菌株的富集与分离工业菌种的分离原则n n1. 根据发酵条件来筛选适应菌种。n n2. 菌的生长温度应尽量高。n n3. 菌对环境和设备的适应性和稳定性。n n4. 菌种的生产效率和毒性，副产物等。菌种的筛选与分离菌种的筛选与分离n n施加选择压力 （1）控制培养基成分 （2）控制培养条件 （3）抑制不需要的菌类 利用菌种的生理活性特点 根据目的菌株及其产物特点分根据目的菌株及其产物特点分 选择性分离方法选择性分离方法 随机分离方法随机分离方法 (定向筛选定向筛选选择压力选择压力) (用筛选方案用筛选方案- 检测系统进行间接分离）检测系统进行间接分离）富集液体培养富集液体培养 固体培养基条件培养固体培养基条件培养 (初筛初筛) 菌种纯化菌种纯化 复筛复筛 菌种纯化菌种纯化 初步工艺条件摸索初步工艺条件摸索 再复筛再复筛 生产性能测试生产性能测试 较优菌株较优菌株1-3株株保藏及进一步做生产试验保藏及进一步做生产试验 某些必要试验和某些必要试验和 或作为育种的出发菌株或作为育种的出发菌株 毒性试验等毒性试验等 n n菌种的纯种分离菌种的纯种分离n n（1）划线法：简单、快捷。）划线法：简单、快捷。 n n（2）稀释法：菌落单一均匀。）稀释法：菌落单一均匀。固体培养基划线接种法稀释涂抹接种法稀释涂抹接种法生产性能的测定生产性能的测定n n一般采用两步法：一般采用两步法：n n 初筛：以量为主初筛：以量为主n n 复筛：以质为主复筛：以质为主菌种选择的总趋势菌种选择的总趋势n n野生菌野生菌变异菌变异菌n n自然选育自然选育代谢控制育种代谢控制育种n n诱发基因突变诱发基因突变基因重组的定向育种基因重组的定向育种 菌株的选育菌株的选育菌种选育的理论基础菌种选育的理论基础n n微生物遗传的相对稳定和变异性。由于变异的存在，使获得新性状的菌种成为可能n n遗传变异的根本原因是基因的改变：基因突变和基因重组菌种选育的方法菌种选育的方法n n菌种选育可分为自然选育、诱变育种、杂交育种、基因工程等方法。自然选育、诱变育种是利用基因突变来获得优良菌种。杂交育种、基因工程是通过DNA重组来获得优良菌种。 菌种选育的方法菌种选育的方法n n自然选育自然选育n n概念：利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过筛除衰退型菌株，获得优良菌株的纯种选育的方法。n n可以纯化、复壮菌种，这是因为菌种在自发突变过程中，多数发生负向变异。n n为什么菌种多数倾向于发生负向变异？菌种退化和变异的原因菌种退化和变异的原因n n总的来说：内因外因总的来说：内因外因1. 1. 遗传基因型的分离遗传基因型的分离 要点：遗传物质的多样化，群体繁殖要点：遗传物质的多样化，群体繁殖2. 2. 自发突变原因：自发突变原因： 1 1）沙土管长期保藏）沙土管长期保藏 2) 2) 连续传代连续传代 3 3）新陈代谢产生的诱变物质）新陈代谢产生的诱变物质 4 4）增变基因、死亡基因的存在）增变基因、死亡基因的存在3. 3. 经诱变剂处理后的退化变异经诱变剂处理后的退化变异 进一步选育或保藏进一步选育或保藏移种生产菌种斜面生产菌种斜面制备单孢子悬浮液制备单孢子悬浮液分离出单菌落分离出单菌落斜面种子斜面种子(初筛初筛)高产菌株高产菌株沙土管菌株沙土管菌株斜面种子斜面种子摇瓶复筛摇瓶复筛高产纯化株高产纯化株生产试验生产试验n n优点：简单易行n n缺点：效率低、进展慢以微生物的自然变异作为基础的生产选种机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。诱变育种：诱变育种： 诱变育种是一种纯种选育方法。以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从变异体中找出产量高、性状优良的突变株的过程。n n物理诱变n n化学诱变n n生物诱变n n物理诱变：包括各种射线照射，超声波，激光照射，离子流，失重等等物理因素的造成的菌种遗传物质的突变n n化学诱变剂化学诱变剂n n能和DNA相互作用，改变其结构，并引起遗传变异的化学物质。n n主要有碱基类似物、吖啶类、烷化剂特点：高效、经济、但多数是强致癌物但多数是强致癌物，应注意安全。n n生物诱变剂n n噬菌体可用于抗噬菌体菌种的选育，其原理可能与诱发抗性突变有关菌种诱变育种的步骤菌种诱变育种的步骤诱变育种步骤诱变育种步骤l l出发菌株的选择出发菌株的选择l l处理菌悬液的制备处理菌悬液的制备l l诱变处理诱变处理l l中间培养中间培养l l分离和筛选分离和筛选n n出发菌株的选择出发菌株的选择n n 1. 1.选择纯种选择纯种n n 2. 2. 平均发酵单位要高，且发酵单位的波动幅度不大，平均发酵单位要高，且发酵单位的波动幅度不大，摇瓶间所测得结果的最高值和最低值之差要小。摇瓶间所测得结果的最高值和最低值之差要小。n n3.3.有良好的代谢特性有良好的代谢特性n n4.4.选择对诱变剂敏感的菌株。选择对诱变剂敏感的菌株。n n5.5.选用多个出发菌株进行诱变收效较快选用多个出发菌株进行诱变收效较快。处理菌悬液的制备处理菌悬液的制备n n为什么要将菌株制成菌悬液来进行诱变？n n诱变处理诱变处理n n诱变剂的选择诱变剂的选择 野生型菌株(遗传性不稳定):用缓和的诱变剂。 遗传性稳定的菌株:先要用强烈的不常用的诱变谱广的诱变剂处理，使其发生强烈的变异，然后再用缓和的诱变剂进行处理或多次自然分离。 要考虑诱变剂的作用机理和菌株的遗传背景、生理状态等来选择诱变剂，多种诱变剂复合使用效果好。 最适剂量：一般杀菌率90%99%较好，甚至99.9%，也有低至40-60%的n n突变菌株的筛选突变菌株的筛选： 直接摇瓶筛选法直接摇瓶筛选法 工作量大，效率低工作量大，效率低 琼脂块筛选法琼脂块筛选法 简单、快速，但不准确简单、快速，但不准确 半理性化筛选半理性化筛选 自动化筛选（筛选几千个菌落数自动化筛选（筛选几千个菌落数/ /天）天）n n理性化筛选（rational screening）是运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法，以获得能大量形成发酵产物的高产突变株。影响诱变效果的因素影响诱变效果的因素n n出发菌株的遗传特性出发菌株的遗传特性n n诱变剂诱变剂n n菌种的生理状态菌种的生理状态 n n被处理菌株诱变前的预培养和诱变后的培养条件以及被处理菌株诱变前的预培养和诱变后的培养条件以及诱变处理时的外界条件诱变处理时的外界条件例如碱基类似物、亚硝基胍等只对分裂中的例如碱基类似物、亚硝基胍等只对分裂中的DNADNA有效，有效，对静止的或休眠的孢子或细胞无效；而如紫外线、亚对静止的或休眠的孢子或细胞无效；而如紫外线、亚硝酸、烷化剂、电离辐射等能直接与硝酸、烷化剂、电离辐射等能直接与DNADNA起反应，因起反应，因此对静止的细胞也有诱变效应，但是对分裂中的细胞此对静止的细胞也有诱变效应，但是对分裂中的细胞更有效。因此，放线菌、真菌的孢子在诱变前稍加萌更有效。因此，放线菌、真菌的孢子在诱变前稍加萌发可以提高诱变率。发可以提高诱变率。n n诱变处理前后的培养条件对诱变效果有明显的影响。可有意地于培养基中添加某些物质（如核酸碱基、咖啡因、氨基酸、氯化锂、重金属离子等等）来影响细胞对DNA损伤的修复作用，使之出现更多的差错，而达到提高诱变率的目的。例如菌种在紫外线处理前，在富有核酸碱基的培养基中培养，能增加其对紫外线的敏感。紫外线诱变处理后，将孢子液分离于富有氨基酸的培养基中，则有利于菌种发生突变。诱变育种的一些问题诱变育种的一些问题n n诱变手段的复合化与多样化（诱变的饱和）n n诱变强度的控制n n正向突变与反向突变n n变异菌株的筛选现代菌种选育技术现代菌种选育技术n n转化、转导、接合n n杂交育种n n原生质体融合技术n n基因工程技术n n转化：n n受体菌直接吸收了来自供体菌（donor）的DNA片段，通过交换，把它整合到自己的基因组中，再经复制就使自己变成一个转化子。这种受体菌接受供体菌的DNA片段而获得部分新的遗传性状的现象，就称转化或转化作用n n转导n n通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA小片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导n n接合：n n供体菌（“雄”）通过其性菌毛与受体菌（“雌”）相接触，前者传递不同长度的单链DNA给后者，并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色体发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象，称为接合接合：接合：接合：接合：细菌通过性菌毛相互连接沟通，将遗传物质（主要是质粒DNA）从供体菌转移给受体菌。能通过结合方式转移的质粒称为接合性质粒，不能通过性菌毛在细菌间转移的质粒为非接合性质粒基因重基因重组甲甲甲甲生长快、产量低生长快、产量低乙生长慢、产量高生长慢、产量高生长快、产量高生长快、产量高 杂交育种重组与杂交的关系：重组：分子水平，一般在体外重组：分子水平，一般在体外重组：分子水平，一般在体外重组：分子水平，一般在体外杂交（杂交（杂交（杂交（hybridizationhybridization）：细胞水平）：细胞水平）：细胞水平）：细胞水平杂交中必然包含着重组； 重组则不限于杂交这一形式。一、常规的杂交育种一、常规的杂交育种n n(一)遗传标记杂交育种所用的亲本菌株通常要有一定的遗传标记以便于筛选。如营养缺陷型、抗药性突变型等等，遗传标记的方法通常是将两个用来杂交的野生型菌株，经过诱变得到两株不同的遗传特性菌株作为杂交的直接亲本菌株。n n(二)异核体形成 例如完全培养基混合培养法。将两个直接亲本(营养缺陷型)的孢子混合接种于液体完全培养基完全培养基中，培养l2天，挑出生长的菌丝体，将菌丝取出，置于基本培养基基本培养基平板上培养七天，长出的菌丝即为异核体。异核体是两个直接亲本菌株经过细胞间的接合而形成的，即在一条菌丝里含有两个遗传特性不同的细胞核，共同生活在均一的细胞质里，能够互补营养，因此能在基本培养基上生长。n n(三)杂合二倍体的形成杂合二倍体形成的方法是在基本培养基平板上分离异核体所产生的分生孢子，异核体的分生孢子里偶尔有两个遗传性状不同的细胞核发生了融合，这样就形成了杂合二倍核。这个杂合二倍核经过繁殖，就可以得到杂合二倍体。异核体自发形成杂合二倍体的频率较低，因此必须人为地提高形成杂合二倍体的频率。常用的方法有：提高异核体的培养温度，用紫外线照射异核体，用樟脑蒸气熏异核体菌丝等。n n杂交育种的优点： 由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，因此，不论在方向性还是自觉性方面，均比诱变育种前进了一大步。 利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象，因此，是一种重要的育种手段。原生质体融合育种原生质体融合育种n n原生质体融合育种原生质体融合育种 原生质体：动植物或微生物细胞去掉壁以后的内含物称原生质体 原生质体融合育种是基因重组育种的一种重要方法l l原生质体融合育种步骤原生质体融合育种步骤l l标记菌株的筛选和稳定性验证。标记菌株的筛选和稳定性验证。l l原生质体制备。原生质体制备。l l等量原生质体加聚乙二醇促进融合。等量原生质体加聚乙二醇促进融合。l l涂布于再生培养基，再生出菌落。涂布于再生培养基，再生出菌落。l l选选择择性性培培养养基基上上划划线线生生长长，分分离离验验证证，挑挑取取融融合合子进一步试验、保藏。子进一步试验、保藏。l l生产性能筛选。生产性能筛选。原生质体融合育种的关键标记菌种的选择标记菌种的选择获获得得标标记记菌菌种种的的方方法法是是采采用用常常规规诱诱变变育育种种，筛筛选选出出营营营营养养养养缺缺缺缺陷陷陷陷型型型型或或或或和和和和抗抗抗抗药药药药性性性性菌菌菌菌株株株株。这这里里最最重重要要的的是标记必须是标记必须稳定稳定稳定稳定。采采用用抗抗药药性性菌菌株株除除可可作作标标标标记记记记外外，在在实实验验室室中中还还可可排排除除杂杂杂杂菌菌菌菌污污污污染染染染的的的的干干干干扰扰扰扰。为为的的是是确确证证融融合合的的成成功功，可以采用多标记菌种可以采用多标记菌种。 原生质体的制备原生质体的制备主要是在原生质体的制备主要是在高渗压溶液高渗压溶液中加入细胞中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性。切活性。在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素酶等。酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素酶等。 为什么要在高渗透压溶液中？为什么要在高渗透压溶液中？为什么要在高渗透压溶液中？为什么要在高渗透压溶液中？影响原生质体制备的因素菌体的前处理 为了使酶作用的效果好一些，可将菌作一些前处理。如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。菌体的培养时间 为了使细胞易于原生质体化，一般选择增殖期的菌体。酶浓度 对于不同种属的微生物，不仅对酶的种类要求不同，就是对酶的浓度也有差异。另外，最佳酶浓度还随不同的生长期的菌体而变化。酶处理温度(2040) 破壁时的pH值渗透压稳定剂 等渗透压稳定剂在原生质体制备中，不仅起到保护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物的结合，渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有机物和KCl和NaCl等无机物。原生质体的融合原生质体的融合n nPEG40006000，30-40%n nCaCl2 0.05mol/L原生质体的再生原生质体的再生n n再生培养基： 渗透压稳定剂各种营养成分 影响再生的因素：菌种，原生质体的制备过程，培养基成分等n n融合子的选择n n原生质体的诱变基因工程育种基因工程育种n n基因工程的定义基因工程的定义：n n又称为重组DNA技术，是指按人们的科研或生产需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质（DNA片段），在体外切割，拼接形成重组DNA,然后将重组DNA与载体的遗传物质重新组合，再将其引入到没有该DNA的受体细胞中，进行复制和表达，生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，并使之稳定地遗传给下一代。n n目的基因的获得n n载体系统的构建与选择n n基因与载体的连接n n转化宿主细胞n n重组子的筛选与鉴定菌种的退化、复壮与保藏菌种的退化、复壮与保藏n n菌种的衰退菌种的衰退n n 衰退的原因：衰退的原因：n n1. 菌种保藏不当n n2. 菌种生长条件没有得到满足n n3. 菌种天生具有的变异性n n菌种的复壮：菌种的复壮：n n 1. 纯种分离n n 2. 通过寄主体进行复壮n n 3. 淘汰已衰退的个体n n菌种保藏菌种保藏n n 1.原理 保证微生物的存活，生理活性降至最低。低温、干燥、缺氧、缺营养低温、干燥、缺氧、缺营养物质 2. 方法方法n n （1）斜面保藏法 （2）沙土管保藏法 （3）菌丝速冻保藏法 （4）石蜡油封存法 （5）冷冻干燥保藏法 （6）超低温保藏法斜面菌株保藏斜面菌株保藏菌种保藏的注意事项菌种保藏的注意事项n n菌种保藏须注意如下三方面：（一）菌种在保藏前所处的状态绝大多数微生物的菌种均保藏其休眠体，如孢子或芽胞。保藏用的孢子或芽胞等要采用新鲜斜面上生长丰满的培养物。菌种斜面的培养时间和培养温度影响其保藏质量。培养时间过短，保存时容易死亡，培养时间长，生产性能衰退。一般以稍低于生长最适温度培养至孢子成熟的菌种进行保存，效果较好。n n（二）菌种保藏所用的基质斜面低温保藏所用培养基，碳源比例应少，营养成分贫乏比较好，否则易产生酸，或使代谢活动增强影响保藏时间。砂土管保藏需将砂和土充分洗净，以防其中含有过多的有机物，影响菌的代谢或经灭菌后产生一些有毒物质。冷冻干燥所用的保护剂，有不少经过加热就会分解或变质的物质，过度加热往往形成有毒物质，灭菌时应特别注意。n n（三）操作过程对细胞结构的损害冷冻干燥时，冷冻速度缓慢易导致细胞内形成较大的冰晶，对细胞结构造成机械损伤。真空干燥程度也将影响细胞结构，加入保护剂就是为了尽量减轻冷冻干燥所引起的对细胞结构的破坏。细胞结构的损伤不仅使菌种保藏的死亡率增加，而且容易导致菌种变异，造成菌种性能衰退。