研究蛋白质与研究蛋白质与DNA相互作用的方法相互作用的方法肖睿璟1DNA2RNA3蛋白质蛋白质4转录转录？蛋白质蛋白质？翻译翻译？调控调控DNA ?v 蛋白质与蛋白质与DNA相互关系？相互关系？5EMSA678主要内容主要内容第一部分第一部分 背景知识背景知识第二部分第二部分 凝胶电泳迁移率改变分析凝胶电泳迁移率改变分析第三部分第三部分 DNase足迹法足迹法第四部分第四部分 染色质免疫沉淀分析实验染色质免疫沉淀分析实验9第一部分第一部分 背景知识背景知识10l蛋白质和核酸之间的相互作用，在生物遗传蛋白质和核酸之间的相互作用，在生物遗传信息的传递与表达、生物功能的实现中发挥信息的传递与表达、生物功能的实现中发挥重要作用。重要作用。l在基因的转录调控和在基因的转录调控和DNA修饰等活动中，蛋修饰等活动中，蛋白质与白质与DNA的相互作用扮演了关键角色的相互作用扮演了关键角色。背景知识背景知识11l基因表达基因表达: DNA-RNA-蛋白质，是一个蛋白质，是一个十分复杂而有序的过程。十分复杂而有序的过程。背景知识背景知识12 基因表达是众多的基因表达是众多的反式因子反式因子和和顺式作顺式作用元件用元件之间相互作之间相互作用的结果。用的结果。背景知识背景知识13l基因表达的调控是细胞对外部或内部的基因表达的调控是细胞对外部或内部的刺激发生应答的方式，这涉及到基因组刺激发生应答的方式，这涉及到基因组 DNA和一系列结合蛋白的相互作用。和一系列结合蛋白的相互作用。l不同生理条件下特异性的基因转录调控不同生理条件下特异性的基因转录调控常常依赖于不同的反式作用因子与顺式常常依赖于不同的反式作用因子与顺式作用元件的特异性结合。作用元件的特异性结合。 14顺式作用元件：影响自身基因表达活性的非编顺式作用元件：影响自身基因表达活性的非编码码DNA序列。如启动子、增强子、沉默子等。序列。如启动子、增强子、沉默子等。15反式因子：能直接或间接地识别或结合在各类顺反式因子：能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录效式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录效率的蛋白质。率的蛋白质。 TFD等。等。16cDNAaDNA反式调节反式调节C顺式调节顺式调节 mRNA C蛋白质蛋白质CBA mRNA蛋白质蛋白质AA17转录激活因子和增强子结合，通过作用于转录起始复转录激活因子和增强子结合，通过作用于转录起始复合物中的某种蛋白质引起合物中的某种蛋白质引起RNA聚合酶的构向改变或化聚合酶的构向改变或化学修饰，最终导致其活性增加，从而激活转录。学修饰，最终导致其活性增加，从而激活转录。 18l基因转录水平调控离不开反式因子（转录因基因转录水平调控离不开反式因子（转录因子）与顺式作用元件的相互作用；基因表达子）与顺式作用元件的相互作用；基因表达调控的其他水平同样涉及。调控的其他水平同样涉及。l蛋白质与蛋白质与DNA的相互作用扮演了关键角色的相互作用扮演了关键角色。19背景知识背景知识l阐明真核基因表达机制的基本途径：阐明真核基因表达机制的基本途径：研究蛋白质与研究蛋白质与DNA在染色质环境下的在染色质环境下的相互作用。相互作用。 20背景知识背景知识l研究蛋白质与研究蛋白质与DNA相互作用的方法：相互作用的方法： 1、凝胶电泳迁移率改变分析（、凝胶电泳迁移率改变分析（EMSA） 2、DNase足迹法（足迹法（foot printing） 3、染色质免疫沉淀实验、染色质免疫沉淀实验 （ChIP） 2122l染色质、染色体。染色质、染色体。l原核：裸露原核：裸露DNA；真；真核：脱氧核糖核酸核：脱氧核糖核酸(DNA)：组蛋白：组蛋白=1：1组成，另有组成，另有RNA和非和非组蛋白。组蛋白。背景知识背景知识23l染色体的基本结构染色体的基本结构单位：核小体，由单位：核小体，由DNA和组蛋白和组蛋白(histone)构成。构成。背景知识背景知识24组蛋白核心主要是组蛋白核心主要是螺旋螺旋25l组蛋白密码组蛋白密码 是一种新的调节机制，其信息存是一种新的调节机制，其信息存在于组蛋白的修饰等过程中：包括组在于组蛋白的修饰等过程中：包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。核糖基化等过程。背景知识背景知识26 silenced active组蛋白修饰组蛋白修饰27l组蛋白乙酰化、甲基化修饰组蛋白乙酰化、甲基化修饰能为相关能为相关调控蛋白提供其在组蛋白上的附着位调控蛋白提供其在组蛋白上的附着位点，从而改变染色质结构和活性。点，从而改变染色质结构和活性。l组蛋白磷酸化修饰组蛋白磷酸化修饰在细胞有丝分裂和在细胞有丝分裂和凋亡过程中，能调控蛋白质复合体向凋亡过程中，能调控蛋白质复合体向染色质集结。染色质集结。组蛋白修饰组蛋白修饰28乙酰基加到组蛋白尾巴上，改造了核小体螺乙酰基加到组蛋白尾巴上，改造了核小体螺旋化结构，使旋化结构，使DNA开始转录。开始转录。 29组蛋白修饰组蛋白修饰组蛋白乙酰化能选择性地使某些染色质区域组蛋白乙酰化能选择性地使某些染色质区域的结构从紧密型变为松散型，从而开放某些的结构从紧密型变为松散型，从而开放某些基因的转录，增强其表达水平。基因的转录，增强其表达水平。 30组蛋白修饰组蛋白修饰组蛋白甲基化修饰的结果则相对复杂，组蛋白甲基化修饰的结果则相对复杂，它可以是转录增强或转录抑制。它可以是转录增强或转录抑制。 31背景知识背景知识组蛋白修饰组蛋白修饰被修饰的残基被修饰的残基调控的功能调控的功能乙酰化乙酰化赖氨酸赖氨酸转录、修复、转录、修复、复制、聚集复制、聚集甲基化甲基化赖氨酸赖氨酸转录、修复转录、修复甲基化甲基化精氨酸精氨酸转录转录磷酸化磷酸化丝氨酸、苏氨酸丝氨酸、苏氨酸转录、修复、转录、修复、聚集聚集泛素化泛素化赖氨酸赖氨酸转录、修复转录、修复ADP-糖基化糖基化谷氨酸与多聚谷氨酸与多聚ADP-核核糖的共价结合糖的共价结合转录转录表表1 1 组蛋白修饰的类型组蛋白修饰的类型32背景知识背景知识l研究蛋白质与研究蛋白质与DNA相互作用的方法：相互作用的方法： 1、凝胶电泳迁移率改变分析（、凝胶电泳迁移率改变分析（EMSA） 2、DNase足迹法（足迹法（foot printing） 3、染色质免疫沉淀实验、染色质免疫沉淀实验 （CHIP） 33第二部分第二部分 凝胶电泳迁移率改变分析凝胶电泳迁移率改变分析34原原 理理 凝胶电泳的电场作凝胶电泳的电场作用下，小分子用下，小分子DNA片段比其结合了蛋片段比其结合了蛋白质的白质的DNA片段向片段向阳极移动的速度快。阳极移动的速度快。35步步 骤骤 标记短的双链标记短的双链DNA片段，将其与蛋白质混合，片段，将其与蛋白质混合，对混合物进行凝胶电泳，再放射性自显影，就对混合物进行凝胶电泳，再放射性自显影，就可找到可找到DNA结合蛋白结合蛋白 。361、探针：、探针： 32P同位素：放射性、半衰期同位素：放射性、半衰期14天。天。 地高辛标记：灵敏度弱，信号不行。地高辛标记：灵敏度弱，信号不行。 生物素标记：配合化学发光技术，生物素标记：配合化学发光技术， 广泛应用。广泛应用。 -20保存，立即使用，不超过保存，立即使用，不超过1-2星期。星期。注注 意意372、蛋白样品：、蛋白样品： 材料：细胞材料：细胞纯度高；组织纯度高；组织杂蛋白。杂蛋白。 用专用核蛋白抽提试剂。用专用核蛋白抽提试剂。 核蛋白的浓度：核蛋白的浓度：1g/l以上。以上。 蛋白样品用量蛋白样品用量: 一般一般2-20g。注注 意意38应应 用用l最初用于研究最初用于研究DNA结合蛋白。结合蛋白。l目前已用于研究目前已用于研究RNA结合蛋白和特定结合蛋白和特定的的RNA序列的相互作用。序列的相互作用。39应应 用用 EMSA特异性好，是研究转录调特异性好，是研究转录调控蛋白和相应核苷酸序列结合的常用控蛋白和相应核苷酸序列结合的常用方法，常用来鉴定其他方法筛选出的方法，常用来鉴定其他方法筛选出的结果。结果。40EMSA结果举例结果举例1.DNA + no protein2.DNA + non-interacting protein3.DNA + interacting protein41第三部分第三部分 DNase足迹法足迹法42原原 理理l蛋白质结合在蛋白质结合在DNA片段上，保护结合部位片段上，保护结合部位不被不被DNase破坏，在电泳凝胶的放射性自显破坏，在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带。这样，蛋白质在放射性标记条带。这样，蛋白质在DNA片片段上留下了段上留下了“足迹足迹”。4344l将待测双链将待测双链DNA片段中一条单链的一片段中一条单链的一 端选择性地进行末端标记。端选择性地进行末端标记。l加入恰当浓度的加入恰当浓度的DNase 进行酶切。进行酶切。l再经变性电泳分离和放射自显影。再经变性电泳分离和放射自显影。步步 骤骤45l无蛋白结合的无蛋白结合的DNA样本：样本： 相差一个核苷酸为梯度相差一个核苷酸为梯度的的DNA条带；条带；l有蛋白结合的有蛋白结合的DNA样本：样本： DNA梯度条带在相应于梯度条带在相应于DNA结合蛋白的结合区域中结合蛋白的结合区域中断，形成一空白区域。断，形成一空白区域。结结 果果4647应应 用用lDNase足迹法不仅能找到与特异性足迹法不仅能找到与特异性DNA结合的目标蛋白，而且能告知目结合的目标蛋白，而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位。标蛋白结合在哪些碱基部位。48Dod not contain RNA pol holoenzymeDNA footprint assay49In the absence of RNA pol holoenzyme, a continuous range of sizes occursThus RNA pol holoenzyme binds to an 80-nucleotide regionNo bands in this rangeRNA pol holoenzyme is bound to this DNA region, and thus protects it from DNase IDNA footprint assay50第四部分第四部分 染色质免疫沉淀实验染色质免疫沉淀实验 ChIP51l60年代年代 甲醛作为交联试剂甲醛作为交联试剂l80年代年代 Solomon等等 创创ChIP技术技术 利用利用组蛋白抗体来研究组蛋白抗体来研究HSP70基因基因 与转录的关系与转录的关系简简 史史52l研究体内蛋白质与研究体内蛋白质与DNA相互作用的一相互作用的一种技术。种技术。l它利用抗原抗体反应的特异性，可以它利用抗原抗体反应的特异性，可以真实地反映体内蛋白因子与基因组真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。结合的状况。 原原 理理53l生理状态下生理状态下DNA与蛋白质交联。与蛋白质交联。l超声或酶处理将染色质切为小片段，利超声或酶处理将染色质切为小片段，利用抗原抗体特异性识别反应，将与目的用抗原抗体特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。片段沉淀下来。l再对再对DNA进行鉴定检测。进行鉴定检测。原原 理理5455操作步骤操作步骤56第一步：固定第一步：固定 即在活细胞状态即在活细胞状态下，用甲醛固定下，用甲醛固定蛋白质蛋白质-DNA复复合物。甲醛的交合物。甲醛的交联反应可被加入联反应可被加入的甘氨酸终止。的甘氨酸终止。57注意：注意：1、细胞状况好：、细胞状况好：75%-80%；106个个/管。管。2、甲醛终浓度为、甲醛终浓度为1%。3、交联时间：、交联时间：5分钟分钟-1个小时、个小时、 不过长不过短。不过长不过短。第一步：固定第一步：固定58第二步：染色质断裂第二步：染色质断裂 用化学（用化学（ 酶）酶） 或或者机械（者机械（ 超声波）超声波）的手段将其随机的手段将其随机切断为一定长度切断为一定长度范围内的染色质范围内的染色质小片段。小片段。59注意：注意：1、超声破碎冰上，时断时续超声程序。、超声破碎冰上，时断时续超声程序。2、探头要尽量深入管中，不触管底或侧壁。、探头要尽量深入管中，不触管底或侧壁。3、总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。、总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。4、超声处理液、超声处理液: 蛋白酶抑制剂、浑浊蛋白酶抑制剂、浑浊透明。透明。5、预实验摸索条件：、预实验摸索条件：10次次/秒、秒、3-4次。次。第二步：染色质断裂第二步：染色质断裂60第二步：染色质断裂第二步：染色质断裂图图 用琼脂糖电泳检测超声打断染色质的有效性用琼脂糖电泳检测超声打断染色质的有效性M：DNA marker；1：超声打断后的：超声打断后的DNA。61 利用目的蛋白质的特利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原异抗体通过抗原-抗体抗体反应形成反应形成DNA-蛋白质蛋白质-抗体复合体，然后沉抗体复合体，然后沉淀此复合体，特异性淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合地富集目的蛋白结合的的DNA 片段。片段。第三步：免疫沉淀第三步：免疫沉淀62注意：注意：1、Input对照：对照： 断裂后的基因组断裂后的基因组DNA。 可以验证染色质断裂的效果。可以验证染色质断裂的效果。 可以算出可以算出ChIP的效率。的效率。第三步：免疫沉淀第三步：免疫沉淀63第三步：免疫沉淀第三步：免疫沉淀图图 染色质免疫沉淀染色质免疫沉淀DNA对特定基因扩增结果电泳图对特定基因扩增结果电泳图1、对、对-Actin的产物；的产物；2、对、对PAI-1的产物的产物64注意：注意：2、抗体选择：、抗体选择： 选择的目的蛋选择的目的蛋白的抗体是白的抗体是ChIP实实验成功的关键。验成功的关键。第三步：免疫沉淀第三步：免疫沉淀65注意：注意：3、阳性与阴性对照：、阳性与阴性对照： 阳性抗体：组蛋白抗体或阳性抗体：组蛋白抗体或RNA Polymerase II 抗体等。抗体等。 阴性抗体：目的蛋白抗体宿主的阴性抗体：目的蛋白抗体宿主的IgG或血清。或血清。 ChIP结果与阳性和阴性结果比较，正确结论。结果与阳性和阴性结果比较，正确结论。第三步：免疫沉淀第三步：免疫沉淀66第三步：免疫沉淀第三步：免疫沉淀图图 染色质免疫沉淀的染色质免疫沉淀的PCRPCR分析分析3 3、4 4：加入：加入p53p53抗体。抗体。2 2、5 5：加入鼠血清做对照。：加入鼠血清做对照。M123456p53 antibodyhsp90p21InputInput_+bp20001600100075050025010067 用不含用不含DNase的的RNase和和Proteinase K，65oC保温保温6小时或小时或过夜逆转交联。过夜逆转交联。第四步：逆交联第四步：逆交联68 经经DNA纯化柱回纯化柱回收收DNA或用酚氯或用酚氯仿抽提、乙醇沉仿抽提、乙醇沉淀纯化淀纯化DNA。第五步：第五步：DNA纯化纯化69 最常用的最常用的DNA的的鉴定方法是半定量鉴定方法是半定量PCR和和Real-time PCR。第六步：第六步：DNA鉴定鉴定70注意：注意：1、目的蛋白的靶序列、目的蛋白的靶序列已知已知或高度怀疑某或高度怀疑某个基因序列，用个基因序列，用定性或定量定性或定量PCR。2、目的蛋白的靶序列、目的蛋白的靶序列未知未知或研究目的蛋或研究目的蛋白在基因组上的结合情况，用白在基因组上的结合情况，用ChIP-on-CHIP技术技术。第六步：第六步：DNA鉴定鉴定71721,000,000 promoters/ 100 ul 100% Input溶液溶液1 1No Ab 10 ul Input + 90 ul Buffer 100,000 promoters 10% Input + Ab IPed, washed,elutedReverse crosslinksQIAquick purifyElute in 50 ul Elute Buffer1,000,000 promoters /100 ul 100% Input100,000 promoters/50 ul = 2,000 promoters /ulPositive Ab ChIP sample? promoters/ulPCR (positive control)1 ul 2,000 promoters1 ul 1:10200 promoters1 ul 1:5040 promoters1 ul1 ul = 200 promoters 2%Aim for 2,000-20,000 (0.2%-2%) Efficiency of ChIP溶液溶液2 2溶液溶液3 37374图图a ChIP实验后实验后PCR检测检测PEG10基因结果基因结果举举 例例75图图b：ChIP解交联溶液做解交联溶液做western-blot图图仅在经仅在经DHT刺激，且在刺激，且在ChIP实验过程中加入实验过程中加入AR抗体的抗体的实验组显出条带，意味该组解交联后液体中含有实验组显出条带，意味该组解交联后液体中含有AR。DHT举举 例例76 ChIP为研究组蛋白修饰在基因表达为研究组蛋白修饰在基因表达中的作用，全面阐明真核基因的表达调中的作用，全面阐明真核基因的表达调控机制提供了强有力的研究工具。控机制提供了强有力的研究工具。 主要应用主要应用771、组蛋白修饰酶的抗体作为、组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记生物标记” -细胞对外在刺激作出的每一个反应几乎都细胞对外在刺激作出的每一个反应几乎都会涉及到染色质活性的改变，这一改变就是会涉及到染色质活性的改变，这一改变就是通过修饰组蛋白，变换组蛋白密码实现。通过修饰组蛋白，变换组蛋白密码实现。 -几乎每一种生物学过程都有特定的组蛋白几乎每一种生物学过程都有特定的组蛋白修饰标记，那么特定的组蛋白修饰标记就能修饰标记，那么特定的组蛋白修饰标记就能反应相应的特定生物学过程。反应相应的特定生物学过程。主要应用主要应用78 通过组蛋白修饰系列抗体特异性地识别靶蛋通过组蛋白修饰系列抗体特异性地识别靶蛋白修饰形式，就能简化对组蛋白修饰的研究。白修饰形式，就能简化对组蛋白修饰的研究。792、转录调控分析：、转录调控分析： 染色质染色质DNA的转录活性与组蛋的转录活性与组蛋 白修饰相伴。白修饰相伴。 基因表达：众多的反式因子和基因表达：众多的反式因子和 顺式作用元件之间相互作用的结果。顺式作用元件之间相互作用的结果。主要应用主要应用8081823、药物开发研究：、药物开发研究： 多种组蛋白修饰酶已成为相关多种组蛋白修饰酶已成为相关 疾病治疗的靶目标。疾病治疗的靶目标。 如组蛋白去乙酰酶（如组蛋白去乙酰酶（HDACs） 抑制剂已应用于临床治疗多种肿瘤。抑制剂已应用于临床治疗多种肿瘤。主要应用主要应用834、有丝分裂研究：、有丝分裂研究： 与组蛋白修饰相关：特异性组蛋白与组蛋白修饰相关：特异性组蛋白 修饰可在有丝分裂的不同阶段检测到，修饰可在有丝分裂的不同阶段检测到， 在细胞核分裂中发挥多种功能。在细胞核分裂中发挥多种功能。主要应用主要应用845、 DNA损失与凋亡分析损失与凋亡分析 ： -在凋亡的级联反应中，激酶（包括在凋亡的级联反应中，激酶（包括CHK1和和CHK2）主要底物之一是组蛋白衍生物主要底物之一是组蛋白衍生物H2A.X，H2A.X的磷酸化的磷酸化是凋亡早期最早标志之一。是凋亡早期最早标志之一。 -在凋亡后期，在凋亡后期，Caspase激活蛋白激酶激活蛋白激酶Mst1使组蛋白使组蛋白H2B的的14位丝氨酸磷酸化。这一修饰在染色质浓缩步骤位丝氨酸磷酸化。这一修饰在染色质浓缩步骤中可检测到，是凋亡途径良好的标记物。中可检测到，是凋亡途径良好的标记物。主要应用主要应用85扩展应用扩展应用1、ChIP-on-CHIP法：法： ChIP 与基因芯片相结合所建立的方与基因芯片相结合所建立的方法，已广泛用于特定反式因子靶基因的高法，已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选。通量筛选。86ChIP ONChip87扩展应用扩展应用2、ChIP 与体内足迹法结合法：与体内足迹法结合法： 用于寻找反式因子的体内结合位点。用于寻找反式因子的体内结合位点。88扩展应用扩展应用3、ChIP re ChIP： 用于分析两种蛋白共同结合的用于分析两种蛋白共同结合的DNA序列。在第一次序列。在第一次ChIP的基础上不解交联，而继续进行另一个目的蛋白的免疫沉淀，的基础上不解交联，而继续进行另一个目的蛋白的免疫沉淀，从而得到与两种目的蛋白都结合的从而得到与两种目的蛋白都结合的DNA序列。序列。2189扩展应用扩展应用4、RNA-ChIP： 用于研究用于研究RNA在基因在基因表达调控中的作用。原理表达调控中的作用。原理与与DNA类似，不同的是，类似，不同的是，交联逆转只用交联逆转只用Proteinase K，进行，进行RNA纯化和不含纯化和不含RNase的的DNase处理，分处理，分析时用析时用RT-PCR，芯片杂，芯片杂交用交用cDNA芯片等。芯片等。90扩展应用扩展应用5、ChIP sequence：ChIP特异性地富集特异性地富集目的蛋白结合的目的蛋白结合的DNA片段，对其进片段，对其进行纯化与文库构建；行纯化与文库构建；然后对富集得到的然后对富集得到的DNA片段进行高通片段进行高通量测序。量测序。 91比比 较较lEMSA ： 体外分析体外分析lDNase足迹法：足迹法： 体外分析体外分析lChIP： 体内分析体内分析92思思 考考l1、研究蛋白质与、研究蛋白质与DNA相互作用的方相互作用的方 法有哪些？简述各自原理并进行简法有哪些？简述各自原理并进行简 单比较。单比较。l2、简述、简述ChIP的实验步骤及应用。的实验步骤及应用。9394