1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序2024/7/302024/7/301 111 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤有了目的基因，我们才有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用遗传、表达和发挥作用 载体进入受体细胞稳定载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物物的基因在另一种生物中的转化。中的转化。 才能确定目的基因是否才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。遗传和正确表达。1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序2原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构( (补充内容）补充内容）非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子不编码蛋白质。不编码蛋白质。：编码蛋白质：编码蛋白质 , ,连续不间断连续不间断编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构调控遗传信息表达调控遗传信息表达, ,上上 游有启动子，下游有终止子游有启动子，下游有终止子启动子启动子3真核细胞的基因结构（补充内容）真核细胞的基因结构（补充内容）编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用有调控作用, ,上游有启动子，下上游有启动子，下游有终止子游有终止子非编码序列：非编码序列： 包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子4原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码5 （一）、（一）、目的基因主要是指目的基因主要是指 编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因一、目的基因的获取一、目的基因的获取供体生物细胞供体生物细胞取出取出DNADNA用限制酶剪用限制酶剪去多余部分去多余部分目的基因目的基因即：将需要的基因从供体生物细胞内提取出来即：将需要的基因从供体生物细胞内提取出来目前被广泛提取使目前被广泛提取使用的目的基因有：苏用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因植物抗病基因（抗病（抗病毒、抗细菌毒、抗细菌) )、人胰岛人胰岛素基因等。也可以是素基因等。也可以是一些具有调控作用的一些具有调控作用的因子因子2024/7/302024/7/306 66( (二二) )获得目的基因的方法获得目的基因的方法l从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因l利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因l人工合成人工合成 2024/7/302024/7/307 771、从基因文库中直接获取、从基因文库中直接获取（1）基因文库）基因文库未知序列未知序列将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。这种生物的不同的基因，称为基因文库。（2）基因文库的分类基因文库的分类种种类类基因组文库：基因组文库：部分基因文库：部分基因文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因，基因，如：如：cDNA文库文库8某种生物的单链某种生物的单链mRNAmRNA单链互补单链互补DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段导入受体菌中储存导入受体菌中储存与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNADNA聚合酶聚合酶cDNAcDNA的合成流程图解的合成流程图解9基因组文库和部分基因组文库基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库文库)比较比较10依据：目的基因的有关信息。（课本）依据：目的基因的有关信息。（课本）如：根据如：根据基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的功能、基因在染色体上的位置基因的功能、基因在染色体上的位置基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA基因的表达产物蛋白质等特性。基因的表达产物蛋白质等特性。（4 4）获取目的基因的根据）获取目的基因的根据（3）构建构建基因文库的目的基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。目的基因。11 （1）概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段（2）原理：原理：DNADNA复制复制2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因一段已知目的基因的核苷酸序列，一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成以便根据这一序列合成引物。引物。（3 3）前提：前提：已知序列已知序列122024/7/302024/7/301313引物：引物：是一小段单是一小段单链链DNADNA（或（或RNARNA），），作为作为DNADNA复制的起始复制的起始点，一般所说引物，点，一般所说引物，指指DNADNA引物。引物。 何为引物？13（4）过程：过程：a a、DNADNA变性（变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火（、退火（复性复性55-6555-65）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端端延伸，合成与模板互补延伸，合成与模板互补 的的_ _。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链2024/7/302024/7/30141414（5）方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩为扩增循环的次数）增循环的次数）（6）结果：结果：指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增152024/7/302024/7/30161616 具体过程具体过程17（8）PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较碱基互补配对碱基互补配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋酶催化体外复制体外复制细胞核内细胞核内热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子19目的基因的目的基因的目的基因的目的基因的mRNAmRNA单链单链单链单链DNA DNA (cDNA(cDNA）双链双链双链双链DNADNA( (即目的基因即目的基因即目的基因即目的基因) )反转录反转录反转录反转录合成合成合成合成(1)反转录法：反转录法： 以目的基因的以目的基因的以目的基因的以目的基因的mRNAmRNAmRNAmRNA为模为模为模为模板反转录成互补的单链板反转录成互补的单链板反转录成互补的单链板反转录成互补的单链DNADNADNADNA，然后在，然后在，然后在，然后在DNADNADNADNA聚合酶的作用聚合酶的作用聚合酶的作用聚合酶的作用下合成双链下合成双链下合成双链下合成双链DNADNADNADNA，从而获得，从而获得，从而获得，从而获得所需的基因。所需的基因。所需的基因。所需的基因。蛋白质蛋白质的氨基的氨基酸序列酸序列mRNAmRNA的核苷的核苷酸序列酸序列结构基因结构基因的核苷酸的核苷酸序列序列目的目的基因基因推测推测推测推测化学化学合成合成(2)根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNA法法 ：3 3、人工合成的目的基因、人工合成的目的基因 基因较小已知序列基因较小已知序列20使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。达和发挥作用。 核心核心二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建1、目的：、目的：21（1 1）用一定的用一定的_切切割质粒，使其出现一个切割质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。（2 2）用用_切断切断目的基因，使其产生目的基因，使其产生_ _ _。 核心核心（3 3）将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处，再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建2024/7/302024/7/30222222质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒） 核心核心同一种同一种二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建2 2、过程、过程: :2024/7/302024/7/30232323 科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。懈的努力，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因抗虫基因插入载体质粒中，插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有没有表达。表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子插入启动子( (抗虫基因抗虫基因首端首端) )，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫没有抗虫能力能力。科学家。科学家又又在有启动子、抗虫基因的质粒中在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止插入终止子子( (抗虫基因末端抗虫基因末端) )，导入棉花受精卵，结果成长的植株，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了有了抗虫能力。抗虫能力。 资资 料料:2024/7/302024/7/302424问题：基因表达载体需要有什么才能表达？问题：基因表达载体需要有什么才能表达？243、基因表达载体的组成：、基因表达载体的组成：a、目的基因、目的基因b、启动子、启动子c、终止子、终止子d、标记基因、标记基因2024/7/302024/7/302525启动子：终止子：（见课本）二者都属于基因表达载体的一部分。25三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞（一）转化：（一）转化： 目的基因进入目的基因进入_内，并且在受体细内，并且在受体细胞内维持胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达（二）方法（二）方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞261 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法农杆菌转化法 农杆菌特点：农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力子叶植物没有感染能力原理：农杆菌的原理：农杆菌的Ti质粒上的质粒上的T-DNA可可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的色体的DNA上。上。27过程：过程：优点：经济有效优点：经济有效28（2）基因枪法基因枪法- -适合单子叶植物适合单子叶植物（3）花粉管通道法花粉管通道法292 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序：程序：目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 显微注射显微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物303 3、将目的基因导入微生物细胞（、将目的基因导入微生物细胞（ Ca2+法）法）原核生物特点：原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：方法： 用用Ca2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表达载表达载体与感受态细胞混合体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNA分子分子31三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞（二）方法（二）方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法Ca2+处理法处理法32四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功33（一）、检测（一）、检测1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因 ( (关键步骤关键步骤) ).首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用放射性同位素片段用放射性同位素等作标记等作标记,以此做探针以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显若显示出杂交带示出杂交带,表明染色体已插入染色体表明染色体已插入染色体DNA中中（1）方法方法: :DNADNA分子杂交分子杂交（2）过程）过程:34归纳步骤35（二）、鉴定（个体生物学水平）（二）、鉴定（个体生物学水平）2 2、检测目的基因是否转录出了、检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA3 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法: :分分 子子 杂杂 交交方法方法: :抗原抗体杂交抗原抗体杂交过程过程: 用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNA杂交杂交,若出现杂交带若出现杂交带,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNA36原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子编码区编码区： 能转录，编码蛋白质能转录，编码蛋白质非编码区：非编码区： 不编码蛋白质不编码蛋白质, ,能调控遗传信息表达能调控遗传信息表达2024/7/302024/7/30373737真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子内含子 外显子外显子 与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点编码区编码区：非编码区：非编码区：外显子：外显子： 内含子：内含子： 能编码蛋白质的序列能编码蛋白质的序列不能编码蛋白质的序列不能编码蛋白质的序列2024/7/302024/7/303838381）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （ ） A、所所有有的的限限制制酶酶只只能能识识别别一一种种特特定定的的核核苷苷酸序列酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运运载载体体必必须须具具备备的的条条件件之之一一是是：具具有有多多个限制酶切点，以便与外源基因连接个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来、基因控制的性状都能在后代表现出来C C练习练习392）不属于质粒被选为基因运载体的理由是）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能能复复制制 （ ） B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNAD D练习练习403）有关基因工程的叙述中，错误的是（）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶人工合成目的基因不用限制性内切酶A A练习练习414）有有关关基基因因工工程程的的叙叙述述正正确确的的是是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D、蛋蛋白白质质的的结结构构可可为为合合成成目目的的基基因因提提供供资料资料D D练习练习425）基基因因工工程程是是在在DNA分分子子水水平平上上进进行行设设计计施施工工的的。在在基基因因操操作作的的基基本本步步骤骤中中，不不进进行行碱碱基基互互补补配配对对的的步步骤骤是是 （ ） A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达C C练习练习432 2、下列属于获取目的基因的方法的是、下列属于获取目的基因的方法的是( )( )利用利用mRNAmRNA反转录形成反转录形成从基因组文库中提取从基因组文库中提取从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCRPCR技术技术 利用利用DNADNA转录转录 人工合成人工合成A. B. C. D.A. B. C. D.1 1、 在基因工程中，把选出的目的基在基因工程中，把选出的目的基因（共因（共10001000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是脱氧核苷酸是460460个）放入个）放入DNADNA扩增仪中扩扩增仪中扩增增4 4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（氧核苷酸的个数是（ ）个）个A. 540 B. 8100 C. 17280 D. 75602024/7/302024/7/304444443.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受体细胞在自然环境中的耐药性提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B B有利于对目的基因是否导入进行检测有利于对目的基因是否导入进行检测C C增加质粒分子的分子量增加质粒分子的分子量D D便于与外源基因连接便于与外源基因连接4.4. 有关基因工程的叙述正确的是有关基因工程的叙述正确的是A A限制酶只在获得目的基因时才用限制酶只在获得目的基因时才用B B重组质粒的形成是在细胞内完成的重组质粒的形成是在细胞内完成的C C质粒都可作为运载体质粒都可作为运载体 D D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料2024/7/302024/7/304545455.哪项不是基因表达载体的组成部分哪项不是基因表达载体的组成部分( ) A.启动子启动子 B.终止密码终止密码 C.标记基因标记基因 D.目的基因目的基因6. (2008,6. (2008,全国高考全国高考) )已知某种限制酶在一线性已知某种限制酶在一线性DNADNA分分子上有子上有3 3个酶切位点。如果该线性个酶切位点。如果该线性DNADNA分子在分子在3 3个酶个酶切位点上都被该酶切断，则会产生切位点上都被该酶切断，则会产生a a、b b、c c、d d四四种不同长度的种不同长度的DNADNA片段。现有多个上述线性片段。现有多个上述线性DNADNA分分子，若在每个子，若在每个DNADNA分子上至少有分子上至少有1 1个酶切位点被该个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶酶切后，这些线酶切断，则从理论上讲，经该酶酶切后，这些线性性DNADNA分子最多能产生长度不同的分子最多能产生长度不同的DNADNA片段种数是片段种数是A A3 B3 B4 4C.9 DC.9 D1212 a a b b c c d d2024/7/302024/7/30464646练习练习1：(2008理综山东卷理综山东卷)为扩大可耕地面积，为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所分子所用的限制性内切酶作用于图中的用的限制性内切酶作用于图中的 处，处，DNA连接酶作用于连接酶作用于 处。（填处。（填“a”或或“b”）aa47练习练习1：(2008理综山东卷理综山东卷)为扩大可耕地面积，增为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。新品系。（2）将重组）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和法有农杆菌转化法和 法。法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用利用 技术，该技术的核心是技术，该技术的核心是 和和 。（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的要用放射性同位素标记的 作探针进行作探针进行分子杂交检测，又要用分子杂交检测，又要用 方方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。基因枪法（花粉管通道法）基因枪法（花粉管通道法）植物组织培养植物组织培养脱分化和再分化脱分化和再分化耐盐基因耐盐基因一定浓度盐水浇灌一定浓度盐水浇灌48