水的细菌学检查水的细菌学检查微生物学实验微生物学实验一、实验目的一、实验目的 1掌握多管发酵法测水中大肠菌群的方法。 2了解水样细菌总数的测定方法。 3了解大肠菌群的数量与生活饮用水的 重要性。 n n生活用水的水源常被生活污水或工业废水或人与动生活用水的水源常被生活污水或工业废水或人与动物的粪便所污染，可能含有不同类型的微生物，有物的粪便所污染，可能含有不同类型的微生物，有腐生性的和病原性的。腐生性的和病原性的。n n腐生性微生物对人无害，而病原性微生物则能引起腐生性微生物对人无害，而病原性微生物则能引起传染病的发生。传染病的发生。n n必须对生活用水及其水源进行严格的细菌学检查。必须对生活用水及其水源进行严格的细菌学检查。 n n测定水样是否合乎饮用标准，通常包括下列两个项测定水样是否合乎饮用标准，通常包括下列两个项目：目： 细菌总数测定细菌总数测定 大肠菌群的测定大肠菌群的测定 n n细菌总数测定 水水中中细细菌菌总总数数可可说说明明被被有有机机物物污污染染的的程程度度。细细菌菌数数越越多多，有有机机物物质质含含量量越越大大。肠肠道道中中的的绝绝大大多多数数腐腐生生性性和和致致病病性性的的细细菌菌，可可在在营营养养丰丰富富的的牛牛肉肉膏膏蛋蛋白胨培养基上进行生长，出现肉眼可见的菌落。白胨培养基上进行生长，出现肉眼可见的菌落。 细细菌菌总总数数是是指指1 1 mlml水水样样在在牛牛肉肉膏膏蛋蛋白白胨胨琼琼脂脂培培养养基中，经基中，经3737、2424小时小时培养后，所生长的菌落数。培养后，所生长的菌落数。 我国规定我国规定1 ml1 ml自来水中的总菌数不得超过自来水中的总菌数不得超过100100个。个。 二、实验原理二、实验原理n n大肠菌群的测定 若水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原菌污染，然而肠道病原菌在水中容易死亡与变异，因此数量较少，要从中特别是自来水中分离出病原菌常较困难与费时，这样就要找到一个合适的指示菌，此指示菌要求是大量出现在粪便中的非病原菌，并且和水源病原菌相比是较易检出的。 n n若指示菌在水中不存在或数量很少，则大多数情况也保证没有病原菌。最广泛应用的指示菌是大肠菌群(coliform group)。n n大肠菌群的定义：一一群群好好氧氧和和兼兼性性厌厌氧氧、革革兰兰氏氏阴阴性性、无无芽芽孢孢的的杆杆状状细细菌菌，并并在在乳乳糖糖培培养养基基中中，经经37 2448 h培培养养能能产产酸酸产产气。气。n n根据水中大肠菌群的数目来判断水源是否被粪便所污染，并间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。 n n我国规定每升自来水中大肠菌群不超过3个；n n若只经过加氯消毒即供作生活饮用水的水源水，大肠菌群数平均每升不得超过1,000 个；n n经过净化处理及加氯消毒后供作生活饮用水的水源水，其大肠菌群数平均每升不得超过10,000 个n n检查大肠菌群的方法有多管发酵法与滤膜法两种。n n多管发酵法使用历史较久，又称水的标准分析方法，为我国大多数卫生单位与水厂所采用；n n滤膜法是一种快速的替代方法，而且结果重复性好，又能测定大体积的水样，目前国内已有很多大城市的水厂采用此法。 多管发酵法测定水中大肠菌群的原理多管发酵法测定水中大肠菌群的原理 多管发酵法包括：初发酵试验、平板分离和复发酵试验三部分。1初发酵试验初发酵试验 液体培养基含有乳糖、蛋白胨和溴甲酚紫。液体培养基含有乳糖、蛋白胨和溴甲酚紫。n n 乳乳糖糖起起选选择择性性碳碳源源的的作作用用，大大肠肠菌菌群群可可发发酵酵乳乳糖产酸（有机酸），产气（糖产酸（有机酸），产气（COCO2 2+H+H2 2）。）。n n 溴溴甲甲酚酚紫紫是是pHpH指指示示剂剂（碱碱性性条条件件：紫紫蓝蓝色色；酸酸性条件：黄色，变色点性条件：黄色，变色点pH=6.7pH=6.7）。）。将水样接种在具倒置杜汉氏小管的发酵管内，将水样接种在具倒置杜汉氏小管的发酵管内，于于3737下培养，下培养，24h24h后杜汉氏小管的顶端出现气泡，后杜汉氏小管的顶端出现气泡，表明有气体产生，培养基混浊，颜色变黄，说明水表明有气体产生，培养基混浊，颜色变黄，说明水中存在大肠菌群，视为阳性结果。中存在大肠菌群，视为阳性结果。n n如有下列情况的出现，其结果判断需谨慎如有下列情况的出现，其结果判断需谨慎（1）个别其他类型的细菌在上述条件下也可能产气，需进行下述试验（即平板分离和复发酵试验）才能进一步确证。 （2）培养24h后产酸，但未见产气者，不能立即判断为阴性结果，由于菌量少，也可能延迟至48h后才产气，应视为可疑结果，也需进行下述试验（即平板分离和复发酵试验）进一步确证，48h后仍不产气，可判断为阴性结果。 2平板分离平板分离 平板分离用培养基通常为：伊红美蓝琼脂（eosin methylene blue agar， EMB agar），复红亚硫酸钠琼脂（亦称远藤氏培养基Endos medium）。（1）伊红美蓝琼脂培养基中含有伊红与美蓝这两种苯胺类染料，它们不但可以抑制G+菌和一些难培养的G-菌，而且在低酸度时，两种染料结合形成沉淀，起着产酸指示剂的作用。大肠菌群因其强烈发酵乳糖而产生大量的混合酸，使菌体表面带上正电荷，可染上伊红染料，伊红与美蓝结合，菌体被着上深紫色，在含有两种染料呈紫色的培养基上，形成带核心、具金属光泽的菌落。 n n深紫黑色、有金属光泽。n n紫黑色、不带或略带金属光泽。n n淡紫红色、中心颜色较深。n n在伊红美蓝这种鉴别性培养基上，大肠菌群呈现特征性菌落，因此，凡是出现这种菌落可确认为是大肠菌群。n n24h和48h产酸产气的初发酵菌落均需在上述培养基中的一种，进行平板划线，分离出阳性菌落。 3复发酵试验 阳性菌落经涂片染色鉴别为G-，无芽孢者，再经过乳糖蛋白胨液体培养基进行复发酵试验，经24h培养产酸产气者，可确认为大肠菌群阳性结果。三、实验用品三、实验用品 培养基培养基：n n 单倍乳糖蛋白胨液体培养基n n 3倍浓缩乳糖蛋白胨液体培养基 n n 伊红美蓝琼脂培养基（制成平板） 四、实验操作四、实验操作 多管发酵法测定水中的大肠菌群多管发酵法测定水中的大肠菌群 1. 1. 水样采集水样采集n n自来水自来水 将将自自来来水水龙龙头头用用火火焰焰烧烧灼灼3 3 minmin灭灭菌菌，再再拧拧开开水水龙龙头头流流水水5 5 minmin，以以排排除除管管道道内内积积存存的的死死水水，随随后后用用已已灭灭菌的三角瓶接取水样，以供检测。菌的三角瓶接取水样，以供检测。n n池水、河水或湖水池水、河水或湖水将将无无菌菌的的带带玻玻塞塞的的小小口口瓶瓶浸浸入入距距水水面面101015 15 cmcm深深的的水水层层中中，瓶瓶口口朝朝上上，除除去去瓶瓶塞塞，待待水水流流入入瓶瓶中中装装满满后后，盖盖好好瓶瓶塞塞，取取出出后后立立即即进进行行检检测测，或或临临时时存存于于冰箱，但不能超过冰箱，但不能超过24 h24 h。四、实验操作四、实验操作2. 初（步）发酵试验 用细口瓶取池塘水、河水或湖水的水样（1）将1 ml 原水样直接加入10 ml 单倍乳糖培养基试管1支。（2）用蒸馏水稀释原水样成10-1 ，取1 ml 直接加入10 ml 单倍乳糖培养基试管1支。 （3）将10 ml 原水样直接加入含5 ml 3倍乳糖培养基大试管1支。（4）将100 ml 原水样直接加入含50 ml 3倍乳糖培养基三角瓶1个。五、实验结果五、实验结果n n 池水、河水或湖水阳性结果记“+”；阴性结果记“-”。n n 查表2-14得每升水样中大肠菌群数是多少？ 六、思考题六、思考题n n你所测的池塘水、河水或湖水的污秽程度如何?通过实验你对保护水源水有何看法？n n大肠菌群的定义是什么？ n n假如水中有大量的致病菌霍乱弧菌，用多管发酵技术检查大肠菌群，能否得到阴性结果？为什么？n nEMB培养基含有哪几种主要成分？在检查大肠菌群时，各起什么作用？n n经检查，水样是否合乎饮用标准？