水溶液中酶含量的分析测定 曾平 03081064水溶液中酶含量的分析测定为什么要测定酶的含量？酶的应用十分广泛：作为分析试剂（检测血糖或尿糖浓度，ELISA体系中作为指示剂）；多种有机化合物的实验室和商业合成(如从葡萄糖产生果糖)，生物大分子的降解（如淀粉生成葡萄糖，基因图谱中DNA的特异剪切，低相对分子质量化合物的降解），特定生物大分子的合成（如PCR反应中合成DNA）等。因此，很有必要对酶的含量进行测定。水溶液中酶含量的分析测定酶含量的主要测定方法 双缩脲法双缩脲法Folin-酚试剂法 Folin-酚试剂法紫外吸收的直接测量法 紫外吸收的直接测量法结束语水溶液中酶含量的分析测定该方法基于碱性溶液中Cu2 +与蛋白质中两个邻近肽键的专一性反应。因此，不同蛋白质之间氨基酸组成的差异不会显著影响测定结果。水溶液中酶含量的分析测定1. 配制适当浓度范围的蛋白质标准液（通常为 120mg/mL之间）。2. 取1mL各标准蛋白质溶液分别加在不同的试管中。用1mL蒸馏水或合适的溶液作空白对照。3.取1mL各待测溶液分别加到不同的试管中。4. 取1mL双缩脲试剂（1.5gCuSO45H2O，6.0g酒石酸钾钠溶解于300mL 100 mgmL-1的NaOH中）分别加到所有的标准液、待测液及空白试剂中。5. 试管在37保温15min。6. 520nm波长处用空白试剂调零，测出各种溶液的吸光值。溶液的颜色可保持几小时不变。 双缩脲法的主要缺陷是灵敏度低，因而不适用于蛋白质浓度小于1mg/mL的溶液测定。酶含量的主要测定方法 水溶液中酶含量的分析测定实验实验材料、主要仪器：、Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为5100g蛋白质。Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。、实验材料、主要仪器：绿豆芽下胚轴（也可用其它材料如面粉）、722型（或721型）分光光度计、4 000r/min的离心机、分析天平、容量瓶（50mL）、量筒、移液管（0.5mL、1mL、5mL）。、试剂(纯度均为分析纯)(1)0. 5mol/L NaOH(2) 试剂甲：水溶液中酶含量的分析测定(A)称取10g Na2CO3，2g NaOH和0.25g酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至500mL。(B)称取0.5g CuSO45H2O，溶解后用蒸馏水定容至100mL。每次使用前将(A)液50份与(B)液1份，即为试剂甲，其有效期为1d，过期失效。（3）试剂乙：在1.5L容积的磨口回流器中加入100g钨酸钠(Na2WO42H2O)和700mL蒸馏水，再加50mL 85 磷酸和100mL浓盐酸充分混匀，接上回流冷凝管，以小火回流10h。回流结束后，加入150g硫酸锂和50mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15min，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色(倘若仍呈绿色，再滴加数滴液体溴，继续沸腾15min)。然后稀释至1L，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存，使用前大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol/L。水溶液中酶含量的分析测定实验操作：1标准曲线的制作（1）配制标准牛血清白蛋白溶液：在分析天平上精确称取0.0250g结晶牛血清白蛋白，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解后转入100mL容量瓶中，烧杯内的残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，则配成250g/mL的牛血清白蛋白溶液。（2）系列标准牛血清白蛋白溶液的配制：取6支普通试管，按表1加入标准浓度的牛血清白蛋白溶液和蒸馏水，配成一系列不同浓度的牛血清白蛋白溶液。然后各加试剂甲5mL，混合后在室温下放置10min，再各加0.5试剂乙，立即混合均匀（这一步速度要快，否则会使显色程度减弱）。30min后，以不含蛋白质的1号试管为对照，用722型分光光度计于650nm波长下测定各试管中溶液的光密度并记录结果。水溶液中酶含量的分析测定标准曲线的绘制：以牛血清白蛋白含量（g）为横坐标，以光密度为纵坐标绘制标准曲线。 水溶液中酶含量的分析测定样品的提取及测定（1）准确称取绿豆芽下胚轴1g，放入研钵中，加蒸馏水2mL，研磨匀浆。将匀浆转入离心管，并用 6mL蒸馏水分次将研钵中的残渣洗入离心管，离心4 000r/min、20min。将上清液转入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，作为待测液备用。（2）取普通试管2支，各加入待测溶液1mL，分别加入试剂甲5mL，混匀后放置10min，再各加试剂乙0.5mL，迅速混匀，室温放置30min，于650nm波长下测定光密度，并记录结果。水溶液中酶含量的分析测定计算出两重复样品光密度的平均值，从标准曲线中查出相对应的蛋白质含量X（g），再按下列公式计算样品中蛋白质的百分含量。样品中蛋白质含量（）=（ X（g）稀释倍数样品重（g）106 ）*100另外：进行测定时，加Folin试剂要特别小心，因为Folin试剂仅在酸性pH条件下稳定，但此实验的反应只是在pH10的情况下发生，所以当加试剂乙（Folin试剂）时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。酶含量的主要测定方法 水溶液中酶含量的分析测定用于粗略估算的紫外吸收的直接测量法蛋白质对电磁辐射的最大吸收峰在280nm处，这一特性是直接测量紫外吸收法的基础。该方法的主要优点是简便非破坏性。核酸是本方法中最常见的干扰物质，可以通过测定260nm处的吸收值加以校正（260nm处，核酸的吸收值大，而蛋白质的吸收值小）:蛋白质纯溶液的A280/A260值约为1.8，该值会随着核酸含量的增加而减小。也要注意溶液中任何游离的芳香族氨基酸在280nm处都有吸收，使蛋白质含量的测定值偏高。含有少量核酸的蛋白质溶液的最简单的校正步骤如下（要用石英制比色杯）：水溶液中酶含量的分析测定测定溶液在280nm处的吸收值（A280）:若吸收值大于1，适当稀释后重测。测定260nm处的吸收值（A260）。用关系式：蛋白质（mg/mL）=1.45 A2800.74 A260。酶含量的主要测定方法 水溶液中酶含量的分析测定主要参考文献：.董慧茹等著复杂物质剖析技术.Allan Jones,Rob Reed and Jonathan Weyers著 李玲等译生物学实验技术.Kent K.Stewart Richard E. Ebel著上官棣华等译生物体系中的化学测量4.何锡文等著分析化学1995.23生物体相关物质的分子识别分析水溶液中酶含量的分析测定THANK YOU！ 谢谢观看水溶液中酶含量的分析测定水溶液中酶含量的分析测定