基因工程期末复习基因工程期末复习第一章：基因工程1. 定义：通过基因操作来定向改变或修饰生物体或人类自身，并具有明确应用目的的活动称为基因工程。2. 基因工程研究的主要内容或步骤：基因克隆的通用策略 ：涉及的过程可用分/合成、切、连、转、选、鉴。从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或 PCR 扩增等步骤，分离出带有目的基因的 DNA 片段；在体外，将带有目的基因的外源DNA 片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组 DNA 分子；将重组 DNA 分子转移到适当的受体细胞（寄主细胞） ，并与之一起增殖；从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了细胞重组DNA 分子的受体细胞克隆；从筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用；将目的基因克隆到表达载体上， 导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达， 产生出人类所需要的物质。3.三大元件：载体、质粒、片段。第二章：分子克隆工具酶1、工具酶：限制性核酸内切酶、DNA 连接酶、DNA 聚合酶、DNA 修饰酶、核酸外切酶、单链核酸内切酶。2、限制性内切酶：是一类能够识别双链 DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核苷酸内切酶。三种（型酶、型酶、 型酶）3、甲基化酶：原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。三种（）4、回文结构：双链 DNA 中含有的二个结构相同、方向相反的序列称为反向重复序列，每条单链以任一方向阅读时都是一样的。5、同裂酶（isoschizomers)：指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶可能进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。6、同尾酶（isocaudamer） ：指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。7、影响核酸内切酶活性的因素：DNA 浓度DNA 的甲基化程度酶切消化反应的温度（大多数酶的标准反应温度37 度）DNA 的分子结构。星星活性：在极端非标准条件下， 限制酶能切割与识别序列相似的序列， 这个改变的特殊性称为星星活性（star activity)。8、4 连接酶：该酶常从4 噬菌体的受感细胞中提取，是由4 噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用的连接酶是4 连接酶。9、影响连接酶作用的因素反应温度：连接缺口的温度：37；连接粘性末端的最佳温度： 415 。4DNA 连接酶的用量：平末端 DNA 分子的连接反应中，最适 12 个单位。粘性末端DNA 片断之间的连接，酶浓度0.1 个单位。ATP 的用量 10mol1mmol/L之间。提高外源片断与载体的浓度的比值， （1020 倍） 。10、常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法。11、DNA 聚合酶：DNA 聚合酶的主要活性是催化DNA 的合成（在具备模板、引物、 dNTP等的情况下）及其相辅的活性。依赖于 DNA 的 DNA 聚合酶： DNA 聚合酶(全酶)；DNA聚合酶大片段 (klenow 片段)；耐热 DNA 聚合酶(Taq 酶)；依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶：反转录酶。12、DNA 聚合酶活性：三种酶活性5 3DNA 聚合酶活性5 335 核酸外切酶活性。13、逆转录酶：以单链RNA 为模板合成双链 DNA 的反应。5 3合成DNA，无35外切活性。第三章 分子克隆载体1、载体：将外源 DNA 或基因携带入宿主细胞(host cell)的工具。 （克隆载体、表达载体）来源：质粒载体、噬菌体载体、人工染色体载体、病毒载体。二 .质粒：染色体外的遗传因子，能自我复制，多数为双链闭环DNA，大小 1KB-200KB外源 DNA 如超过 10kb，则重组质粒的转化率和DNA 得率都非常低。三大特性：自我复制、克隆位点、筛选标记（其他如易分离纯化，具有启动子）1、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。2、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点multiple cloning sites ，MCS） 。3、有适合的标记，易于选择。表达性质粒载体： 按特殊设计构建的， 能使克隆在其中特定位点的外源真核基因的编码序列，在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体。主要包括：大肠杆菌的启动子、及操纵位点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。1.构型： SC 型共价闭合环形 DNA （ccc DNA） 、 OC 型开环 DNA （ocDNA） 、L 型线性 DNA。2.质粒 DNA 的复制类型： （拷贝数的多少） ：严谨型、松弛型质粒pBR322pUCpACYCpSC101Co1E1复制子pMB1pMB1P15ApSC101Co1E1拷贝数15-20500-70010-212-515-203.质粒的不相容性：在同一个大肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种同一复制系统的质粒。也称为质粒的不相容性。是指在没有选择压力的情况下， 两种亲源关系密切的不同质粒， 不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。质粒的不亲合性分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。4.质粒 DNA 的转移性：在天然条件下，很多天然质粒都可以通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内，这种转移依赖于质粒上的tra 基因产物。5.改造天然质粒方法：（1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择。（2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组。（3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量。（4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝。（5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件；方法就是重组。6.质粒载体必须具备的基本条件：（1）具有复制起点； （replication origin）自我增值的基本条件，一般具一个复制子。（2）具有筛选标签；理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。（3）具有若干限制酶切单一位点（MCS multiple cloning sites ） ；（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。7.质粒载体的选择记号：抗菌素抗性（氨苄青霉素抗性基因ampr、四环素抗性基因tetr、氯霉素抗性基因 Cmr、卡那霉素抗性基因 kanr 新霉素 neor 抗性基因）8.互补： lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补宿主和载体各自编码的片段和片段虽然没有酶活性， 但是当载体和宿主细胞同时表达时，产生的片段和片段发生互补，可形成具有酶活性的-半乳糖苷酶，称作互补这个互补系统用来监测质粒上有无插入序列蓝白斑筛选：pUC 质粒在 LacZ的大肠杆菌中， 在有 IPTG 诱导物和 X-gal 生色底物的平板培养中， 菌落是白色的。若在该细胞中引入 pUC 质粒，其上有 LacZ，质粒和大肠杆菌 DNA 可实现互补， 表达出-半乳糖苷酶，可降解生色底物使菌落呈蓝色（有活性、阴性克隆） 。如果在质粒的多克隆位点的某个酶切点上克隆了外源基因，则 LacZ基因受到破坏，便不能再和缺陷型受体菌中生成有活性的-半乳糖苷酶， 因此菌落呈白色 （无活性、 阳性克隆） 。9.质粒 DNA 的分离和纯化从细菌中提取质粒 DNA 的方法都包括以下三个步骤：培养细菌、收集和裂解细菌、纯化质粒 DNA三种方法：氯化铯密度梯度离心法；碱变性法；煮沸法原理：碱变性法抽提质粒是基于染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH12.6 的高碱性条件下，染色体DNA 和质粒 DNA 都发生变性，但质粒超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，所以当以pH4.8 的 KAc 高盐缓冲液调节其 pH 至中性时，变性的质粒 DNA 又恢复到原来的构型，保存在溶液中。而染色体 DNA不能复性而形成缠连的网状结构。 通过离心，染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA、蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。流程：1、取 1.5 毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀；2、加入 100 微升冰冷的悬浮液， （50mM 葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA，45mg 溶菌酶）静置 5 分钟；3、加入 200 微升微冷的裂解液（0.2NaOH，1.0%SDS）缓缓混匀置室温 5 分钟。4、加入 150 毫升冰冷的 PH=4.8 的 3M 醋酸钠，振荡后，冰浴 5 分钟。5、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒DNA。溶液：50mmol/L葡萄糖; 25mmol/L Tris-Cl(pH8.0);10mmol/LEDTA(pH 8.0) (主要作用：Solution I 中的 EDTA可以螯合二价金属离子进而抑制依赖于二价金属离子的DNA 酶的活性，对 DNA 起到保护作用。加入 solution后一定要充分打散菌体。)溶液 (pH 12.6) ：0.2mol/L NaOH ;1%SDS (现用现配) (主要作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性. Solution II要新鲜配置,NaOH 可吸收空气中的二氧化碳而减弱碱性。加入 solution II 后放置时间不要超过 5min，以免变性质粒不易复性)溶液 (pH 4.8) ：100ml5mol/LNaAc 60ml; 冰醋酸 11.5ml; 双蒸水 28.5ml (作用：中和碱液，质粒 DNA 复性，变性蛋白SDS, 线性 DNA 沉淀)三 噬菌体载体1.基本过程：吸附、注入、合成、组装、释放2.噬菌体载体（特有多极调控、9-23KB）DNA 是一条线性双链 DNA 分子，一旦进入宿主细胞，黏性末端互补配对形成双链环状 DNA 分子，这种黏性末端结合形成的双链区段称为COS 位点，随后闭合充当转录模板噬菌体载体的主要类型1. 插入式载体通过特定的酶切位点允许外源DNA 片段插入的载体。2. 替换型载体（取代型载体） ：具有成对的克隆位点，允许外源DNA 片段替换非必需 DNA片段的载体。 （广泛）3.柯斯质粒载体： 是一类人工构建的含有-DNA cos序列和质粒复制子的特殊类型载体， 也称为黏粒载体（45KB）特点：具有噬菌体特性（cos 位点） 、具有质粒载体特性、具有高容量的克隆能力四 其他载体1.酵母载体：整合型载体（YIp） 、复制型载体（YNp） 、附加体型载体（YEp）2.人工染色体载体（一种穿梭载体:能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体）酵母人工染色体（YAC） ：选择标记主要采用营养缺陷型基因，例如带有突变赭石突变抑制基因在培养基上形成红色菌落，而带有赭石突变抑制基因SUP4 则为白色细菌人工染色体（BAC）又称 F 黏粒五 表达载体1.克隆基因正确表达的基本条件：最基本条件：应该能够进行正常的转录和转译，以及在正常情况下还与转译后加工有关。重要条件：编码的蛋白质产物应能维持正常的稳定性。 具有核糖体结合位点； 具有克隆基因的功能（强）启动子； 插入序列的正确取向2.表达元件：启动子：必须是强启动子、应能呈现出一种低限的基础转录水平、启动子应是诱导型的常见原核强启动子：Plac、Ptac、PL 启动子、T7 噬菌体启动子Plac：受 Lac 阻遏蛋白负调控，受乳糖或类似物IPTG 的诱导；Ptac:Lac 启动子和 Trp 启动子的杂合启动子。受Lac 阻遏蛋白负调控，可用乳糖或类似物IPTG 的诱导，启动能力比Plac 和 Ptrp 都强；PL 启动子：噬菌体早期左向转录启动子， 受噬菌体 CI 基因负调控。温度诱导（低温 30阻遏，高温 42 诱导） 。T7 噬菌体启动子：具有高度特异性，只能由T7 噬菌体的 RNA 聚合酶识别并启动转录T7如何诱导调控的原理转录终止子转译起始序列转译增强子转译终止密码子第四章：基因操作中大分子的分离和分析一 核酸凝胶电泳（用于分离、鉴定和纯化DNA 或 RNA 片段；检测：分子量、DNA 浓度）1.基本原理：核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正电极方向迁移（ “”-“+” ）2.琼脂糖凝胶电泳：核酸片段因其分子量或分子形状不同，电泳移动速度有差异而分离DNA 迁移率的影响因素：DNA 分子的大小（反比） 、琼脂糖浓度（反比） 、DNA 构象、凝胶和电泳缓冲液中的EB、电压、琼脂糖种类、电泳缓冲液配制：最常用 1%的，称取琼脂糖 1g，加 100ml 电泳缓冲液（TAE） ，微波炉煮沸，冷却到 50 度时倒胶3、 RNA 胶的制备： 1.5g 琼脂糖加 115ml水， 加热融化。 冷却至 60时加 30ml 的 5 X MOPS电泳缓冲液 (终浓度为 1X); 加 5ml 甲醛（琼脂糖终浓度为 1%） 。制胶。二 分子杂交1.定义：具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适当的温度、离子强度等） ，按碱基互补的原则，重新形成双链核酸分子的过程2. 探针（probe） ：被标记的核酸分子，可以是DNA、RNA 和合成的寡核苷酸基本原理：碱基互补；杂合双链：DNA:RNA 、DNA:DNA；类型：液相杂交、固相杂交3.杂交的基本过程： 凝胶电泳分离变性印迹转移预杂交杂交洗膜杂交信号检测4、Southern Blot 原理：将待检测的 DNA 分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的 DNA 或 RNA 探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列， 则二者通过碱基互补的原理进行结合， 游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。DNA 琼脂糖电泳 印迹转移 预杂交杂交（变性探针） 洗膜放射自显影或显色5、Northern Blot 原理：在变性条件下将待检的RNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot 相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。mRNA 提取甲醛变性电泳印迹转移预杂交杂交（变性探针）洗膜放射自显影或化学发光6、western 杂交基本原理同 southern、northern blot 方式。但其是检测蛋白质，关键在于探针的性质：抗体（antibody）三 PCR 技术及其应用1. 定义：是体外酶促合成特异DNA 片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA 得以迅速扩增2.反应体系：10扩增缓冲液 10ul、4 种 dNTP 混合物各 200umol/L、引物各 10100pmol、模板 DNA0.12ug、TaqDNA聚合酶 2.5u、Mg2+1.5mmol/L、加双或三蒸水至 100ulTaq DNA聚合酶：水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的 DNA 聚合酶53DNA 聚合酶活性和 53外切酶活性 ；无 35外切酶活性，3.PCR 反应五要素： 参加 PCR 反应的物质主要有五种即引物、 酶、 dNTP、 模板和缓冲液 （其中需要 Mg2+)4.步骤：变性（双链DNA 通过高温变性解离成互补单链DNA ） 、退火（DNA 加热变性+引物慢慢冷却使其结合） 、延伸（适温延伸 53引物形成新链变成 4 条链 DNA）基本原理：碱基互补设计原则： （1）靠近 5上游 Primer 与双链 DNA 正链相同3下游 Primer 与双链 DNA 正链互补，与负链相同正链 5 3负链 3 5例如：IL-3正链 5GCTCCATGACCCAG-GCGA TCTTTTGAGTCCAA 3负链 3CGAGGTACTGGGTC-CGCTAGAAAACTCAGGTT 5上游引物序列：与其相同 5 GCTCCATGACCCAG 3下游引物序列：先写出相应负链35然后倒过来 53所以序列为：5-TTG GAC TCA AAA GAT CGC -35、Sanger 双脱氧终止法F. Sanger在 1977 年发明用双脱氧链终止法测定单链DNA 的序列，其基本原理如下：DNA 聚合酶能够用单链 DNA 作为模板，合成准确的DNA 互补链；该酶能够用 2， 3-双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3-末端， 从而终止其延伸反应。在 DNA 测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物） ，DNA 聚合酶，dA，dT，dG，dC 和一种 ddNTP。常用 Klenow 大片段，无 53外切酶活性。基本原理：DNA 的半保留复制测序步骤用 M13 噬菌体做载体获得单链DNA 模板，克隆并扩增待测DNA 片段，使其变性。选择一条与 DNA 单链互补的短链引物，将引物用放射性同位素标记。引物先同单链模板复性。在四个反应管中分别加入待测DNA 单链模板、互补引物分子、四种的dNTP、DNA 聚合酶(Klenow 酶)以及不同的 ddNTP。进行聚合反应 ，DNA 新生链延长，当掺入 ddNTP 时，聚合反应终止。在聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶中电泳。根据 X 底片对凝胶曝光所显的条带位置，读出 DNA 序列。读出序列方法：从下到上依次读出互补链的核苷酸序列第九章 重组 DNA 导入细胞一、重组 DNA 分子导入受体菌方式:转化、转导、转染、感染、接合等感受态细胞（competent cell）: 容易接受外源 DNA 的状态.导入方法1. 氯化钙转化法2. 电击法3. 体外包装感染法1、转化（transformation）指某些细菌(或其它生物)能通过其细胞膜摄取周围介质中的DNA 片段， 并将此外 DNA片段整合到自己染色体组中的过程。2、转导（transduction）定义：以噬菌体为媒介所进行的细菌遗传物质重组的过程，称为转导。3、接合(conjugation)是细菌通过性菌毛相互连接沟通，将遗传物质（主要是质粒 DNA）从供体菌转移给受体菌。 能通过结合方式转移的质粒称为接合性质粒， 不能通过性菌毛在细菌间转移的质粒为非接合性质粒。