第三章生物样品制备临床色谱质谱检验技术一、常用样品制备技术二、自动化样品制备主要内容临床色谱质谱检验技术三、小结与思考一、常用样品制备技术液液萃取稀释固相萃取离心过滤样品制备技术样品制备技术蛋白沉淀临床色谱质谱实验室常用样品制备技术衍生化定义是一种基于液相色谱分离的样品制备方法，依据样品基质各种组分在固定相和流动相间分配系数的不同，使目标分析物得以保留和净化，同时选择性地去除样品基质中的干扰成分。目的分离、除去干扰、净化基质和富集目标分析物（三）固相萃取（solid-phase extraction,SPE）名称：C18-n（未封端）基质：硅胶？聚合物基质？孔径：60粒径：40-75m含碳量：12%表面积：300/g键合相：碳十八烷基作用机理：反相萃取SPE结构SPE产品形式针筒形式过滤嘴形式96孔板形式在线SPE柱（三）固相萃取（三）固相萃取预处理依次用强溶剂进行活化，弱溶剂进行平衡，创造萃取柱的溶剂环境。上样弱溶剂溶解样品，使目标物保留在SPE柱上。淋洗用一定强度的溶剂淋洗，去除干扰杂质，而分析物有效的保留在柱上。洗脱选择适当的洗脱溶剂，将目标物从柱上洗脱下来。基本操作步骤（以反相萃取为例）SPE配套装置（三）固相萃取固相萃取装置（常规）96孔板正压装置96孔板负压装置萃取效萃取效率影响率影响因素因素分离分离模式模式柱柱预处理理上上样溶液溶液淋洗淋洗溶溶剂洗脱洗脱溶溶剂（三）固相萃取（三）固相萃取分离模式工作原理相互作用力键合相反相固相萃取吸附剂极性小于洗脱液极性萃取中等极性到非极性化合物非极性作用力硅胶键合C18,C8,-苯基等正相固相萃取吸附剂极性大于洗脱液极性萃取极性化合物极性作用力极性键合相，如硅胶键合NH2、CN，-Diol；极性吸附剂，如硅胶、氧化铝、硅藻土等离子交换固相萃取吸附剂是带有电荷的离子交换树脂萃取带有电荷的化合物静电引力强酸性(SCX)、弱酸性(WCX)强碱性(SAX)、弱碱性(WAX)影响萃取效率的因素SPE分离模式的选择（与液相色谱柱相似）（三）固相萃取影响萃取效率的因素柱的预处理未预处理部分预处理完全预处理C18键合硅胶的三种状态溶剂环境良好，碳链展开，增加吸附剂和目标分析物作用的表面积样品与吸附剂无相互作用，目标分析物未保留为什么？为什么？（三）固相萃取影响萃取效率的因素上样溶液为了获得良好的回收率，应注意以下问题：目标物应是游离的，不能与样品基质键合；上样溶液的离子强度、极性、pH适中生物样品稀释浓度适中（三）固相萃取影响萃取效率的因素淋洗溶剂如何确定淋洗溶剂的浓度和体积？依次增加淋洗溶剂强度，根据不同强度下分析物的洗脱曲线，确定淋洗溶剂合适的强度；用5-10倍柱床体积的淋洗溶剂，依次收集和分析淋出液，得到淋洗溶剂对分析物洗脱曲线，确定淋洗溶剂合适的体积。甲醇百分比甲醇百分比分析物分析物浓浓度度/mg/L0%5%10%15%20%25%30%35%051015202530管号管号分析物分析物浓浓度度/mg/L012345678910110510152025（三）固相萃取影响萃取效率的因素洗脱溶剂选择原则对目标分析物必须有足够的洗脱强度，以使洗脱体积较小；必须有足够的选择性，以使目标物被洗脱下来，而杂质不被洗脱。洗脱流速必须控制流速慢有利于目标化合物的洗脱，但降低样品处理通量；太快可能造成洗脱不充分；在保证回收率的前提下，流速尽可能地快。（三）固相萃取方法特点优点样品净化程度高富集倍数高样品用量少易自动化缺点操作步骤多，易损失分析物成本较高选择性和特异性有限萃取柱易堵塞固相萃取是当前净化效果较好的一种样品制备方法！（三）固相萃取-举例血浆甲氧基肾上腺素类物质的样品制备临床意义：检测嗜铬细胞瘤的存在目标分析物：甲氧基肾上腺素（Metanephrine, MN) 甲氧基去甲肾上腺素（Normetanephrine, NMN）存在形式：游离形式，硫酸酯结合的形式理化性质：极性化合物，强碱性（阳离子化合物）3-甲氧基肾上腺素（MN）甲氧基去甲肾上腺素（NMN）选择具有弱阳离子和反相双重保留的SPE柱（三）固相萃取-举例血浆甲氧基肾上腺素类物质的样品制备流程活化SPE甲醇平衡SPE磷酸铵缓冲液上样磷酸铵缓冲液稀释血浆样品淋洗依次水、甲醇、0.2%甲酸乙腈洗脱2.0%甲酸乙腈氮吹收集洗脱液复溶流动相LC-MS/MS检测低离子强度用于保留高离子强度用于洗脱液液萃取稀释固相萃取离心过滤样品制备技术样品制备技术蛋白沉淀临床色谱质谱实验室常用样品制备技术衍生化利用化学反应将生物样品中难以分析检测的目标化合物定量地转化成类似化学结构且易于分析检测的化合物，通过对衍生化产物的检测间接对目标分析物进行定性或定量分析。（四）衍生化邻苯二甲醛OPA衍生分离氨基酸的色谱图条件反应能迅速、定量地进行，反应重复性好，反应条件不苛刻，易操作；反应的选择性高，最好只与目标化合物反应；衍生产物只有一种，反应的副产物和过量的衍生化试剂应不干扰分离与检测；衍生化试剂应方便易得，通用性较好。（四）衍生化气相色谱中常用的衍生化方法（四）衍生化硅烷化衍生化法具有-OH、-COOH、-NH-的极性基团组分中，活泼氢被硅烷基取代后，生成极性低、挥发性高、热稳定性好的硅烷基化合物。R3Si-X + HRR3Si- R+ H X酯化衍生化法大多数有机酸挥发性差、热稳定性低，在进行GC/GC-MS分析之前要衍生为相应的酯。R-COOH+CH3OHR-COOCH3+H2O酰化衍生化法酰化能降低羟基、氨基、巯基的极性，改善这些化合物的色谱性能，提高挥发性，增强稳定性。ROH/RSH/RNH2 +（RCO）2OROCOR/RSCOR/RNCOR卤化衍生化法通过发生加成或取代反应在目标化合物中引入卤原子，可改善挥发性和稳定性液相色谱中常用的衍生化方法（四）衍生化紫外衍生化方法无紫外吸收的化合物分子中引入带有紫外吸收的基团荧光衍生化反应无荧光吸收的化合物分子中引入能发出荧光的生色基团电化学衍生化反应目标化合物与电化学衍生化试剂反应，生成具有电化学活性的衍生物（四）衍生化影响因素对于水“敏感”的衍生化试剂，样品和使用的溶剂要脱水，并避免水汽的干扰；试剂和耗材不含目标分析物；衍生化产物为易挥发性化合物，应采用密封的衍生化容器或低温冷冻处理，防止目标化合物的流失；衍生化反应后，及时进行色谱质谱分析，或将衍生化产物妥善存放，以防发生降解。（四）衍生化方法特点优点改善检测能力，提高检测灵敏度改善分离度，改进化合物的色谱性能改善挥发性，增强稳定性改善离子化效率，提高质谱检测灵敏度缺点需要特殊试剂操作繁琐、费时成本高遗传代谢病氨基酸和酰基肉碱测定氨基酸类正丁醇衍生化反应式为：酰基肉碱类正丁醇衍生化反应式为：（四）衍生化举例遗传代谢病尿液有机酸衍生化试剂BSTFA+TMCS(99:1) ；BSTFA：双(三甲基硅基)三氟乙酰胺； TMCS：三甲基氯硅烷 （四）衍生化举例样品制备技术比较蛋白沉淀净化能力差操作简单液液萃取净化能力好耗费劳动力固相萃取净化能力强选择性多衍生化选择性好耗时耗力净化程度复杂性成本液液萃取固相萃取二、自动化样品制备技术技术人员进行样本接收技术人员在LIS系统中领取标本，核对并按顺序生成工作清单技术人员清点标本、对样本进行编号，移取标本到处理管中技术人员对标本按顺序进行处理技术人员手动录入工作清单，并将编辑生成仪器运行列表仪器按照列表对样本进行检测技术人员对结果进行审核，生成结果列表；并对数据情况进行登记技术人员将结果列表导入LIS系统，生成结果报告；审核批准临床色谱质谱实验室检测工作流程-时间占比标本分析本分析6%标本接收本接收6%数据数据处理理27%标本本处理理61%临床色谱质谱实验室检测工作流程出错来源样品处理样品处理 30%操作者 19%色谱柱 11%污染 4%标准曲线 9%仪器 8%样品引入 6%积分 6%色谱图 7%样品制备样品制备=样品处理样品处理+操作者操作者+污染污染 大约占到大约占到50%临床色谱质谱实验室检测工作流程-手工与自动分配 小 时 分 钟 小 时 手 工 自 动 手 工前处理自动化样本接收质谱工作站自动将收到的工作清单生成运行列表，自动识别条码后，按顺序进行检测样本自动样本前处理系统自动按LIS清单生成工作列表，并按顺序、编程进行前处理；并将处理后的样本贴码技术人员将LIS系统清单导入自动前处理系统技术人员将工作列表导入LC-MSMS技术人员对结果进行审核，生成结果列表；并对数据情况进行登记技术人员将结果列表导入LIS系统，生成结果报告；审核批准技术人员进行样本接收技术人员在LIS系统中领取标本，核对并按顺序生成工作清单技术人员清点标本、对样本进行编号，移取标本到处理管中技术人员对标本按顺序进行处理技术人员手动录入工作清单，并将编辑生成仪器运行列表仪器按照列表对样本进行检测技术人员对结果进行审核，生成结果列表；并对数据情况进行登记技术人员将结果列表导入LIS系统，生成结果报告；审核批准XX XX前处理自动化 分 钟 小 时 自 动 手 动 自 动 分 钟自动化离线自动化自动化液体处理工作站自动化固相萃取在线自动化在线固相萃取涡流色谱技术自动化样品制备技术工作原理基于空气置换原理，通过通道内活塞的移动来推动空气进行吸液和放液。将单通道移液器组合起来，通过操作系统控制机械臂完成移液过程，探测液面高度，能够快速准确地完成大批量液体的连续转移、分液、稀释、混合、合并等多种液体处理工作的设备。系统组成操作平台、机械臂、移液通道、实验用品载架、辅助设备和控制器（一）离线自动化-自动化液体处理工作站（一）离线自动化-自动化液体处理工作站机械臂试剂槽操作电脑一次性吸头样品盘（一）离线自动化-自动化液体处理工作站工作原理固相萃取法系统组成操作平台、机械臂、注射泵、实验用品载架和控制器（一）离线自动化-自动化固相萃取（一）离线自动化-自动化固相萃取触摸监控系统机械臂SPE管架样品管试剂管架在线固相萃取（OnlineSPE）实现了SPE的上样、清洗和洗脱的程序化在线自动处理，分析物被洗脱至分析柱上，进行液相色谱分离，与此同时，开始另一个样品的SPE提取循环。（二）在线自动化-在线固相萃取（二）在线自动化-在线固相萃取（二）在线自动化-在线固相萃取涡流色谱技术（TurboFlow）仪器设置类似于在线固相萃取，但流动相的流速是经典液相色谱的10到100倍。大分子蛋白不进入填料的微孔中而直接洗脱，小分子则可以扩散进入微孔中保留，在柱切换后，小分子可以以经典的液相条件洗脱出来，转移到分析柱上进行下面的LC-MS分析。（二）在线自动化-涡流色谱技术（三）其他自动化制备技术（四）自动化制备技术特点复杂冗长的前处理过程变得简单快速；使用的生物样品体积较小；减少溶剂使用量，达到环境友好化的目的；防止了样品污染，提高了检测准确；防止了溶剂的挥发对环境的污染和人的毒性，溶剂的可燃性产生爆炸的危险；减少人工操作，使处理失误率明显下降；降低了手工样本前处理对人员的专业性要求三、小结与思考液液萃取稀释固相萃取离心过滤样品制备技术样品制备技术蛋白沉淀小结1衍生化自动化离线自动化自动化液体处理工作站自动化固相萃取在线自动化在线固相萃取涡流色谱技术小结2小结3-生物样品制备技术比较生物生物样品品制制备技技术优点点缺点缺点蛋白沉淀法简单、快速、经济；适于高通量分析样品被稀释，影响检出限；净化程度低，基质效应强；色谱柱寿命短，离子源易污染液液萃取法灵活性高，可自由选择萃取溶剂类型；纯化度高，选择性好，可除去大量内源性物质；具有富集作用，提高灵敏度；常温操作，简单快速，经济实用耗时费力，多为手工操作；对强极性化合物的提取回收率较低；使用大量有机溶剂，成本较高；污染环境固相萃取法样品纯化程度高；样品富集倍数高，提高灵敏度；样品用量少；易实现自动化成本较高；不同分析物需要选择不同填料的固相萃取柱，灵活性受限制，即选择性和特异性有限；萃取柱易被蛋白质等大分子堵塞衍生化法将不适合检测的化合物转化成可以检测的形态，实现分析的可能性需要特殊反应试剂；操作繁琐；反应过程易受多方面的影响，不好控制；时间和经济成本高自动化样品制备简单快速，高通量；节约试剂，保护环境，降低成本；减少人工操作误差率灵活性不够高；适用于大批量样品处理，少量样品处理成本高；仪器设备价格昂贵；自动化程度有待提高固相萃取的基本操作步骤有哪几个？影响固相萃取效率的因素？临床色谱质谱实验室常用的衍生化方法？自动化样品制备技术有哪些？思考Thanks