3.1 微生物的生长微生物的生长生长：生长： 细菌同化作用异化作用细菌同化作用异化作用体积、重量增加体积、重量增加 细菌的裂殖细菌的裂殖个体数量增加个体数量增加一一、细菌生长的测定方法细菌生长的测定方法（1）直接计数法（常用，不区分细菌的死活）直接计数法（常用，不区分细菌的死活）n比浊计数法比浊计数法 用分光光度计测用分光光度计测OD值（光密度值），绘制标准曲值（光密度值），绘制标准曲线，从标准曲线中查细菌含量。线，从标准曲线中查细菌含量。第三章第三章 微生物的生长与水微生物生态微生物的生长与水微生物生态n血球计数板法（显微镜）血球计数板法（显微镜）（2）间接计数法（活菌数，测定需时间长）间接计数法（活菌数，测定需时间长）n平板计数法平板计数法 细菌样品做细菌样品做10倍梯度稀释，取相应稀释度的样品倍梯度稀释，取相应稀释度的样品涂布到平板上，或与融化的固体培养基混合、摇匀，培涂布到平板上，或与融化的固体培养基混合、摇匀，培养菌落。养菌落。1ml1ml水源水水源水 1ml1ml 1ml1ml9ml无菌水无菌水 n薄膜计数法薄膜计数法 空气或引用水等细菌含量较低的样品。微孔滤空气或引用水等细菌含量较低的样品。微孔滤膜不让细菌流出。滤菌。将膜放在固体培养基表面膜不让细菌流出。滤菌。将膜放在固体培养基表面培养。计数类似平板计数法。培养。计数类似平板计数法。（3）重量法）重量法 测定细胞干重测定细胞干重 离心法，过滤法。离心法，过滤法。 105110干燥。干燥。 水处理构筑物内细菌生长量常采用该法。水处理构筑物内细菌生长量常采用该法。 做法：取一定体积的待测污泥样品，放于蒸发皿中做法：取一定体积的待测污泥样品，放于蒸发皿中干燥，然后称重。干燥，然后称重。 活性污泥法中采用的指标是混合液悬浮固体活性污泥法中采用的指标是混合液悬浮固体（MLSS），），作为表示活性污泥微生物量的相对指标。作为表示活性污泥微生物量的相对指标。 MLSS（mg/L 或或 g/m3），），MLSSMa+Me+Mi+Mii Ma: 活的微生物细胞活的微生物细胞; Me: 微生物内源代谢残留物微生物内源代谢残留物 Mi: 难生物降解有机物；难生物降解有机物；Mii:附在活性污泥上的无机物附在活性污泥上的无机物 二二、细菌的生长曲线细菌的生长曲线细菌的生长曲线：细菌的生长曲线： 将少量纯菌接种到一定量的液体培养基内，在适宜将少量纯菌接种到一定量的液体培养基内，在适宜的温度下培养，并定时取样测定活细菌的数目和重量的的温度下培养，并定时取样测定活细菌的数目和重量的变化，以活细菌个数的对数或活细菌重量为纵坐标，以变化，以活细菌个数的对数或活细菌重量为纵坐标，以培养时间为横坐标作图，所得的曲线即为细菌的生长曲培养时间为横坐标作图，所得的曲线即为细菌的生长曲线。线。 这种培养方式为间歇培养或分批培养。这种培养方式为间歇培养或分批培养。（1）以活细菌数目的对数绘制的生长曲线）以活细菌数目的对数绘制的生长曲线n适应期适应期 n对数期对数期 n稳定期稳定期 n衰亡期衰亡期n适应期（缓慢期）适应期（缓慢期） lag phase特点：特点： 初：细菌数目不增加，体积增长快。初：细菌数目不增加，体积增长快。 后：个别菌体繁殖，个数少许增加。后：个别菌体繁殖，个数少许增加。 曲线平缓。大量诱导酶的合成。曲线平缓。大量诱导酶的合成。应用：应用： 缩短此期，提高设备利用率缩短此期，提高设备利用率 用处于对数期的活性污泥接种用处于对数期的活性污泥接种n对数期对数期 log phase特点：特点： 分裂快，数目增多；分裂快，数目增多； 活菌数活菌数 总菌数；总菌数； 曲线直线上升。曲线直线上升。 此时细胞的大小、组成、生理特征等均趋于一此时细胞的大小、组成、生理特征等均趋于一致，代谢活跃，生长速率高，代时稳定。致，代谢活跃，生长速率高，代时稳定。应用：应用： 接种用的好种子接种用的好种子 代谢、生理研究的好材料代谢、生理研究的好材料n 稳定期稳定期 stationary phase特点：特点： 储存物积累，养料消耗多。储存物积累，养料消耗多。 芽孢形成，抗生素产生。芽孢形成，抗生素产生。 繁殖速率下降，死亡速率上升。繁殖速率下降，死亡速率上升。 新增菌新增菌死亡菌。死亡菌。 曲线平坦。曲线平坦。应用：应用： 发酵产物形成的重要时期（抗生素、氨基酸发酵产物形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量。等），生产上应尽量延长此期，提高产量。n衰老期衰老期 decline phase or death phase特点：特点： 菌体死亡速度大于繁殖速度。菌体死亡速度大于繁殖速度。 死亡菌活菌数。自溶。死亡菌活菌数。自溶。 内源呼吸，曲线下降。内源呼吸，曲线下降。应用：应用： 一般不作应用一般不作应用（2）以活细菌重量变化绘制的生长曲线）以活细菌重量变化绘制的生长曲线n生长率上升阶段（对数生长阶段）生长率上升阶段（对数生长阶段） 适应期、对数期适应期、对数期 初：菌体个数不增加，菌体体积增大初：菌体个数不增加，菌体体积增大 后：生长率达最高，分解速率最大。后：生长率达最高，分解速率最大。 食料：供食料：供 求求n生长率下降阶段生长率下降阶段 稳定期稳定期 细菌代谢产物大量积累；细菌代谢产物大量积累； 环境不利于细菌生长；环境不利于细菌生长； 食料：供食料：供 求；求； 食料的不足抑制了细菌的生长。食料的不足抑制了细菌的生长。n内源呼吸阶段内源呼吸阶段 衰亡期衰亡期 内源呼吸：用菌体内的储存物、酶作为营养源。内源呼吸：用菌体内的储存物、酶作为营养源。 消耗自身。消耗自身。 细菌重量减少（内源呼吸、细菌死亡）细菌重量减少（内源呼吸、细菌死亡） 菌体出现畸形。菌体出现畸形。三三、细菌的生长曲线和废水生物处理的关系细菌的生长曲线和废水生物处理的关系（1）大多数活性污泥处理系统运行范围是：）大多数活性污泥处理系统运行范围是： 生长率下降阶段。部分在生长率上升阶段后期。生长率下降阶段。部分在生长率上升阶段后期。 （2）延时曝气及污泥消化在内源呼吸阶段。延时曝气及污泥消化在内源呼吸阶段。 生长率上升阶段：生长率上升阶段：微生物繁殖快，活力强，但是不微生物繁殖快，活力强，但是不容易凝聚沉淀。需要充足的食料供给，处理后的容易凝聚沉淀。需要充足的食料供给，处理后的 废水废水有机物浓度较高，出水水质不好。有机物浓度较高，出水水质不好。 生长率下降阶段：生长率下降阶段：积累代谢产物，如异染颗粒、肝积累代谢产物，如异染颗粒、肝糖粒等，产生粘性物质，污泥代谢活性及凝絮沉糖粒等，产生粘性物质，污泥代谢活性及凝絮沉 降性降性好。（传统活性污泥运行范围）好。（传统活性污泥运行范围） 内源呼吸阶段：特殊水处理场合。内源呼吸阶段：特殊水处理场合。四四、微生物的培养方法微生物的培养方法（1）微生物的纯培养及获得方法：微生物的纯培养及获得方法： 稀释倒平板法稀释倒平板法平皿划线分离法平皿划线分离法 （2）微生物的培养方法：微生物的培养方法： 好氧培养方法好氧培养方法 厌氧培养方法厌氧培养方法分批培养：分批培养： 是将一定量的微生物接种在一个封闭的、盛有一定是将一定量的微生物接种在一个封闭的、盛有一定量液体培养基的容器内，保持一定的温度、量液体培养基的容器内，保持一定的温度、pH 和溶解和溶解氧量，微生物在其中生长繁殖，会出现微生物数量由少氧量，微生物在其中生长繁殖，会出现微生物数量由少变多，达到高峰后又由多变少，甚至死亡的变化规律。变多，达到高峰后又由多变少，甚至死亡的变化规律。 连续培养：连续培养： 就是在一个恒定容积的流动系统中培养微生物，一就是在一个恒定容积的流动系统中培养微生物，一方面以一定速率不断地加入新的培养基，另一方面又以方面以一定速率不断地加入新的培养基，另一方面又以相同的速率流出培养物（菌体和代谢产物），以使培养相同的速率流出培养物（菌体和代谢产物），以使培养系统中的细胞数量和营养状态保持稳态。系统中的细胞数量和营养状态保持稳态。 连续培养有恒浊器和恒化器两种：连续培养有恒浊器和恒化器两种： 五五、微生物生长的影响因素微生物生长的影响因素概念：概念：n灭菌灭菌(sterilization) ：用理化方法杀死物体表面用理化方法杀死物体表面及内部所有微生物（包括芽孢）的过程。灭菌剂及内部所有微生物（包括芽孢）的过程。灭菌剂n消毒（消毒（disinfection)：用理化方法杀死病原微生物用理化方法杀死病原微生物的措施。消毒剂的措施。消毒剂 n防腐（防腐（antisepsis)：用理化方法抑制霉腐微生物用理化方法抑制霉腐微生物生长的措施生长的措施(理化因素）。防腐剂（抑菌剂）理化因素）。防腐剂（抑菌剂） n无菌操作：无菌操作：防止微生物进入物体的技术。防止微生物进入物体的技术。 n无菌：无菌：指没有活的微生物（包括芽孢）存在。指没有活的微生物（包括芽孢）存在。（1）温度温度 所有的微生物生长有三种基本温度：所有的微生物生长有三种基本温度： 最低生长温度最低生长温度 最适生长温度最适生长温度 最高生长温度最高生长温度l根据最适生长温度分类细菌（微生物）根据最适生长温度分类细菌（微生物）低温型微生物低温型微生物 psychrophiles（嗜冷微生物）（嗜冷微生物） 中温型微生物中温型微生物 mesophiles（嗜温微生物）（嗜温微生物） 高温型微生物高温型微生物 thermophiles（嗜热微生物）（嗜热微生物）低温型微生物低温型微生物 psychrophiles（-5+30）专性：环境温度不超过专性：环境温度不超过20。两极地区极端嗜冷微生物。两极地区极端嗜冷微生物。 兼性：河流、湖泊，适温兼性：河流、湖泊，适温1020。中温型微生物中温型微生物 mesophiles（5-50） 最适温范围最适温范围2530。 分布：土壤、植物、温血动物及人体中的微生物大部分布：土壤、植物、温血动物及人体中的微生物大部分属于该类型。如：大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌等。分属于该类型。如：大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌等。高温型微生物高温型微生物 thermophiles （25 80） 最适温度最适温度50 60。极端嗜热微生物最适温度。极端嗜热微生物最适温度7090（温泉、火山喷口）。（温泉、火山喷口）。 分布：堆肥、沼气、发酵池。污泥消化的高温厌氧处分布：堆肥、沼气、发酵池。污泥消化的高温厌氧处理利用该类菌。理利用该类菌。l高温灭菌、低温抑菌高温灭菌、低温抑菌p高温灭菌：高温蛋白质凝固变性，酶失活。高温灭菌：高温蛋白质凝固变性，酶失活。p干热灭菌：火焰灭菌干热灭菌：火焰灭菌、烘箱内干燥热空气灭菌、烘箱内干燥热空气灭菌p湿热灭菌：巴斯德消毒法、间歇灭菌法、高压蒸湿热灭菌：巴斯德消毒法、间歇灭菌法、高压蒸汽灭菌法汽灭菌法p低温抑菌：低温可延缓微生物的生理活动低温抑菌：低温可延缓微生物的生理活动 (故采用故采用低温保藏微生物低温保藏微生物) 。 低温下微生物为什么能生存？低温下微生物为什么能生存？ 酶在低温下仍起作用；酶在低温下仍起作用； 微生物质膜中不饱和脂肪酸含量高微生物质膜中不饱和脂肪酸含量高(低温下仍保低温下仍保持半流体状态持半流体状态) 。注：注： 温度的调整对工业废水生物处理意义重大。温度的调整对工业废水生物处理意义重大。干热灭菌干热灭菌(dry heat sterilization)火焰灭菌：火焰灭菌：常用酒精灯、接种环。常用酒精灯、接种环。 特点：彻底、迅速。特点：彻底、迅速。干燥热空气箱灭菌干燥热空气箱灭菌 用法：用法：160-170,2小时（利用热空气灭菌小时（利用热空气灭菌 ) 特点：由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态特点：由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态 下不易杀死。所以温度高、时间长。下不易杀死。所以温度高、时间长。 适用：玻璃器皿、金属器械等耐高温的固体物。适用：玻璃器皿、金属器械等耐高温的固体物。湿热灭菌湿热灭菌(moist heat sterilization) （主要讲高压蒸汽灭菌法）（主要讲高压蒸汽灭菌法） 利用水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，以达利用水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，以达到高温灭菌目的的方法。到高温灭菌目的的方法。 方法：一般方法：一般121（1kg/cm2或或15磅磅/英寸英寸2）20-30min。 适用：耐高温物品如培养基，无菌水，培养皿。适用：耐高温物品如培养基，无菌水，培养皿。 注意事项：注意事项：灭菌开始排净冷空气；灭菌终了，缓灭菌开始排净冷空气；灭菌终了，缓慢降压回零；慢降压回零； 灭菌结束，趁热取出物品。灭菌结束，趁热取出物品。巴斯德消毒法：巴斯德消毒法： 这是用于减少牛奶、酒等饮料等对热敏感的食品这是用于减少牛奶、酒等饮料等对热敏感的食品中微生物数量的方法，将食品在中微生物数量的方法，将食品在 70 下保持下保持 15min，然后迅速冷却（快速巴斯德消毒法），或在然后迅速冷却（快速巴斯德消毒法），或在 63 66 下加热下加热 30min，然后快速冷却即可饮用。饮料经巴斯德，然后快速冷却即可饮用。饮料经巴斯德消毒法消毒后其营养价值不受损害。消毒法消毒后其营养价值不受损害。湿热灭菌较干热灭菌效果好湿热灭菌较干热灭菌效果好 特点：温度低、时间短、灭菌效果好。特点：温度低、时间短、灭菌效果好。 灭菌效果好的原因：灭菌效果好的原因： 菌体内含水量越高凝固温度越低。菌体内含水量越高凝固温度越低。蒸汽冷凝会放出潜热。蒸汽冷凝会放出潜热。 饱和水蒸汽穿透力强。饱和水蒸汽穿透力强。 湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定 性，主性，主要破坏氢键结构。要破坏氢键结构。 （2）氢离子浓度氢离子浓度 （pH值）值） 微生物生活的微生物生活的pH在在4.09.0之间。之间。n细细 菌：菌：pH 7.0 -7.6 n酵母、霉菌酵母、霉菌: pH 5 -6 n放放 线线 菌菌: pH 7.6 -8配制培养基时调节好配制培养基时调节好pH，适于培养的微生物需要。，适于培养的微生物需要。 培养基中的蛋白胨、氨基酸有一定的缓冲能力。培养基中的蛋白胨、氨基酸有一定的缓冲能力。 加入缓冲物质加入缓冲物质磷酸盐、碳酸盐等。磷酸盐、碳酸盐等。（3）氧化还原电位（氧化还原电位（Eh值）值）V 氧化还原电位与氧气多少有关，成正比。氧化还原电位与氧气多少有关，成正比。 氧气含量氧气含量高，高，Eh值高；氧气含量低，值高；氧气含量低，Eh值低。值低。l好氧微生物好氧微生物 大于大于0.1V 生长。生长。 0.30.4V 最适宜最适宜 l厌氧微生物厌氧微生物 低于低于0.1V 生长生长 l兼性厌氧微生物兼性厌氧微生物 大于大于0.1V 好氧生活好氧生活 小于小于0.1V 厌氧生活厌氧生活Eh值在废水处理中的作用：值在废水处理中的作用：n氧化还原电位用来探测有毒物质和工业废水是否氧化还原电位用来探测有毒物质和工业废水是否存在存在 ；n观察生物处理构筑物的工作情况（充氧是否正常）。观察生物处理构筑物的工作情况（充氧是否正常）。活性污泥法系统：活性污泥法系统：Eh值值+200+600mv之间。之间。 污泥消化法系统：污泥消化法系统：Eh值值-100-200mv之间。之间。（4）水分）水分 微生物细胞含有大量水分。生活在水分大的环境中。微生物细胞含有大量水分。生活在水分大的环境中。 过于干燥，细菌不能生长。但细菌的芽孢和微生物的过于干燥，细菌不能生长。但细菌的芽孢和微生物的孢子耐干燥能力强，在干燥环境中可以保存几十年。孢子耐干燥能力强，在干燥环境中可以保存几十年。 用干燥保存食品，防止物品腐败。用干燥保存食品，防止物品腐败。 烘干、晒干、薰烘干、晒干、薰干。干。 水的活度水的活度 aw ：表示在一定温度（如表示在一定温度（如 25）下，某溶）下，某溶液或物质在与一定空间空气相平衡时的含水量与饱和空水液或物质在与一定空间空气相平衡时的含水量与饱和空水量的比值。它与相对湿度相对应。量的比值。它与相对湿度相对应。（5）渗透压）渗透压 细菌的细胞膜是半透性。细菌的细胞膜是半透性。 细菌体外水溶液的渗透压细菌体外水溶液的渗透压=细胞内的渗透压，正常生细胞内的渗透压，正常生活。活。 生活在高渗压液中，失水、质壁分离生活在高渗压液中，失水、质壁分离 ；生活在低渗压；生活在低渗压液中，吸水膨胀。液中，吸水膨胀。 用盐腌或蜜饯保存食品。用盐腌或蜜饯保存食品。（6）光线）光线 日光中的紫外线杀菌。日光中的紫外线杀菌。n杀菌波长范围：杀菌波长范围： 240300nm。最强作用波长。最强作用波长265266nm。 n杀菌原理：杀菌原理： 作用于相邻的胸腺嘧啶（作用于相邻的胸腺嘧啶（T），形成二聚体引起），形成二聚体引起DNA结构变形，阻碍正常的碱基配对，从而造成菌的变结构变形，阻碍正常的碱基配对，从而造成菌的变异或死亡。（光复活酶可修复，避光操作）异或死亡。（光复活酶可修复，避光操作） n应用：应用： 表面消毒或空气灭菌、浅层水的灭菌。表面消毒或空气灭菌、浅层水的灭菌。 育种的诱变剂育种的诱变剂 不能穿透玻璃。不能穿透玻璃。（7）化学药剂）化学药剂n强氧化剂强氧化剂 氧化细菌的细胞物质，正常代谢受阻，死亡。氧化细菌的细胞物质，正常代谢受阻，死亡。0.1%KMnO4，公共茶具、水果，公共茶具、水果 0.51%的漂白粉、液氯，饮水、游泳池水的的漂白粉、液氯，饮水、游泳池水的消毒。消毒。 1份生石灰份生石灰+4至至8份水制成石灰乳，粪便和排份水制成石灰乳，粪便和排泄物消毒。泄物消毒。n有机物有机物石炭酸（苯酚）石炭酸（苯酚）: 0.1%，抑菌，抑菌 1%，20min杀死菌杀死菌 35%，几分钟杀死菌，几分钟杀死菌来苏尔：来苏尔： 36%，消毒器械，消毒器械 2%，洗手，洗手酒精：酒精： 6075%，杀菌力最强，杀菌力最强 纯酒精无杀菌力。纯酒精会使细胞表面很快脱水纯酒精无杀菌力。纯酒精会使细胞表面很快脱水至硬化，阻止酒精分子继续渗入细胞。至硬化，阻止酒精分子继续渗入细胞。甲醛：甲醛：370 400g/L 的甲醛水溶液称为福尔马林。的甲醛水溶液称为福尔马林。（8）重金属）重金属 重金属汞、银、铜、铅及其化合物，能使蛋白质重金属汞、银、铜、铅及其化合物，能使蛋白质发生沉淀变性，它们与酶分子中的发生沉淀变性，它们与酶分子中的SH 结合，使酶失结合，使酶失去活性；或者与菌体蛋白结合，使之变性或沉淀，因去活性；或者与菌体蛋白结合，使之变性或沉淀，因此，可以用来杀菌和防腐。此，可以用来杀菌和防腐。 质量浓度为质量浓度为 20 5 mg/L 的二氯化汞（的二氯化汞（HgCl2）能有效地杀死大多数细菌。能有效地杀死大多数细菌。 硫酸铜对真菌和藻类的杀伤力较强，常被用来作硫酸铜对真菌和藻类的杀伤力较强，常被用来作杀藻剂。杀藻剂。 铅对微生物也有毒害的作用，将微生物接触浓度铅对微生物也有毒害的作用，将微生物接触浓度为为 1 5g/L 的铅盐溶液，几分钟内微生物就会死亡。的铅盐溶液，几分钟内微生物就会死亡。（9）染料）染料 碱性染料比酸性染料杀菌力强。碱性染料比酸性染料杀菌力强。 1%龙胆紫液用于皮肤消毒。龙胆紫液用于皮肤消毒。（10）抗生素）抗生素 许多微生物在代谢过程中产生能杀死其它微生物许多微生物在代谢过程中产生能杀死其它微生物或抑制其它微生物生长的化学物质，即抗生素。或抑制其它微生物生长的化学物质，即抗生素。抗生素抗生素有广谱和狭谱之分。氯霉素、金霉素、土霉素和四环素有广谱和狭谱之分。氯霉素、金霉素、土霉素和四环素可抑制许多不同种类的微生物，叫可抑制许多不同种类的微生物，叫广谱抗生素广谱抗生素。青霉素。青霉素只能杀死或抑制革兰氏阳性菌，多黏菌素只能杀死革兰只能杀死或抑制革兰氏阳性菌，多黏菌素只能杀死革兰氏阴性菌，叫氏阴性菌，叫狭谱抗生素狭谱抗生素。