的有机物中含量最多的有机物中含量最多的有机物中含量最多的有机物2 2 2 2、组成、组成、组成、组成(z (z (z (z chn)chn)chn)chn)元素元素元素元素C C C C、HHHH、O OO O、N N N N一、基础知识一、基础知识一、基础知识一、基础知识1 1 1 1、含量、含量、含量、含量(hnling)(hnling)(hnling)(hnling)3 3 3 3、相对分子质量、相对分子质量、相对分子质量、相对分子质量高分子化合物高分子化合物高分子化合物高分子化合物第45页/共52页第四十六页，共53页。4 4 4 4、基本、基本、基本、基本(jbn)(jbn)(jbn)(jbn)组成单位组成单位组成单位组成单位氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸5 5 5 5、氨基酸通式、氨基酸通式、氨基酸通式、氨基酸通式(tngsh)(tngsh)(tngsh)(tngsh)R R R RHHHHC C C CCOOHCOOHCOOHCOOHNHNHNHNH2 2 2 26 6 6 6、氨基酸连接、氨基酸连接、氨基酸连接、氨基酸连接(linji)(linji)(linji)(linji)方式方式方式方式脱水缩合脱水缩合脱水缩合脱水缩合第46页/共52页第四十七页，共53页。8 8 8 8、分子结构、分子结构、分子结构、分子结构(fn z ji (fn z ji (fn z ji (fn z ji u)u)u)u)7 7 7 7、肽键、肽键、肽键、肽键(ti jin)(ti jin)(ti jin)(ti jin)COCOCOCONHNHNHNH氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸肽链肽链肽链肽链蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质脱水缩合脱水缩合脱水缩合脱水缩合盘曲折叠盘曲折叠盘曲折叠盘曲折叠（一条或者多条）（一条或者多条）（一条或者多条）（一条或者多条）第47页/共52页第四十八页，共53页。10101010、生理功能、生理功能、生理功能、生理功能细细细细胞胞胞胞和和和和生生生生物物物物体体体体的的的的结结结结构构构构物物物物质质质质，是是是是人人人人体体体体发发发发育育育育和和和和组组组组织织织织更更更更新新新新的的的的主主主主要要要要原原原原料料料料，具具具具有有有有运运运运输输输输、调调调调节节节节、免免免免疫疫疫疫、催催催催化化化化(cu (cu (cu (cu hu)hu)hu)hu)等作用，是一切生命活动的主要承担者等作用，是一切生命活动的主要承担者等作用，是一切生命活动的主要承担者等作用，是一切生命活动的主要承担者氨基酸的种类不同氨基酸的种类不同氨基酸的种类不同氨基酸的种类不同(b tn)(b tn)(b tn)(b tn)；数目成百上千；数目成百上千；数目成百上千；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万别别别别9 9 9 9、蛋白质结构、蛋白质结构、蛋白质结构、蛋白质结构(jigu)(jigu)(jigu)(jigu)的多样性的多样性的多样性的多样性第48页/共52页第四十九页，共53页。氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不存氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不存氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不存氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不存在了，形成的化合物即多肽的一端在了，形成的化合物即多肽的一端在了，形成的化合物即多肽的一端在了，形成的化合物即多肽的一端(ydun)(ydun)(ydun)(ydun)只有一只有一只有一只有一个氨基，另一端个氨基，另一端个氨基，另一端个氨基，另一端(ydun)(ydun)(ydun)(ydun)只有一个羧基（不计只有一个羧基（不计只有一个羧基（不计只有一个羧基（不计R R R R基基基基上的氨基和羧基）。所以对于一条多肽链说，至少上的氨基和羧基）。所以对于一条多肽链说，至少上的氨基和羧基）。所以对于一条多肽链说，至少上的氨基和羧基）。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨基和羧基都是一个应有的氨基和羧基都是一个应有的氨基和羧基都是一个应有的氨基和羧基都是一个若有个若有个若有个若有个n n n n氨基酸分子氨基酸分子氨基酸分子氨基酸分子(fnz)(fnz)(fnz)(fnz)缩和成缩和成缩和成缩和成mmmm条肽链条肽链条肽链条肽链, , , ,则可则可则可则可形成形成形成形成n - mn - mn - mn - m个肽键个肽键个肽键个肽键, , , ,脱去个脱去个脱去个脱去个n - mn - mn - mn - m个水分子个水分子个水分子个水分子(fnz)(fnz)(fnz)(fnz)，至，至，至，至有氨基和有氨基和有氨基和有氨基和 羧基各羧基各羧基各羧基各mmmm个个个个11111111、相关、相关、相关、相关(xinggun)(xinggun)(xinggun)(xinggun)计计计计算算算算第49页/共52页第五十页，共53页。（1）血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：）血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：_、_、_和和_。（2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来来(hu li)，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。加入柠檬酸钠的目的加入柠檬酸钠的目的_。以上所述的过程即是样品处理，它包括以上所述的过程即是样品处理，它包括_、_、收集血红蛋白溶液。、收集血红蛋白溶液。（3）收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。）收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。透析的目的是透析的目的是_。透析的原理是透析的原理是_。（4）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。电泳进行纯度鉴定。样品纯化的目的样品纯化的目的_。血红蛋白有什么特点？血红蛋白有什么特点？_。这一特点对进行蛋白质的。这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义分离有什么意义_。第50页/共52页第五十一页，共53页。答案答案:样品处理样品处理 粗分离粗分离 纯化纯化 纯度鉴定纯度鉴定 防止血液凝固防止血液凝固 红细胞洗涤红细胞洗涤 血红蛋白释放血红蛋白释放 去除相对分子去除相对分子(fnz)质量较小的杂质质量较小的杂质 透析袋能使小分子透析袋能使小分子(fnz)自由进出，而大分子自由进出，而大分子(fnz)则保留在袋内则保留在袋内 通过凝胶色谱法，将相对分子通过凝胶色谱法，将相对分子(fnz)质量大的杂质蛋白除去质量大的杂质蛋白除去 呈现红色呈现红色 在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液，这使血红蛋白的分离过程非常什么时候应该收集洗脱液，这使血红蛋白的分离过程非常直观直观,简化了实验操作。简化了实验操作。第51页/共52页第五十二页，共53页。内容(nirng)总结会计学。的何种作用，作用结果是什么被破坏。一些微小多孔的球体-分子筛（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）。思考：在血红蛋白提取和分离的整个实验中使用的缓冲液是什么。琼脂糖凝胶电泳：是用琼脂或琼脂糖作支持介。固定：将色谱柱处置固定在支架上。注意：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。直观(zhgun),简化了实验操作第五十三页，共53页。