荧光定量PCR1细胞细胞RNARNA提取提取样品样品：293T细胞试剂试剂：超纯RNA提取试剂盒、氯仿、70%乙醇方法方法：柱式原理原理：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放。释放出来的DNA和RNA由于在特定pH和盐浓度下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离。 2 细胞悬液离心，倒掉上清，加入1ml RLT； 反复吹打，使样本充分裂解；室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离1. 裂解：裂解：2. 抽提：抽提：加入200ul氯仿，剧烈振荡15s，室温放置2min；4 12,000 rpm 离心10分钟，此时样品分为三层； 上层无色水相， 中间白色蛋白质相， 下层红色有机相， uRNA在上层水相中细胞细胞RNARNA提取提取33. 过柱子：柱子： 吸取上层水相，至新的RNase-Free管中（注：不要吸到中层） 加入等体积70%的乙醇，颠倒混匀； 将溶液全部加入到已装入收集管（CollectionTube 2ml)的吸附柱（SpinColumn RM）中。若一次(700ul)不能加完溶液，可分多次入； 12,000rpm离心20s，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中；4. 洗洗涤： 向吸附柱加入700 l Buffer RW1，12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液， 将吸附柱重新放回收集管中； 向吸附柱中加入500lBufferRW2（使用前检查是否已加入无水乙醇）， 12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中； 重复步骤8；12,000rpm离心2min，弃废液，吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干；细胞细胞RNARNA提取提取45. 洗洗涤： 将吸附柱置于一个新的无RNase离心管（CollectionTube1.5ml）中向吸附柱的 中间部位加入30-50lRNase-FreeWater，室温放置1min，12,000rpm离心1min， 收集RNA溶液，进行后续试验或-70保存RNA，防止降解。注意：1）RNase-FreeWate体积不应小于30l，体积过小影响回收率。 2）若提高RNA的产量，可用30-50 l新的RNase-FreeWater重复步骤5。 3）若提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤5。6. RNA检测：用ddH2O，对仪器进行调零；取1ul的RNA溶液进行测定；测定样品纯度和浓度。 纯度：OD260/OD280 = 1.9-2.1 2.2 RNA水解 浓度：RNA(ug/ml)=40OD260*稀释倍数细胞细胞RNARNA提取提取5逆转录逆转录实验材料：材料：HiFi-MMLV cDNA第一第一链合成合成试剂盒，盒，RNA实验步步骤：1. 将将 RNA模板、模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFi-MMLV和和 RNase- Free Water溶解并置于冰上溶解并置于冰上备用。用。2. 根据以下表格配置反根据以下表格配置反应体系，体系，总体体积为20 l。试剂20 l 反反应体系体系dNTP Mix，2.5 mM Each4 lPrimer Mix2 lRNA Template2 l5RT Buffer4 lDTT，0.1 M2 lHiFi-MMLV，200 U/l1 lRNase-Free Water5 5 l冰上配制冰上配制短暂离心短暂离心4242 50min 50min7070 15min 15min63. 涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。4. 42孵育3050分钟，70孵育15分钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。5. 逆转录产物可直接用于PCR和荧光定量PCR，或置于-20长期保存。逆转录逆转录7 荧光定量光定量PCR材料：材料：2UltraSYBR Green Mixture，cDNA，actin引物引物实验步步骤：1. 稀稀释模板：每稀模板：每稀释一个倍数，需要将溶液混匀，并短一个倍数，需要将溶液混匀，并短暂离心。离心。编号号模板稀模板稀释倍数倍数水用量水用量模板用量模板用量11倍倍0ul原液原液210倍倍45 l5 l （从从1号管取）号管取）3100倍倍45 l5 l（从（从2号管取）号管取）41000倍倍45l5 l（从（从3号管取）号管取）510000倍倍45 l5 l（从（从4号管取）号管取）645ul对照对照82. 配制配制PCR预混反混反应体系：体系：做5个样本，配制8个样本的预混体系，配制方式如下：试剂配制的配制的8个孔的个孔的预混混体系体系20 l反反应体系体系2UltraSYBR Mixture80 l10 lForward Primer，10 M6.4 l0.8 lReverse Primer，10 M人人cDNA0 l2 lRNase-Free Water57.6 l7.2 l3. 将配制的将配制的预混体系，分装到八混体系，分装到八连管中。共加管中。共加6个孔，每个孔中加个孔，每个孔中加入入18 l的的预混体系。混体系。 荧光定量光定量PCR94. 模板加入：模板加入：每个孔中分每个孔中分别加入加入2 l模板，加模板，加样顺序如下：序如下：加加样孔孔123450样品品原液原液稀稀释10倍倍稀稀释100倍倍稀稀释1000倍倍稀稀释10000倍倍水水加入体加入体积2 l2 l2 l2 l2 l2 l5. 混匀，短混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。离心，使管壁上的溶液收集到管底。6. PCR反反应程序：程序： 步步骤温度温度时间预变性性9510min 变性性9515s退火退火/延伸延伸 601 min融解曲融解曲线分分析析 95 15s 60 1 min 95 15s 60 15s注意事注意事项：1首先配制预混体系，再将预混体系分首先配制预混体系，再将预混体系分 装到八连管中。装到八连管中。2. 稀稀释模板模板时，需要混匀。，需要混匀。 不要直接在八不要直接在八连管管壁或管盖上做管管壁或管盖上做标 荧光定量光定量PCR10Thank You !