黑龙江生物科技职业学院黑龙江生物科技职业学院 生物制药技术生物制药技术生物分离技术生物分离技术主讲人：张爱华主讲人：张爱华 实训一、实训一、L-L-胱氨酸的制备胱氨酸的制备 实验原理实验原理 2材料用具材料用具 3操作方法操作方法 4目的要求目的要求 2155注意事项注意事项 目的要求目的要求学习胱氨酸的提取分离原理和方法。 学会吸附分离技术的原理。 原理原理 胱氨酸是由两个-巯基-氨基丙氨酸组成的含硫氨基酸。胱氨酸呈六角形片状白色洁净或洁净粉末，无味，微溶于水，不溶于乙醇及其他有机溶剂，易溶于稀酸和碱液中。在热碱液中易分解。胱氨酸的等电点（pI）为4.6，熔点为260261。胱氨酸比半胱氨酸稳定，在体内转变成半胱氨酸后参与蛋白质合成和各种代谢过程，又促进毛发生长和防止皮肤老化等作用。胱氨酸存在于人发、猪毛、羊毛、马茂、羽毛及动物角等的蛋白质中，其中人发含量最高，达17.6%。胱氨酸是氨基酸中最难溶于水的一种，因此可利用这种特性，通过酸水解，从废杂猪毛、人发、鸡毛、羊毛等角蛋白中，分离提取胱氨酸。 材料用具材料用具 废杂毛。（人发或猪毛）废杂毛。（人发或猪毛） 盐酸、氢氧化钠、乙酸、乙酸钠、氨水、硫酸铜、硝酸、盐酸、氢氧化钠、乙酸、乙酸钠、氨水、硫酸铜、硝酸、硝酸银、硫化氢、硫氰酸铵、亚硫酸钠、碘化钾、活性硝酸银、硫化氢、硫氰酸铵、亚硫酸钠、碘化钾、活性炭、骨炭粉、硫酸甲醛溶液、溴液。炭、骨炭粉、硫酸甲醛溶液、溴液。 玻璃钢水解罐、耐酸锅、搪瓷缸、不锈钢桶、搪瓷桶、玻璃钢水解罐、耐酸锅、搪瓷缸、不锈钢桶、搪瓷桶、离心机、玻璃布、白纱布、温度计、酸度剂、布氏漏斗、离心机、玻璃布、白纱布、温度计、酸度剂、布氏漏斗、3号垂熔漏斗、号垂熔漏斗、2号砂心漏斗、恒温水浴、碘量瓶、滴管、号砂心漏斗、恒温水浴、碘量瓶、滴管、试管、移液管、量筒、烧杯、试管、移液管、量筒、烧杯、pH试纸、酸度剂。试纸、酸度剂。 清清洗洗 用用6060左右的热水，加少量洗涤剂，左右的热水，加少量洗涤剂，搅拌洗涤搅拌洗涤4 46min6min，洗去吸附在毛发，洗去吸附在毛发上的油脂，然后捞出，再用清水冲洗上的油脂，然后捞出，再用清水冲洗干净，滤干，放在通风处晒干或烘干干净，滤干，放在通风处晒干或烘干备用。备用。 水水解解 按毛发的量，量取按毛发的量，量取2 2倍倍30%30%工业盐酸，加入到玻工业盐酸，加入到玻璃钢或搪瓷水解罐中，通蒸汽加热到璃钢或搪瓷水解罐中，通蒸汽加热到70708080，立即投入清洗晒干的毛发，继续加热，间歇，立即投入清洗晒干的毛发，继续加热，间歇搅拌，使温度均匀，升温到搅拌，使温度均匀，升温到100100开始记温，每开始记温，每隔隔0.5h0.5h记温一次，在记温一次，在1 11.5h1.5h内升温至内升温至110110左左右（即罐温），以后继续维持罐压右（即罐温），以后继续维持罐压14.6kPa14.6kPa，水，水解解13h13h左右，水解期间要有回流装置，保证水解左右，水解期间要有回流装置，保证水解酸度，使水解完全，水解时间可从水解罐内溶酸度，使水解完全，水解时间可从水解罐内溶液温度达液温度达100100时计算。时计算。水解完全后，停止回流，立即趁热过滤，先用水解完全后，停止回流，立即趁热过滤，先用玻璃布抽滤除去大的黑腐质，然后再用双层纱玻璃布抽滤除去大的黑腐质，然后再用双层纱布抽滤，将滤液移到中和锅内，滤液用布抽滤，将滤液移到中和锅内，滤液用1 1：1010盐盐酸冲洗酸冲洗2 23 3次，准备中和。次，准备中和。 中中和和 将过滤好的滤液趁热在搅拌下加入浓度为30%40%的氢氧化钠溶液，当中和到pH达4.0时，停止加碱液，然后改用乙酸钠饱和溶液中和到pH为4.8左右，停止搅拌，静止1012h。用涤纶布过滤沉淀物，甩干或吊干，即得粗品。中和时温度应保持在50左右，而且要在0.5h内完成。 提提纯纯 称取适量的胱氨酸粗品，加入粗品量13%14%的工业盐酸，搅拌30min左右，等粗品全部溶解后，在加入糖用活性炭，加热到9098，在此温度下恒温搅拌23h，然后过滤脱色液，滤液加热到8085，在搅拌下加入30%氢氧化钠溶液，调节pH至4.8时，静置。使结晶沉淀完全。 精致精致干燥干燥称取适量胱氨酸提纯后的粗品，加入5倍量的1：12的盐酸，加热到40时，加入5%骨炭粉，升温到60，保温搅拌1h。然后用布氏漏斗过滤，滤液在经过3号垂熔漏斗过滤，滤液应无色透明将溶液移入搪瓷缸中，搅拌下加入10%氨水调节溶液pH至4.8，静置56d，即有胱氨酸精品析出，过滤出结晶，用无离子水洗至无氯离子，干燥即得成品。注意事项注意事项1.用硫酸调节用硫酸调节pH值时，应用酸度计边测边调。值时，应用酸度计边测边调。保证其准确性。保证其准确性。 2.水解终点的判定，加入水解终点的判定，加入10%氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液2mL，在滴加硫酸铜溶液几滴，摇匀后，如仍有明显在滴加硫酸铜溶液几滴，摇匀后，如仍有明显的天蓝色表明水解完全。的天蓝色表明水解完全。 思考思考 题题1胱氨酸的物化性质是什么，通常提取胱氨酸胱氨酸的物化性质是什么，通常提取胱氨酸选用什么原料选用什么原料? ? 2提取胱氨酸时应注意什么条件变化？提取胱氨酸时应注意什么条件变化？ 实训二、实训二、制备谷光甘肽制备谷光甘肽 实验原理实验原理 2材料用具材料用具 3操作方法操作方法 4目的要求目的要求 2155注意事项注意事项 目的要求目的要求了解树脂柱纯化法制备谷光甘肽的基本原理；熟悉树脂柱具体应用技术；掌握多肽类生化物质提取纯化的基本操作技术。 原原 理理 谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸构成的三肽。自然界中谷胱甘肽主要存在于酵母、谷物种子胚芽，人体和动物的心脏、肝脏、肾、肌肉、血液的红细胞和眼球中。动物组织中含量较高，而植物组织中的含量较低。正常人体内还原性谷胱甘肽（GSH）和氧化性谷胱甘肽（GSHG）的比例为100：1，还原性谷胱甘肽（GSH），分子小，是机体内重要的活性物质，它具有清除自由基、减毒、促进铁质吸收及维持红细胞膜的完整性、维持DNA的生物合成、细胞的正常生长及细胞免疫等多种生理功能。在医学上、食品行业及运动保健上具有广泛的应用。制备谷胱甘肽（GSH）的方法，国内主要为酵母菌生物合成，每克酵母菌干细胞含GSH 18mg。所采用的分离提纯GSH的方法主要有两种，铜盐法和离子交换树脂法。本次实训采用市售或经发酵法制得的干酵母为原料，经加热提取，离心除杂质，阳离子树脂交换、有机溶剂沉析等分离纯化得GSH湿品，经真空干燥后即得GSH成品。 原原 理理 材料用具材料用具 干酵母 100g ；732阳离子交换树脂（6080目） 5molL 30mL 、1molL 3000mL的硫酸溶液，2molL、1molL盐酸溶液、丙酮 、硅藻土、2molL氢氧化钠、2偏磷酸溶液、5碘化钾溶液、淀粉指示剂、0.001 molL的碘酸钾溶液。低温冰柜、冷冻离心机、不锈钢锅、搪瓷桶、冷冻干燥机、温度计、酸度计、层析柱、布氏漏斗、电瓷炉。提提取取 将干酵母置于不锈钢锅中，在搅拌的条件下加入3倍体积的蒸馏水，再加入6倍体积沸腾的蒸馏水，升温至90100，保持10 min，然后速冷至210。 粗粗提提液液 用5molL硫酸调节pH值至2.83.0，冷冻离心（3000 rmin, 510） 15 min，收集离心液。在离心液中加0.5硅藻土助滤，抽滤得到黄色抽提液待用。 粗粗提提液液层层析析 抽提液上732阳离子交换树脂柱，流速6 mLmin，然后用1 molL硫酸洗脱，洗脱流速2 mLmin,25 min左右开始收集5mL流出液,进行快速含量测定,当流出液滴定值超过0.2 mLmL时，开始收集，滴定值低于0.2 mLmL时停止洗脱。 粗粗提提液液层层析析 （1）732阳离子交换树脂装柱 将市售732阳离子交换树脂磨碎，筛选出6080目。物理方法处理后，先以4倍树脂体积的2molL盐酸搅拌浸泡2h，反复用水洗至近中性后，再用4倍体积的2molL氢氧化钠溶液搅拌浸泡2h，反复用水洗至近中性后，再用4倍树脂体积的2molL盐酸搅拌浸泡2h，最后水洗至中性。按要求装柱后用1 molL硫酸平衡备用。（2）GSH含量快速测定（碘量法）取5 mL待测样品，置于250 mL锥形瓶内，加入5 mL 2偏磷酸溶液，1 mL 5碘化钾溶液和2滴淀粉指示剂，用0.001 molL的碘酸钾溶液滴定至溶液由无色变为蓝色止。 计算滴定值（碘酸钾溶液待测样品，mLmL） 沉沉析析 将洗脱液倾入搪瓷桶中，在搅拌的条件下加入溶液体积10倍的冷丙酮（28），然后静置沉淀过夜，过滤收集沉淀。 干干燥燥 将沉淀置于真空干燥器中干燥，即得成品。 注意事项注意事项1.用硫酸调节用硫酸调节pH值时，应用酸度计边测边调。值时，应用酸度计边测边调。保证其准确性。保证其准确性。 2.离子交换树脂柱层析时应根据滴定值来确定离子交换树脂柱层析时应根据滴定值来确定收集洗脱液的间隔时间，随着洗脱时间的增加，收集洗脱液的间隔时间，随着洗脱时间的增加，收集洗脱液的间隔时间应逐渐缩短。收集洗脱液的间隔时间应逐渐缩短。思考思考 题题1绘制出绘制出GSH标准曲线能否快速确定滴定值标准曲线能否快速确定滴定值的大小？如何绘制出的大小？如何绘制出GSH标准曲线标准曲线? 2提取时为何加热后又要速冷？提取时为何加热后又要速冷？ 实训三、实训三、锌盐沉析法提取胰岛素锌盐沉析法提取胰岛素 实验原理实验原理 2材料用具材料用具 3操作方法操作方法 4目的要求目的要求 2155注意事项注意事项 目的要求目的要求了解胰岛素锌盐沉析法制备的基本原理。掌握多肽及蛋白质类生化物质提取纯化的基本操作技术。原理原理 胰岛素广泛存在于人和动物的胰脏中。 其等电点为5.305.35，在pH4.56.5范围内几乎不溶于水，易溶于稀酸或稀碱溶液；在80以下乙醇或丙酮中溶解；在90以上乙醇或80以上丙酮中难溶；在乙醚中不溶；在弱酸性水溶液或混悬在中性缓冲液中较为稳定。胰岛素具有蛋白质的各种特殊反应。以猪（或牛）的胰脏为原料，根据胰岛素易与锌离子结合的性质，用氯化锌作沉析剂，可使胰岛素直接从初步除去碱性和酸性杂蛋白的提取液中沉淀析出。为减少含锌量，进行两次氯化钠盐析。材料用具材料用具 冻胰脏（新鲜的牛（或猪）的胰脏在保持其腺体组织情况下用液氮或干冰速冻）氯化钠溶液、柠檬酸溶液、硫酸、氯化锌 、丙酮、硅藻土、五氧化二磷、20醋酸锌等。离心机、布氏漏斗（8cm）、抽滤瓶、分液漏斗、酸度计、搅拌机、不锈钢锅、搪瓷桶。预预处处理理将冻胰脏块用刨胰机刨碎成片，备用。将冻胰脏块用刨胰机刨碎成片，备用。 提提取取 将冻胰片100g置于不锈钢锅中，加入300m L 82乙醇（W/W），在1013加入12 molL硫酸，调节pH 2.83.0，搅拌提取40min。加入6molL盐酸调pH至2.0，继续搅拌提取2.5 h，离心（3000r/min）15 min，残渣加入65乙醇150mL，用6 molL盐酸调pH至2.0，1013搅拌提取2 h，离心（3000r/min）15 min分离残渣。合并两次提取液。碱碱化化 将提取液置于搪瓷桶中，然后冷至05，用浓氨水调pH 7.88.0，加入硅藻土（每100g胰脏加6 g），抽滤，滤液随即用混合酸（盐酸4 mL、硫酸1 mL、水4 mL）酸化至pH 2.5，待沉淀完全后虹吸清液，用尼龙布（或纱布）过滤，弃去沉淀，温度控制在03。 锌锌沉沉析析 将碱化液置于不锈钢锅中，然后在搅拌的条件下加入氯化锌溶液（每100 g胰脏加3 g氯化锌，先配成3050溶液，用6 molL盐酸调至pH 2.5后加入），温度24，待沉淀完全后，虹吸上清液，用尼龙布（或纱布）过滤除去沉淀，清液用液氨水调pH至6.87.0，于5过夜。 脱脱脂脂 虹吸除去清液，沉淀过滤收集，溶于5倍量蒸馏水，用6 molL盐酸调pH 2.72.8，1215放置。次日放出下层清液（上层脂肪再用5倍量蒸馏水洗涤，回收下层清液，作下批锌沉淀溶解用）。 丙酮、丙酮、锌沉锌沉析析 将盐析物置于搪瓷桶中，然后在搅拌的条件下加入7倍量水、3倍量丙酮，用4 molL氨水调pH至4.5，冷至05过夜，除去沉淀（沉淀另行回收），清液用4 molL氨水调pH至6.0，加入20醋酸锌（按每100 g投料加入0.03 mL），析出白色沉淀。 结结晶晶干干燥燥 过滤收集沉淀，按下列配方结晶（按每100 g投料所得沉淀物计）：2柠檬酸0.5 mL，20醋酸锌0.0065 mL，丙酮0.16 mL，蒸馏水稀释至1 mL。结晶液冷却至05，用4 molL氨水碱化至pH 8.O，过滤除去沉淀。用10柠檬酸调至pH 6.0，搅拌结晶两天，虹吸除去清液，离心，收集结晶，用蒸馏水洗2次，丙酮洗2次，以五氧化二磷真空干燥，得成品。 注意事项注意事项1.采摘胰脏要注意保持腺体组织的完整，避免摘断。要立即深冻，15保存备用。如用液氮或干冰速冻，效果更好。在胰脏中，胰尾部分胰岛素含量较高，如单独使用可提高收率10。 2.胰岛素对高能辐射非常敏感，容易失活；紫外线能破坏胱氨酸和酪氨酸基团。光氧化作用能导致分子中组氨酸被破坏。超声波能引起其非专一性降解。 3.还原剂如硫化氢、甲酸、醛、醋酐、硫代硫酸钠、维生素c及多数重金属（除锌、铬、钴、镍、银、金外）都能使胰岛素失活。 思考思考 题题1 1为何在胰岛素的制备中溶液的为何在胰岛素的制备中溶液的pHpH值不能超过值不能超过8.08.0 ? ? 2 2碱化过滤时为何加硅藻土？碱化过滤时为何加硅藻土？ 实训四实训四 DNA制备制备实验原理实验原理 2材料用具材料用具 3操作方法操作方法 4目的要求目的要求 2155注意事项注意事项 目的要求目的要求了解密度梯度离心分离原理，了解了解密度梯度离心分离原理，了解DNADNA粗提方法。粗提方法。掌握密度梯度离心制作过程及方法。掌握密度梯度离心制作过程及方法。原理原理 在较大的离心力作用下，不同的DNA 由于其大小、形状和密度不同，而悬浮在不同密度的位置上，从而达到分离。核酸分子中的碱基含有共轭双键，具有一定的紫外吸收特性，其最大吸收峰的波长为260nm。在波长为260nm，光程为1cm，A2601时，相当于双链DNA浓度为50g/mL，单链DNA为40g/mL。紫外分光光度法可用于测定浓度大于0.25g/mL的核酸浓度。DNA浓度计算公式：C（g/mL）40g/mL1/光程A260 稀释倍数。材料用具材料用具 新鲜的鸡肝 生理盐水（冷）、5%十二烷基磺酸钠溶液、45%乙醇、95%乙醇（冷）、乙醇（冷）、丙酮（冷）、氯化钠粉末、5%、10%、20%、30%蔗糖溶液（5%蔗糖溶液配制：称取蔗糖5g溶于100mL 蒸馏水液中，加5g活性炭，于沸水浴中加热25min，过滤取清液）离心机、灭菌离心管（10mL）、烧杯（1L）、大三角瓶、天平、量筒、匀浆机、1.0mL注射器、超速离心机、No.22针头、紫外分光光度计等。 蔗糖蔗糖密度密度梯度梯度溶液溶液的制的制备备 将5%、10%、20%、30%蔗糖溶液各10mL，按浓度依次减小的顺序逐个铺入离心管中即制成不连续阶梯密度梯度。此离心管于20-25静置2-3h，通过重力作用即成接近线性的连续密度梯度液。若用细铁丝轻敲离心管，静置时间可以缩短至0.51h。温度低时所需静置时间较长，温度高时则较短。为减少对流，静置后应将离心管置冰浴中备用。 DNA样品样品制备制备 （1）组织破碎：取一定量的新鲜的鸡肝，加4倍量生理盐水，经组织捣碎机捣碎l min，匀浆，2500r/min离心30min,沉淀用同样体积生理盐水洗涤3次，每次洗涤后离心，将沉淀物悬浮于20倍量的冷生理盐水中，再捣碎3min。（2）除杂蛋白：上述组织液中加入2倍量5的十二烷基磺酸钠，用45乙醇作溶剂，搅拌2030min,在0，2500r/min离心，收集上清液并加入等体积的冷95乙醇，离心即可得到纤维状DNA。 DNA样品样品制备制备（3）精制：将粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5的十二烷基磺酸钠，用1/10体积45乙醇作溶剂，搅拌0.5h,经5000r/min离心15min，上清液中加入NaCl至终浓度1 mol/ L，再缓慢加入冷95乙醇，DNA析出。 （4）样品制备：取上述DNA溶于适量蒸馏水中，用紫外分光光度计测其含量。备用。梯梯度度离离心心 （1）在每个离心管内的梯度溶液表面，分别加入1.0mL DNA样品溶液。加样时，用注射器吸入样品，在梯度溶液表面上方0.5mm左右，沿管壁慢慢加入。不允许自由滴落，也不允许针头接触梯度液面。（2）装好样品后，小心拧紧离心管帽，装好套筒、转头，按使用程序启动超速离心机，在0以25000r/min离心分离13h。 梯度梯度溶液溶液的分的分部收部收集集 离心后，取出离心管，置于冷室中。用No.22针头将聚乙烯离心管底部正中位置穿刺，梯度溶液慢慢流出。用小试管将流出的梯度溶液分部收集，每管25滴。DNA浓度浓度测定测定 用适量双蒸水稀释收集的样品，用紫外分光光度计测定各管DNA样品的A260，根据公式计算DNA浓度。 C（g/mL）40g/mL1/光程A260 稀释倍数。注意事项注意事项1、注意操作温度。2、组织捣碎机捣碎的时间不可过长。思考思考 题题为什么所用离心管等器皿必须灭菌？为什么所用离心管等器皿必须灭菌？蔗糖密度梯度在离心中起什么作用？蔗糖密度梯度在离心中起什么作用？ 实训五、菠萝蛋白酶的制备实训五、菠萝蛋白酶的制备实验原理实验原理 2材料用具材料用具 3操作方法操作方法 4目的要求目的要求 2155注意事项注意事项 目的要求目的要求了解单宁沉析法提取菠萝蛋白酶的原理 掌握提取菠萝蛋白酶的基本操作技术 原理原理 菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白酶 ，稍溶于水，不溶于乙醇、丙酮、氯仿、乙醚，最适pH值为7，微有异臭，其酶活力能被半胱氨酸激活，而受重金属抑制 用单宁沉析法提取鲜菠萝中的菠萝蛋白酶，用乙二胺四乙酸螯合原料中重金属离子 ，抗坏血酸则可使酶活性中心保持还原状态 ，锌离子、硫代酸钠、L-半胱氨酸对酶有激活作用 材料用具材料用具 鲜菠萝（鲜菠萝（1500g1500g左右）左右） 0.50.5、0.10.1EDTA-NaEDTA-Na（二乙胺四乙酸钠）（二乙胺四乙酸钠）0.50.5乙酸锌溶液乙酸锌溶液 0.060.06、0.10.1抗坏血酸溶液抗坏血酸溶液1 1单宁（别名鞣酸）单宁（别名鞣酸） 1.51.5氯化钠溶液氯化钠溶液 0.50.5硫代硫酸钠溶液；硫代硫酸钠溶液；1 1L-L-半胱氨酸溶液。其配制方法是：半胱氨酸溶液。其配制方法是：称取称取L-L-半胱氨酸半胱氨酸0.1g0.1g，加水，加水10ml10ml，加，加1mol1molL L盐酸溶液盐酸溶液6 68 8滴使之溶解；滴使之溶解；用用6mol6molL L的氢氧化钠溶液的氢氧化钠溶液中和至中和至pH3pH34 4。 操作方法操作方法取取1000g菠萝汁菠萝汁 去刺、洗净，用压榨机压汁液去刺、洗净，用压榨机压汁液5苯苯甲甲酸酸钠钠溶溶液液10ml离心机离心机3000r/min 20 min 板框压滤机板框压滤机 澄清澄清菠萝汁菠萝汁1.榨汁除杂质榨汁除杂质操作方法操作方法2.加稳定剂加稳定剂单宁沉析单宁沉析 澄清澄清菠萝汁菠萝汁加入加入0.50.5EDTA-Na 80mlEDTA-Na 80ml0.1的抗坏血酸溶液的抗坏血酸溶液60ml 搪瓷桶搪瓷桶移入移入4下下静置静置1h 立立刻刻加加1 1单单宁宁100ml100ml 离心机离心机3000r/min 15 min 沉析物沉析物 收集收集操作方法操作方法3.洗脱洗脱 沉淀物沉淀物加加0.5乙酸锌溶液乙酸锌溶液20 ml搅拌搅拌静置静置10min加加0.06抗抗坏坏血血酸酸30ml 搅拌搅拌静置静置5min 加加1.5氯氯化化钠钠20 ml 搅拌搅拌静置静置10min加加0.5EDTA溶液溶液20ml 静静5min离心离心3500r/min 10 min取沉淀取沉淀 操作方法操作方法4.激活激活 沉淀物沉淀物加加0.5硫代硫酸钠硫代硫酸钠20 ml搅拌搅拌静置静置10min1L-半半胱胱氨氨酸酸10ml 搅拌搅拌静置静置5min 离心离心3500r/min 10 min菠萝菠萝蛋白蛋白酶沉酶沉淀淀操作方法操作方法5.冷冻干燥冷冻干燥 解冻解冻 离心离心3000r/min 10 min菠萝菠萝蛋白蛋白酶沉酶沉淀淀-15冷冻冷冻1015h 氯化钙氯化钙 五氧化二磷五氧化二磷干燥干燥510h 研磨研磨成粉成粉210 保存保存 注意事项注意事项1.1.选取选取7080成熟的新鲜菠萝成熟的新鲜菠萝 2.2.避免热、酸、碱、重金属盐、紫外线的影响避免热、酸、碱、重金属盐、紫外线的影响 4.4.常用常用pH试纸检测试纸检测pH值的变化值的变化 3.3.整个操作中注意温度的变化整个操作中注意温度的变化思考思考 题题1洗脱时如果不加入氯化钠溶液应如何继续洗脱时如果不加入氯化钠溶液应如何继续分离纯化菠萝蛋白酶？分离纯化菠萝蛋白酶？ 2如何提高菠萝蛋白酶收率和酶的活力？如何提高菠萝蛋白酶收率和酶的活力？ 实训六、卵磷脂的制备及鉴定实训六、卵磷脂的制备及鉴定 实验原理实验原理 2材料用具材料用具 3操作方法操作方法 4目的要求目的要求 2155注意事项注意事项 目的要求目的要求熟悉从蛋黄中制备卵磷脂的原理熟悉从蛋黄中制备卵磷脂的原理 掌握卵磷脂的制备基本操作及鉴定技术掌握卵磷脂的制备基本操作及鉴定技术 原理原理 卵磷脂及其他脂质可溶于乙醇被抽提，用丙酮从粗卵磷脂溶液中沉淀磷脂，能使卵磷脂与其他脂质和胆固醇分离开来。可利用金属盐沉淀剂将卵磷脂从溶液中分离出来 。 用紫外分光光度计扫描其在90-400nm的吸收光谱，可测得卵磷脂的紫外最大吸收峰。卵磷脂紫外最大吸收峰在215nm波长。 材料用具材料用具 新鲜鸡蛋、卵磷脂对照品、新鲜鸡蛋、卵磷脂对照品、GF254GF254硅胶硅胶板板离心机、旋转蒸发仪、布式漏斗、抽滤瓶、离心机、旋转蒸发仪、布式漏斗、抽滤瓶、真空干燥箱、层析缸、紫外分光光度计、真空干燥箱、层析缸、紫外分光光度计、钳锅钳锅 试剂试剂 （1 1）无水乙醇、）无水乙醇、95%95%乙醇、乙醇、0.1%0.1%乙醇乙醇（2 2）10%10%氯化锌溶液；氯化锌溶液；（3 3）2%2%氯仿溶液；氯仿溶液；(4)(4)丙酮丙酮( (冰冰) )； (5)(5)甲醇；甲醇；(6)(6)碘碘操作方法操作方法2 2倍于卵黄体积的倍于卵黄体积的9595乙醇乙醇 混混合合搅搅 拌拌 离心机离心机3000r/min 15 min 沉淀物沉淀物提取提取3次次取上清液取上清液 1.粗提（一）粗提（一） 减压减压蒸馏蒸馏(45)至干至干操作方法操作方法石油醚洗下石油醚洗下 加加入入丙丙酮酮 1.粗提（二）粗提（二） 粘壁的黄粘壁的黄色油状物色油状物质质 抽滤抽滤 分离出分离出沉淀物沉淀物 40真空干真空干燥燥30min 操作方法操作方法2. .精制精制干燥的干燥的卵磷脂卵磷脂粗品粗品加相当于卵磷脂质量的加相当于卵磷脂质量的10的氯化锌水溶液的氯化锌水溶液 约约10%乙醇乙醇粗提液粗提液 加无水加无水乙醇乙醇 分离分离沉淀物沉淀物室室温温搅搅拌拌0. 5h加入冰丙酮加入冰丙酮(4)洗涤洗涤 白色蜡白色蜡状的状的精卵精卵磷脂磷脂 搅拌搅拌1h用丙酮用丙酮复研洗复研洗 操作方法操作方法3.薄层色谱分析薄层色谱分析 卵磷脂卵磷脂样品样品 卵磷脂卵磷脂对照品对照品 GF254硅胶板层析硅胶板层析 GF254硅胶板层析硅胶板层析 氯仿：甲醇：水(65：25：4)展开 氯仿：甲醇：水(65：25：4)展开 碘蒸气碘蒸气显色显色 操作方法操作方法4.紫外吸收光谱测定紫外吸收光谱测定 卵磷脂卵磷脂样品样品 0.1乙醇乙醇溶液溶液 溶于无水乙醇溶于无水乙醇 紫外分光光紫外分光光度计扫描度计扫描 90-400nm的的吸收光谱吸收光谱 测得卵磷测得卵磷脂的紫外脂的紫外最大吸收最大吸收峰峰 注意事项注意事项1.1.碘蒸气显色时，应保证层析干燥，碘蒸气显色时，应保证层析干燥， 碘蒸气量不可过浓碘蒸气量不可过浓 2 2. .紫外吸收光谱测定时样品与紫外吸收光谱测定时样品与 对照品溶液浓度应相同对照品溶液浓度应相同 思考思考 题题1讨论影响卵磷脂得率的主要因素讨论影响卵磷脂得率的主要因素 。 2根据紫外吸收光谱分析所制备的卵磷脂的纯度根据紫外吸收光谱分析所制备的卵磷脂的纯度 。 实训七、银耳多糖的制备及鉴定实训七、银耳多糖的制备及鉴定 实验原理实验原理 2材料用具材料用具 3操作方法操作方法 4目的要求目的要求 2155注意事项注意事项 目的要求目的要求了解银耳多糖制备的基本原理 掌握糖类物质提取纯化的基本操作技术 原理原理 银耳多糖主要成分为酸性杂多糖、中性杂多糖、银耳多糖主要成分为酸性杂多糖、中性杂多糖、胞壁多糖、胞外多糖及酸性低聚糖五类，胞壁多糖、胞外多糖及酸性低聚糖五类，不含核酸、蛋白质类物质。不含核酸、蛋白质类物质。 可利用银耳子实体经水浸泡捣碎，酶浸提，可利用银耳子实体经水浸泡捣碎，酶浸提，乙醇沉析分离可制得银耳多糖粗品，乙醇沉析分离可制得银耳多糖粗品，再用再用CTAB (CTAB (溴化十六烷基三甲铵溴化十六烷基三甲铵) )络合法络合法进一步精制得银耳多糖纯品并进行多糖的鉴定进一步精制得银耳多糖纯品并进行多糖的鉴定。 材料用具材料用具 银耳子实体干品银耳子实体干品（50g50g左右）左右） 烧杯烧杯 、布氏漏斗、抽滤瓶、分液漏斗、布氏漏斗、抽滤瓶、分液漏斗、量筒、离心机、恒温水浴锅、透析袋量筒、离心机、恒温水浴锅、透析袋 、滤纸、组织捣碎机、不锈钢锅。滤纸、组织捣碎机、不锈钢锅。试剂试剂 （1 1）1 1复合酶制剂复合酶制剂( (含果胶酶、纤维素酶和中性蛋白酶食品级复合酶含果胶酶、纤维素酶和中性蛋白酶食品级复合酶) )；（2 2）2 2溴化十六烷基三甲铵（溴化十六烷基三甲铵（CTABCTAB）配制：）配制：取取2 g CTAB2 g CTAB溶于溶于100 100 mLmL蒸馏水中，摇匀备用；蒸馏水中，摇匀备用；（3 3）-萘酚配制：萘酚配制：-萘酚萘酚5g5g溶于溶于9595乙乙（4 4） 5%5%三氯乙酸三氯乙酸- -正丁醇溶液；正丁醇溶液；（5 5）2mol2molL L的氢氧化钠溶液；的氢氧化钠溶液；（6 6）0.50.5甲苯胺乙醇溶液；甲苯胺乙醇溶液； （7 7）2mol2molL L氯化钠溶液；氯化钠溶液；（8 8）2mol2molL L盐酸溶液；盐酸溶液；（9 9）活性炭；硅藻土。）活性炭；硅藻土。（1010）1 1融菌酶制剂；融菌酶制剂；（1111）无水乙醇；）无水乙醇；（1212）浓硫酸；）浓硫酸； （1313）乙醚。）乙醚。操作方法操作方法1.银耳预处理银耳预处理 20 g锈钢锅中锈钢锅中 加水加水1600 mL 2025浸泡浸泡30min 捣碎机捣碎机中捣碎中捣碎 银耳银耳浆液浆液 操作方法操作方法2molL盐酸溶液调盐酸溶液调pH至至6.3 加加入入1复复合合酶酶制制剂剂 50下下酶促反应酶促反应40min 银耳银耳浆液浆液 2.酶浸提酶浸提 80灭酶，灭酶，保温浸提保温浸提约约1.5h 80水浴水浴浓缩浓缩 操作方法操作方法等体积等体积5三氯乙酸三氯乙酸-正丁醇溶液正丁醇溶液 摇匀摇匀 离心离心（3000r/min）15 min 浓缩液浓缩液 3.多糖的沉淀（有机酸除杂）多糖的沉淀（有机酸除杂） 下层下层清液清液备用备用 吸去上层吸去上层正丁醇正丁醇中层中层变性变性蛋白蛋白 操作方法操作方法2molL的氢氧化钠溶液调的氢氧化钠溶液调pH至至7 摇匀摇匀 抽滤抽滤 3.多糖的沉淀（多糖的沉淀（脱色、透析脱色、透析 ） 下层下层清液清液备用备用 加加1活活性炭性炭80加热加热15 min脱色脱色 滤液扎袋滤液扎袋流水流水透析透析12h 80水水浴浓缩浴浓缩抽滤抽滤 操作方法操作方法加加3倍量倍量95乙醇乙醇 摇匀摇匀 3.多糖的沉淀（多糖的沉淀（乙醇沉析乙醇沉析 ） 抽滤液抽滤液离心离心（3000r/min）15min 沉淀沉淀用无水用无水乙醇洗乙醇洗2次次 乙醚乙醚洗涤洗涤1次次 50以下以下真空真空干燥干燥 操作方法操作方法4.精制（一）精制（一） 取粗取粗品品1 g 溶于溶于100 mL水中水中 搅拌搅拌静置静置2h2 CTAB 滤液滤液 离心离心除不溶物除不溶物60解离解离4 h 离心离心3000r/min15 min80热水热水洗洗 氯氯化化钠钠 2molL溶溶液液100 mL 操作方法操作方法4.精制（二）精制（二） 解离液解离液加加三三倍倍量量95乙乙醇醇 透析液透析液8080浓缩浓缩 离心离心3000r/min15 min精品精品银耳银耳多糖多糖 离心离心3000r/min15 min沉淀沉淀用无水用无水乙醇、乙醇、乙醚乙醚洗涤洗涤 上清液上清液流水流水透析透析10h 50真空真空干燥干燥 操作方法操作方法5.多糖的鉴定（一）多糖的鉴定（一） 观察硫酸层与糖溶液界面处颜色变化观察硫酸层与糖溶液界面处颜色变化 透析液透析液1 mL -萘酚溶液萘酚溶液2滴滴 颜色变化颜色变化摇匀摇匀 沿管壁沿管壁缓加缓加入浓硫入浓硫酸酸1.5 mL(勿振动勿振动)操作方法操作方法5.多糖的鉴定（二）多糖的鉴定（二） 透析透析浓缩浓缩透析透析浓缩浓缩2 mL 点于滤纸点于滤纸 0.5甲苯胺乙醇溶液染色甲苯胺乙醇溶液染色 加入加入2CTAB溶液溶液24滴滴 观察现象观察现象 注意事项注意事项1.1.酶促反应的时间、温度应控制好。酶促反应的时间、温度应控制好。 2.2.在制备全流程中应时刻注意温度，在制备全流程中应时刻注意温度， 不能超过不能超过8080 思考思考 题题1加入复合酶制剂有何作用？加入复合酶制剂有何作用？ 2CTABCTAB络合法与乙醇沉析法分离银耳多糖有何异同？络合法与乙醇沉析法分离银耳多糖有何异同？ 3为何在制备全流程中应时刻注意温度不能超过为何在制备全流程中应时刻注意温度不能超过8080？