第四节第四节 基因工程抗体基因工程抗体( (Genetic engineering antibody)Genetic engineering antibody)概念概念：采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球：采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体和双特异性抗体。 目的目的：一是降低免疫源性；一是降低免疫源性； 二是降低相对分子量，二是降低相对分子量， 三增加组织通透性。三增加组织通透性。一、单克隆抗体人源化一、单克隆抗体人源化( (humanized humanized antibody)antibody)降低反应降低反应 人一鼠嵌合抗体是将人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合人抗体的恒定区融合而得到的抗体。而得到的抗体。（1 1）嵌合抗体）嵌合抗体( (chimericchimeric antibody) antibody)从杂交瘤细胞分离出功能性从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因可变区基因，与，与人人IgIg恒恒定区基因连接定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人表达人- -鼠嵌合抗体。鼠嵌合抗体。特点：特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。人源化程度达到亲本抗体特异性结合抗原的能力。人源化程度达到70%70%左右左右19841984年出现嵌合重组技术，年出现嵌合重组技术，19941994年批准第一个嵌合年批准第一个嵌合抗体药物上市，至今总数已达抗体药物上市，至今总数已达6 6个如：个如：rituxanrituxan , , simulectsimulect , ,remicaderemicade可变区基因的获得可变区基因的获得杂交瘤细胞杂交瘤细胞mRNAmRNA分离分离 cDNAcDNA RT PCR RT PCR VH VH或或VLVL基因基因克隆鼠单抗的可变区基因，可从克隆鼠单抗的可变区基因，可从基因组文库基因组文库中分离，中分离，也可用也可用PCRPCR技术技术分离。分离。Pr 鼠鼠VH 人人 CH Pr 鼠鼠VL 人人 CL免疫球蛋白免疫球蛋白基因载体的构建基因载体的构建H链嵌合载体链嵌合载体L 链嵌合载体链嵌合载体共转染细胞共转染细胞启动子启动子人人- -鼠嵌合抗体基因工程改造策略鼠嵌合抗体基因工程改造策略 VL+人人IgCL载体载体VH+人人Igr1载体载体鼠VH鼠VL人CL人CH抗体分泌细胞抗体分泌细胞人人- -鼠嵌合基因工程抗体鼠嵌合基因工程抗体共转染共转染SP2/0细胞细胞现临床应用的嵌合抗体现临床应用的嵌合抗体RituxanRituxan ( (美罗华美罗华, ,利妥昔单利妥昔单抗抗 ) :) :第一个人源化单抗，第一个人源化单抗，针对针对CD20CD20的人的人/ /鼠嵌合单抗，鼠嵌合单抗，含人含人IgG1IgG1恒定区恒定区, ,用于治用于治疗低度恶性疗低度恶性B B 淋巴瘤淋巴瘤; ; 抗淋抗淋巴瘤作用主要可能来自于补巴瘤作用主要可能来自于补体作用、体作用、ADCCADCC和诱导肿瘤细和诱导肿瘤细胞凋亡胞凋亡Rituximab（1997）MabThera for the treatment of non-Hodgkin-lymphomasSimulectSimulect；（；（basiliximabbasiliximab 舒莱，巴利西单抗，舒莱，巴利西单抗，诺华诺华) )：嵌合性人：嵌合性人/ /鼠抗鼠抗IL-2IL-2受体受体(CD25)(CD25)单克隆抗单克隆抗体体, ,RemicadeRemicade：（：（infliximabinfliximab, ,英利昔单抗英利昔单抗, ,抗抗TNFaTNFa的的单克隆抗体），治疗炎性肠症单克隆抗体），治疗炎性肠症( (CrohnCrohn氏病氏病),),类风类风湿性关节炎湿性关节炎HerceptinHerceptin( (贺赛汀贺赛汀):):针对针对HER-2/neuHER-2/neu原癌基因产物原癌基因产物的人的人/ /鼠嵌合单抗，特异地作用于鼠嵌合单抗，特异地作用于HER-2HER-2受体过度受体过度表达的乳腺癌细胞表达的乳腺癌细胞 （2 2）改型抗体（人源化抗体）改型抗体（人源化抗体）1.1.将小鼠的将小鼠的CDRCDR（互补决定区）序列移植到人抗（互补决定区）序列移植到人抗体可变区框架中，产生的抗体称为体可变区框架中，产生的抗体称为CDRCDR移植抗移植抗体体。重构抗体重构抗体(Reshaped (Reshaped Antibody)Antibody)为了减少嵌合抗体中鼠源性序列，人们又将鼠抗为了减少嵌合抗体中鼠源性序列，人们又将鼠抗体体V V区（区（H H、L L链链）中的）中的3 3个超变区基因个超变区基因插入人抗体插入人抗体的的V V区的框架（区的框架（FRFR）基因中，这样构建的抗体保留）基因中，这样构建的抗体保留了鼠抗体与抗原结合的特异性。这种抗体几乎百了鼠抗体与抗原结合的特异性。这种抗体几乎百分之百人源化了。分之百人源化了。异源单抗上异源单抗上六个六个CDRCDR通过通过PCRPCR等方法克隆到人抗体等方法克隆到人抗体相应的框架区相应的框架区(FR) (FR) 上构建成新抗体上构建成新抗体Humanizing AntibodiesHumanizing AntibodiesVLVHMouseVLVHHumanVLVHHumanized Antibody with Mouse LoopsCDR序列序列 CDR序列序列 鼠单克隆抗体鼠单克隆抗体 人抗体人抗体人源化抗体（该型抗体人源化抗体（该型抗体） 鼠单克隆鼠单克隆V区人源化（区人源化（CDR移植）移植） 经过经过CDRCDR移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变，到现在已有数百种人源化抗体。合能力保持不变，到现在已有数百种人源化抗体。人源性可达人源性可达90%90%以上以上现在以及未来几年，人源化抗体药物将占有主体现在以及未来几年，人源化抗体药物将占有主体地位。地位。目前该方法是人源化单抗最常用、最基本的方法目前该方法是人源化单抗最常用、最基本的方法问题问题改型单抗亲和力仅为原来鼠抗体的亲和力的改型单抗亲和力仅为原来鼠抗体的亲和力的1/401/40亲和力下降，亲和力是影响改型单链抗体应用于亲和力下降，亲和力是影响改型单链抗体应用于临床的重要因素临床的重要因素 人人IgIg分子的框架区一些氨基酸与鼠分子的框架区一些氨基酸与鼠IgIg的的CDRCDR区不协区不协调调三维蛋白结构等需进一步丰富三维蛋白结构等需进一步丰富已上市人源化改型抗体已上市人源化改型抗体19971997年美国批准第一个人源化抗体药物上市，如年美国批准第一个人源化抗体药物上市，如今总数已达今总数已达1010个，占上市抗体药物总数的个，占上市抗体药物总数的50%50%，如，如曲妥珠单抗曲妥珠单抗 ( (TrastuzumTrastuzum):):重组重组DNADNA人单克隆抗体人单克隆抗体, ,选择性作用于选择性作用于HERHER2 2 贝伐珠单抗贝伐珠单抗( (BevacizumabBevacizumab):):重组重组DNADNA人单克隆抗体人单克隆抗体, ,选择性作用于选择性作用于VEGF VEGF （4 43 3）小分子抗体）小分子抗体小分子抗体包括小分子抗体包括FabFab、FvFv或或ScFvScFv、单域抗体及最小、单域抗体及最小识别单位等几种。识别单位等几种。基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的V V区片段，其相对分子质量仅为原抗体的区片段，其相对分子质量仅为原抗体的1/80-1/31/80-1/3。FvFvScFvScFv单区单区抗体抗体最小识别单位最小识别单位FabFab (1)Fab(1)Fab片段抗体：片段抗体：VH+CH1VH+CH1 (2)FV (2)FV抗体：抗体：VH+VL VH+VL (3) (3)单链抗体：单链抗体：VH-Linker-VLVH-Linker-VL (4) (4)单域抗体：单域抗体：VHVH或或VLVL小分子抗体有很多优点小分子抗体有很多优点: :可以用细菌或酵母菌发酵生产，成本低可以用细菌或酵母菌发酵生产，成本低; ;分子小，穿透力强分子小，穿透力强; ;不含不含FcFc，没有，没有FcFc带来的效应带来的效应; ;在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出; ;易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。素或酶标抗体等。 由完整的轻链和由完整的轻链和FdFd组成，大小为完整分子的组成，大小为完整分子的1/31/3。 把把FabFab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下FabFab进进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活性。入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活性。( ()Fab)Fab重组重组FabFab片断是单价的片断是单价的V VH H-C-CH H（FdFd）和轻链的）和轻链的V VL L-C-CL L两个片断由二硫键连接而成。它具有与抗体相同两个片断由二硫键连接而成。它具有与抗体相同的抗原结合活性，其特点是结构稳定，制作简便。的抗原结合活性，其特点是结构稳定，制作简便。细菌表达的细菌表达的FabFab与酶解与酶解IgIg后所获得的后所获得的FabFab具有相同具有相同的功能的功能。免疫球蛋白基因载体的构建H链表达载体L链表达载体共转染细胞共转染细胞Pr VH CH1 Pr VL CLFab 抗体分子的制备抗体分子的制备Fab antibody molecule抗体分泌细胞VHVLCL-S-S-CH1Fab 抗体分子的制备抗体分子的制备FabFab抗体易于穿透血管壁和组织屏障进入病灶抗体易于穿透血管壁和组织屏障进入病灶无无FcFc段，减少了非特异反应和排斥反应段，减少了非特异反应和排斥反应无无ADCCADCC和细胞毒和细胞毒CDCCDC主要作为载体分子用于导向诊断和治疗主要作为载体分子用于导向诊断和治疗 FvFv、ScFvScFv的大小约为全分子的的大小约为全分子的1/61/6 FvFvScFvScFv连接肽连接肽()单链抗体单链抗体( (single chain antibodysingle chain antibody)） FvFvFvFv是由抗体重，轻链的可变区基因是由抗体重，轻链的可变区基因(V(VH H、V VL L) )之间通之间通过一段编码连接肽基因，拼接后表达形成的重组过一段编码连接肽基因，拼接后表达形成的重组蛋白。是一种具有抗原结合能力的最小抗体片段，蛋白。是一种具有抗原结合能力的最小抗体片段，可在一些不需可在一些不需FcFc段效应功能的实际应用中开展研段效应功能的实际应用中开展研究和应用。究和应用。其优点是分子量小，易于穿透组织到达靶器官发其优点是分子量小，易于穿透组织到达靶器官发挥功效，易于构建和生产，但易于被清除。挥功效，易于构建和生产，但易于被清除。 分别构建载体分别构建载体L链表达载体链表达载体H链表达载体链表达载体共转染细胞共转染细胞Pr VH Pr VL Fv 二硫键稳定的二硫键稳定的Fv (disulfide-stabilized Fv,ds-Fv)小分子抗体的制备小分子抗体的制备ds-Fv抗体分泌细胞抗体分泌细胞VHVL-S-S-Fv小分子抗体的制备小分子抗体的制备disulfide-stabilized Fv,ds-Fv方法：方法：用基因工程方法，将抗体重链和轻链可用基因工程方法，将抗体重链和轻链可变区通过一个连接肽连接而成的重组蛋白。变区通过一个连接肽连接而成的重组蛋白。FvFv由由VHVH与与VLVL构成，由于其结合是非共价结合，构成，由于其结合是非共价结合，故故FvFv不稳定不稳定。在在VHVH与与VLVL之间加上一段之间加上一段连接肽连接肽，把，把VHVH与与VLVL连成连成一条单链，一条单链，得到得到ScFvScFv，即单链抗体。，即单链抗体。连接肽的长度在连接肽的长度在10-1510-15个氨基酸左右，不宜太长个氨基酸左右，不宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。常用的连接肽是等特点。常用的连接肽是(GGGGS)3(GGGGS)3。VH VL接头接头DNA (Gly4Ser)3 VH引物引物PCR VH 接头DNA酶切、克隆酶切、克隆 ScFv (single chain Fv,scFv )的构建的构建 变性、复性变性、复性VL引物引物(2) Sc-FvVL 单链抗体单链抗体的构建在已知亲本的构建在已知亲本DNADNA序列时可用完全序列时可用完全人工合成法人工合成法; ; 在具备亲本单抗可变区的在具备亲本单抗可变区的cDNAcDNA克隆时，可用克隆时，可用定定点突变法点突变法在其两端造成适当的内切酶位点，与人在其两端造成适当的内切酶位点，与人工合成的连接肽编码序列连接，组装到表达载体工合成的连接肽编码序列连接，组装到表达载体中中; ; 如果从杂交瘤细胞系构建单链抗体，可用如果从杂交瘤细胞系构建单链抗体，可用PCRPCR方方法法扩增可变区基因，再组装到适当的表达载体上。扩增可变区基因，再组装到适当的表达载体上。1.1.单价单链抗体（传统单链抗体）单价单链抗体（传统单链抗体）2.2.单链抗体多聚体单链抗体多聚体linkerlinker少于个氨基酸，形成多聚体少于个氨基酸，形成多聚体. .双特异性单链抗体双特异性单链抗体双特异性单链抗体双特异性单链抗体DiabodyDiabody structure structure双特异性抗体双特异性抗体 抗原抗原A A抗原抗原B B-S-S-FabVHCH1VL-S-S-CH1VHVLFvVHVLCTLCD3TUMORCELL-S-S-VHCH1VL-S-S-CH1抗原抗原A A抗原抗原B B 单链抗体最常用的表达体系是单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌大肠杆菌，有，有2 2种种方式方式: : 一是表达为一是表达为包涵包涵或非包涵体的不溶蛋白。产量高，或非包涵体的不溶蛋白。产量高，可达细菌蛋白总量的可达细菌蛋白总量的5%-20%;5%-20%; 二是二是分泌型表达分泌型表达，将细菌的信号肽序列与单链抗，将细菌的信号肽序列与单链抗体的氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到质周腔体的氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到质周腔和细菌体外，进行折叠后成为有活性的分子。但产和细菌体外，进行折叠后成为有活性的分子。但产量不及前者，一般实验室培养条件下每升细菌的产量不及前者，一般实验室培养条件下每升细菌的产量仅在数毫克左右。量仅在数毫克左右。优点：优点：无无HAMAHAMA反应反应能保持与抗原较高结合的性能，能保持与抗原较高结合的性能，分子量小，穿透性强，体内循环半衰期短，免疫原分子量小，穿透性强，体内循环半衰期短，免疫原性低，易于穿透性低，易于穿透但但linkerlinker增加了新的抗原性增加了新的抗原性单链抗体保留了原有单价单链抗体保留了原有单价FabFab的抗原结合能力。由的抗原结合能力。由于分子量比较小于分子量比较小(25 (25 kDkD) )，有利于穿过血管组织定，有利于穿过血管组织定位于肿瘤。位于肿瘤。尽管尽管scFvscFv能满足大部分能满足大部分FvFv的稳定性，有时的稳定性，有时scFvscFv单单价结合位点结构干扰了其与抗原的结合，价结合位点结构干扰了其与抗原的结合，LinkerLinker结构会破坏结构会破坏scFcscFc的正确重叠。的正确重叠。在在scFvscFv基础上改进：两个基础上改进：两个scFvscFv联在一起组成双联在一起组成双scFvscFv片段片段(disulfide stabilize (disulfide stabilize FvsFvs，dsFvsdsFvs) )、permutated permutated FvsFvs ( (pFvspFvs) )。引入亮氨酸拉链、半胱。引入亮氨酸拉链、半胱氨酸及氨酸及-螺旋等结构，可用于构建双价单链抗体螺旋等结构，可用于构建双价单链抗体分子分子( (dsFvdsFv) )。dsFvdsFv在在3737很稳定，具有很强的选很稳定，具有很强的选择性杀伤细胞毒活性择性杀伤细胞毒活性适用适用：1.1.用于肿瘤的导向治疗用于肿瘤的导向治疗2.2.肿瘤的影像分布肿瘤的影像分布主要应用主要应用. .放射免疫疗法放射免疫疗法. .免疫毒素治疗免疫毒素治疗. .体内解毒作用体内解毒作用 即为即为VHVH，约为完整分子的约为完整分子的1/121/12。它只由一个结构。它只由一个结构域构成，故称域构成，故称单域抗体。单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。降低，但仍保持着原单抗的特异性。 VH(3)(3)单域抗体单域抗体分别由单域分别由单域V VH H或或V VL L采用基因工程法构建的抗体组成。采用基因工程法构建的抗体组成。在抗原结合部位中，在抗原结合部位中，V VH H作用比作用比V VL L大，故一般用大，故一般用单域单域V VH H抗体抗体。由于由于V VH H暴露了原先与暴露了原先与V VL L结合的疏水性，使其特异性结合的疏水性，使其特异性降低，还需对降低，还需对V VH H片断做一些结构改造才能应用片断做一些结构改造才能应用抗体及其片段分子的特性抗体及其片段分子的特性小分子抗体小分子抗体三三 多功能抗体多功能抗体(1) (1) 双特异抗体双特异抗体 ( (bispecificbispecific antibody) antibody) 双链抗体双链抗体 （DiabodyDiabody）一种小分子）一种小分子的双价双特异性抗体片的双价双特异性抗体片段。段。其结合抗原的两个其结合抗原的两个臂具有不同的特异性臂具有不同的特异性 所以双特异性抗体与既往肿瘤免所以双特异性抗体与既往肿瘤免疫治疗相比疫治疗相比, ,除了能除了能特异性识别肿瘤细特异性识别肿瘤细胞胞外外, ,还能还能将循环血液中的免疫效应细将循环血液中的免疫效应细胞再导向至肿瘤细胞处胞再导向至肿瘤细胞处, ,从而使效应细从而使效应细胞的抗肿瘤活性增强胞的抗肿瘤活性增强, ,发挥免疫导向作发挥免疫导向作用用, ,这是肿瘤治疗的新突破。这是肿瘤治疗的新突破。双特异性抗体双特异性抗体：将两个抗体的重链和轻链：将两个抗体的重链和轻链V V区基因的区基因的重组体导入宿主细胞中表达，或用肽链连接物连接重组体导入宿主细胞中表达，或用肽链连接物连接两种不同特异性抗体的可变区基因，构建单肽双特两种不同特异性抗体的可变区基因，构建单肽双特异性抗体。异性抗体。如：将抗肿瘤细胞如：将抗肿瘤细胞EGFREGFR的的FabFab与抗与抗T T细胞细胞CD3CD3的的FabFab组组成双特异性抗体，有助于介导成双特异性抗体，有助于介导T T细胞杀肿瘤（连接效细胞杀肿瘤（连接效- -靶细胞）。靶细胞）。此外还可作为载体将毒素、核酸、药物、定位于靶此外还可作为载体将毒素、核酸、药物、定位于靶细胞，发挥治疗肿瘤和心血管疾病。细胞，发挥治疗肿瘤和心血管疾病。与与mAbmAb相比，相比，BsAbBsAb具有以下优点：具有以下优点：(1)(1)较低浓度即可杀伤或溶解肿瘤细胞；较低浓度即可杀伤或溶解肿瘤细胞；(2)(2)对低表达或不表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞有对低表达或不表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞有杀伤或抑制作用；杀伤或抑制作用；(3)(3)激活结合的细胞毒性激活结合的细胞毒性T T淋巴细胞淋巴细胞 (CTL)(CTL)，发挥，发挥多种生物学效应，协助杀伤肿瘤细胞。多种生物学效应，协助杀伤肿瘤细胞。MinibodyAgAgAgscFvDiabody3. 3. bisFvsbisFvs应用应用（1 1）治疗）治疗能能结合靶肿瘤细胞结合靶肿瘤细胞又能又能结合高细胞毒性的效应细结合高细胞毒性的效应细胞胞, ,将效应细胞富集在肿瘤周围将效应细胞富集在肿瘤周围, ,而且可以模拟天而且可以模拟天然配体的作用然配体的作用, ,与细胞表面引发分子结合与细胞表面引发分子结合, ,激活效激活效应细胞应细胞, ,实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。正在进行临床试验的双特异性抗体正在进行临床试验的双特异性抗体BsAb 特异性特异性 临床阶段临床阶段 病种病种BIS-1 CD3 x EGF-R phase I renalOC/TR CD3 x folate R phase II ovarianSHR-1 CD3 x CD19 phase I B-CHRS-3/A9 CD16 x CD30 phase I-II H D2B1 CD16 x Her-2/neu phase I tumorMDX-H210 CD64 x Her-2/neu phase I-II tumorMDX-447 CD64 x EGF-R phase I-II tumor 双特异性抗体双特异性抗体抗人肝癌单抗抗人肝癌单抗 /抗人抗人 CD3单抗单抗 抗抗Her2/neu单抗单抗/抗人抗人CD16单抗单抗 抗人抗人CD20单抗单抗/抗人抗人CD3单抗单抗二、多功能抗体二、多功能抗体scFvscFv多聚体，包括二聚体，三聚体，四聚体等。多聚体，包括二聚体，三聚体，四聚体等。克服克服scFvscFv体内清除过快的不足体内清除过快的不足高亲和性，由于具有多个结合价，可同时与细胞高亲和性，由于具有多个结合价，可同时与细胞膜上相邻的多个靶抗原结合，有利于肿瘤的影像膜上相邻的多个靶抗原结合，有利于肿瘤的影像分布及治疗分布及治疗同一细胞或相邻细胞膜表面受体发生交联，激活同一细胞或相邻细胞膜表面受体发生交联，激活细胞。细胞。三、抗体融合蛋白三、抗体融合蛋白Antibody-cytokine fusion proteinsAntibody-cytokine fusion proteins 抗体恒定区（抗体恒定区（C C区）区）N-N-端基因连接人细胞受体端基因连接人细胞受体（CD4-FCCD4-FC）或粘附分子基因在真核细胞中表达正）或粘附分子基因在真核细胞中表达正确折叠的抗体样融合蛋白（称确折叠的抗体样融合蛋白（称免疫粘连素免疫粘连素），），N N端端为同一种分子称为同源二聚体结构。为同一种分子称为同源二聚体结构。N N端为两种不端为两种不同的分子称异源二聚体结构。一方面可发挥抗体同的分子称异源二聚体结构。一方面可发挥抗体效应，另一方面效应，另一方面N N端端CD4CD4为为T T细胞亚类糖蛋白，又是细胞亚类糖蛋白，又是HIVHIV受体，受体，CD4CD4可与可与HIVHIV结合由结合由FCFC活性杀灭活性杀灭HIVHIV，可，可阻断阻断HIVHIV感染感染T T细胞。细胞。从广义讲应属于双功能抗体范畴。从广义讲应属于双功能抗体范畴。（1 1）配基）配基配基型融合蛋白，如配基型融合蛋白，如 CD4-Fc. CD4-Fc. （2 2）配基）配基IgIg型嵌合抗体，如型嵌合抗体，如 IL-2-IgIL-2-Ig（3 3）配基）配基FVFV型嵌合蛋白，如型嵌合蛋白，如 CD4-FVCD3CD4-FVCD3 (4) (4) 受体受体FVFV型融合蛋白型融合蛋白（5 5）酶）酶抗体型融合蛋白（抗体型融合蛋白（abeneymeabeneyme, ,抗体酶）抗体酶）与生物活性蛋白结合（与生物活性蛋白结合（antigen-binding fusion antigen-binding fusion protein, ABFP)protein, ABFP) 免疫导向免疫导向 免疫桥连免疫桥连 嵌合受体嵌合受体含含FcFc段的抗体融合蛋白段的抗体融合蛋白免疫黏附素免疫黏附素( (FcFc fusion fusion protein,FcFPprotein,FcFP) ) FcFc的作用：检测、纯化、的作用：检测、纯化、 延长血清中半寿期延长血清中半寿期 生物学效应功能生物学效应功能细胞毒性细胞毒性T T淋巴细胞相关抗原一淋巴细胞相关抗原一4(cytotoxic T 4(cytotoxic T lymphocytelymphocytesociatedsociated antigen 4 antigen 4，CTLA4) CTLA4) 与与CD28CD28是共刺激分子是共刺激分子B7B7的受体的受体CTLA4CTLA4作为免疫抑制剂以其特异、低毒、高效的基因作为免疫抑制剂以其特异、低毒、高效的基因治疗特点，应用于试验及临床各阶段治疗特点，应用于试验及临床各阶段研究人员从阻断研究人员从阻断T T细胞活化共刺激信号通路人手，设细胞活化共刺激信号通路人手，设计出了一种可溶性、半衰期更长的计出了一种可溶性、半衰期更长的CTLA4CTLA4免疫球蛋白免疫球蛋白融合蛋白融合蛋白(CTLA4(CTLA4IgIg) )，由其作为，由其作为CD28CD28分子阻断剂应分子阻断剂应用于试验及临床研究用于试验及临床研究目前利用目前利用CTLA4CTLA4预防及治疗预防及治疗身免疫病及移植物抗宿主身免疫病及移植物抗宿主病病(graft(graftversus-host-versus-host-diseasedisease，GVHDGVHD) ) GVHDGVHD已进已进入入3 3期临床试验阶段期临床试验阶段FcproteinSPAthrombinFcFc的作用：检测、纯化的作用：检测、纯化G-CSFFcFusion ProteinDNA ligationexpressionFcFc的作用：延长血清中半寿期的作用：延长血清中半寿期抗体融合蛋白抗体融合蛋白TAT AAA TAA GCT TTAATA TTT ATT CGA AATG-CSFFcFusion ProteinHindIIIHindIIIG-CSFTAT AAA TA A GCT TTAATA TTT ATT CGA AATMean bean nucleaseTAT AAA TA TTAATA TTT AT AAT Stop codon TAA TAG TGATAATAT AAA TA TTAATA TTT AT AATCCCCGGGGLigaseTAT AAA TAC CCC GGG GCC CCG GGG TTAATA TTT ATG GGG CCC CGG GGC CCC AAT Stop codon TAA TAG TGAsmaI CCC GGGTAT AAA TAC CCC G GGG TTAATA TTT ATG GGG CCCC AATLigaseFcTAT AAA TAC CCC TAAGGGG TTAATA TTT ATG GGG ATTCCCC AATFcG-CSFFcTAAATT抗纤维蛋白的抗纤维蛋白的ScFv-tPAScFv-tPA基因连接，有助于与血栓基因连接，有助于与血栓中的纤维蛋白结合，使中的纤维蛋白结合，使tPAtPA定位溶解血栓定位溶解血栓. .抗体融合蛋白抗体融合蛋白 抗人抗人Her2/neu单抗单抗-IL-2 CTLA-4-Ig 抗纤维蛋白抗纤维蛋白-ProUK抗抗活化血小板活化血小板-UK1.1.免疫毒素免疫毒素免疫毒素免疫毒素( (ImmunotoxinsImmunotoxins，ITsITs) ) ：毒素和抗体的交：毒素和抗体的交联物联物ITsITs是一种毒素肽和细胞选择性靶向配体连接的融是一种毒素肽和细胞选择性靶向配体连接的融合蛋白，能通过靶向结构域的特异结合功能使毒素合蛋白，能通过靶向结构域的特异结合功能使毒素传递到靶细胞并与之作用进而杀死肿瘤细胞。在细传递到靶细胞并与之作用进而杀死肿瘤细胞。在细胞内发挥作用，在大多数情况下胞内发挥作用，在大多数情况下1 1个分子就可以杀个分子就可以杀死一个细胞死一个细胞 目前，还没有任何一个免疫毒素与抗体结合的药物目前，还没有任何一个免疫毒素与抗体结合的药物上市，但进入上市，但进入I I和和IIII期临床至少有期临床至少有5 5个个 CD33CD33的抗体与的抗体与CalicheamicinCalicheamicin( (加里奇霉素加里奇霉素) )的偶联的偶联物物MylotargMylotarg已被已被FDAFDA批准用于治疗急性髓性白血病批准用于治疗急性髓性白血病。毒素来源毒素来源l(1)(1)细菌毒素，如白喉毒素和假单胞菌外毒素；细菌毒素，如白喉毒素和假单胞菌外毒素；白白喉毒素及衍生物喉毒素及衍生物(Diphtheria (Diphtheria toxin,DTtoxin,DT) ) DTDT的的A A区具区具有链酶活性，有链酶活性，B B区具有细胞结合活性；将区具有细胞结合活性；将B B区去除或区去除或点突变，可以制备一系列点突变，可以制备一系列DTDT衍生物，对正常细胞低衍生物，对正常细胞低毒。毒。绿脓杆菌外毒素绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas (Pseudomonas exotoxinexotoxin, , PE)PE) l(2)(2)植物来源的核糖体失活蛋白植物来源的核糖体失活蛋白 (RIP)(RIP)，如蓖麻毒蛋，如蓖麻毒蛋白和天花粉蛋白；白和天花粉蛋白；l(3)(3)真菌毒素，如真菌毒素，如-sarcin-sarcin等。等。免疫毒素免疫毒素(mmunotoxinsmmunotoxins) ) ，由靶向部分，由靶向部分( (载体载体) )和和毒性部分毒性部分( (弹头弹头) )组成。靶向部分可以分为两类：组成。靶向部分可以分为两类：一类是单克隆抗体；另一类是某些具有重要生理一类是单克隆抗体；另一类是某些具有重要生理功能的受体或配体，如生长因子、细胞因子、淋功能的受体或配体，如生长因子、细胞因子、淋巴因子和多肽激素等。巴因子和多肽激素等。毒性部分通常是蛋白毒素，包括植物毒素和细菌毒性部分通常是蛋白毒素，包括植物毒素和细菌毒素；此外，毒性部分还可以是放射性同位素、毒素；此外，毒性部分还可以是放射性同位素、小分子药物等。习惯上，把毒性部分为蛋白毒素小分子药物等。习惯上，把毒性部分为蛋白毒素者称为免疫毒素，而将毒性部分为放射性同位素者称为免疫毒素，而将毒性部分为放射性同位素或化疗药物者称为免疫交联物或化疗药物者称为免疫交联物( (immunoconjugatesimmunoconjugates) )某些生长因子受体在肿瘤细胞表面过度表达，其配体可发挥类似抗体的功能。EGF受体的配体TGF-与PE40、PE38构成的免疫毒素对肿瘤细胞有明显的特异杀伤活性 免疫毒素免疫毒素CCVCVCCCSPDPSPDPRicin ARicin A（-FcRI-Ricin A）Immunotoxin: Antibody-Toxin Conjugate waynesword.palomar.edu/ images/antibod2.gifricin from the castor bean (Ricinus communis). Antibody is tumor-specificOnly the targeted tumor cells are killed by the toxin Common side effect Vascular leak syndrome.Could be relieved by usage of mutated toxinBunch of other toxins could be used2.2.免疫细胞因子免疫细胞因子显著延长细胞因子在血浆内的半衰期，用于增强显著延长细胞因子在血浆内的半衰期，用于增强肿瘤细胞的免疫原性和激活免疫系统。肿瘤细胞的免疫原性和激活免疫系统。目前已有一个目前已有一个IL-2IL-2与单抗结合的药物进入临床研与单抗结合的药物进入临床研究究 cytokinecytokine能激活单核、巨噬能激活单核、巨噬 、NKNK、T T和和B B细胞等细细胞等细胞，治疗癌症能够引起免疫应答，但这种免疫反胞，治疗癌症能够引起免疫应答，但这种免疫反应是非特异的，常产生全身毒性。应是非特异的，常产生全身毒性。使用抗体工程技术将细胞因子与抗体连接形成融使用抗体工程技术将细胞因子与抗体连接形成融合蛋白，通过靶向作用，细胞因子在肿瘤组织的合蛋白，通过靶向作用，细胞因子在肿瘤组织的靶细胞上聚集，在局部杀伤肿瘤细胞，而靶细胞上聚集，在局部杀伤肿瘤细胞，而非特异非特异性毒性将减少或消失性毒性将减少或消失。抗体细胞因子融合蛋白其抗体功能域可引导细抗体细胞因子融合蛋白其抗体功能域可引导细胞因子浓集在肿瘤组织的微环境中，之后抗体部胞因子浓集在肿瘤组织的微环境中，之后抗体部分直接抑制肿瘤细胞活性，并诱导二次免疫应答。分直接抑制肿瘤细胞活性，并诱导二次免疫应答。全长型抗体全长型抗体FcFc上存在两个效应细胞结合位点，功上存在两个效应细胞结合位点，功能更为强大，其中一个位点与细胞因子结合，激能更为强大，其中一个位点与细胞因子结合，激活效应细胞，另一个与活效应细胞，另一个与FcRFcR结合，引发抗体依赖结合，引发抗体依赖细胞的细胞毒作用。细胞的细胞毒作用。CH1CH2CH3IL-2scFvIL-12 免疫细胞因子免疫细胞因子(Immunocytokine)近年来已有多种抗体细胞因子融合蛋白问世，如：近年来已有多种抗体细胞因子融合蛋白问世，如：抗体IL-12融合蛋白抗体IL-2融合蛋白( (三三) )特殊抗体特殊抗体1.1.细胞内抗体细胞内抗体内抗体内抗体（intrabodyintrabody) ) ，细胞内合成并作用于细胞，细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体内组分的抗体抗体的抗体的N N端或端或C C端加引导序列（如核定位信号，线端加引导序列（如核定位信号，线粒体定位信号等），定位于亚细胞部位粒体定位信号等），定位于亚细胞部位. .应用：应用：分子功能的研究分子功能的研究下调细胞因子受体的表达下调细胞因子受体的表达抑制胞内癌蛋白活性抑制胞内癌蛋白活性抑制病毒复制抑制病毒复制细胞内抗体：在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体细胞内抗体：在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体细胞核EGFREGFREGFR细胞内抗体的作用机理细胞内抗体的作用机理阻断靶蛋白的活性部位阻断靶蛋白的活性部位阻断细胞内蛋白蛋白相互作用阻断细胞内蛋白蛋白相互作用干扰细胞内靶蛋白的转运干扰细胞内靶蛋白的转运促使靶蛋白降解促使靶蛋白降解肿瘤坏死靶向治疗肿瘤坏死靶向治疗(TNT)(TNT) 肿瘤细胞呈现极高的增殖特征，并伴有异常分化肿瘤细胞呈现极高的增殖特征，并伴有异常分化和中心部位的坏死，过快的细胞增殖引起瘤组织和中心部位的坏死，过快的细胞增殖引起瘤组织的血供、氧供障碍，进而引发的血供、氧供障碍，进而引发区域性细胞死亡区域性细胞死亡。同时，肿瘤组织内的微血管也因快速增长和瘤细同时，肿瘤组织内的微血管也因快速增长和瘤细胞某些分泌成分的作用，呈现结构和功能上的缺胞某些分泌成分的作用，呈现结构和功能上的缺陷，这种缺陷原本是有利于瘤组织的血流和营养陷，这种缺陷原本是有利于瘤组织的血流和营养灌输的，但这一灌输的，但这一”Leaky”Leaky”特征也为特征也为靶向分子的通靶向分子的通透透与靶点结合提供了条件与靶点结合提供了条件 能与细胞核抗原成份结合的靶向分子携带杀瘤物能与细胞核抗原成份结合的靶向分子携带杀瘤物质，滞留或定位于肿瘤组织内，造成肿瘤的特异质，滞留或定位于肿瘤组织内，造成肿瘤的特异性杀伤性杀伤 靶向分子主要是抗细胞核内某些组份的抗体，杀靶向分子主要是抗细胞核内某些组份的抗体，杀瘤物质为核素、生物酶、前体药物或某些抗瘤细瘤物质为核素、生物酶、前体药物或某些抗瘤细胞因子等。靶向抗体结合一个坏死细胞的靶位，胞因子等。靶向抗体结合一个坏死细胞的靶位，可导致周围可导致周围1010个肿瘤细胞的死亡，瘤细胞杀伤后个肿瘤细胞的死亡，瘤细胞杀伤后释出的靶向分子又可进入相邻的瘤组织造成进一释出的靶向分子又可进入相邻的瘤组织造成进一步的杀伤，如此使杀瘤范围不断扩大，直至正常步的杀伤，如此使杀瘤范围不断扩大，直至正常组织细胞组织细胞 PeregrinePeregrine开发了开发了TNTTNT的几种抗体，其中以的几种抗体，其中以TNTTNT3 3的临床实验效果最佳的临床实验效果最佳 TNTTNT为小鼠的为小鼠的FvFv基因与人基因与人IgG(1)FcIgG(1)Fc基因的嵌合基因的嵌合重组产物重组产物PeregrinePeregrine转给上海美恩公司专利转给上海美恩公司专利唯美生唯美生( (VivatuxinVivatuxin):):碘碘131I131I肿瘤细胞核人鼠肿瘤细胞核人鼠嵌合单克隆抗体注射液嵌合单克隆抗体注射液, SFDA, SFDA批准用于放化疗批准用于放化疗失败的晚期肺癌治疗失败的晚期肺癌治疗,2007,2007年年1 1月上市月上市 2.2.抗原化抗体抗原化抗体( (antigenized antibody,AbAg) )借助人源化抗体的构建方法，以抗体借助人源化抗体的构建方法，以抗体V V区作为分子区作为分子载体来表达生物学相关的多肽或外源性抗原表位，载体来表达生物学相关的多肽或外源性抗原表位，可把编码蛋白质抗原表位的核苷酸片段插入重链可把编码蛋白质抗原表位的核苷酸片段插入重链CDR3CDR3序列中进行表达，产生具有天然抗原表位构序列中进行表达，产生具有天然抗原表位构象和免疫原性的新型抗体象和免疫原性的新型抗体L L及及H H链的链的V V区各由四个框架区区各由四个框架区(FRS)(FRS)及及3 3个互补决定个互补决定区区(CDRS)(CDRS)组成组成FRSFRS相对保守，位于两个相对保守，位于两个FRFR之间的之间的CDRCDR形成的是一形成的是一环状环状 结构，在结构上表现为空间构象限定及结构结构，在结构上表现为空间构象限定及结构外显，具有较强而稳定的免疫原性。外显，具有较强而稳定的免疫原性。新型疫苗新型疫苗3.单域抗体单域抗体(single domain antibody, sdAb),又又称纳米称纳米(nanobody)抗体抗体,(heave chain antibody, hcAb)l骆驼科和骆驼科和shark血清里分离出来的血清里分离出来的Nanobody在合成、操作、吸收和价格方在合成、操作、吸收和价格方面具有优势面具有优势容易获得容易获得 (免疫，免疫，B淋巴细胞分离，抗体库展示技术筛选）淋巴细胞分离，抗体库展示技术筛选）稳定性好稳定性好 (含有多个二硫键，具有很好的稳定性，可在常温放置）含有多个二硫键，具有很好的稳定性，可在常温放置）可溶性高可溶性高 (不象不象scFv那样容易聚集成团，那样容易聚集成团，VHH亲水性好，具有很亲水性好，具有很好的水溶性，提高作为药物的利用率好的水溶性，提高作为药物的利用率)吸收好吸收好 (可溶性高，所以可溶性高，所以Nanobody具有高吸收率的优点具有高吸收率的优点)表达容易表达容易 (可以在原核细胞中高效表达，有研究者可将产量提高可以在原核细胞中高效表达，有研究者可将产量提高到到2.5g/L)人源化简单人源化简单 (与人类重链基因同源性在与人类重链基因同源性在80%-90%，人源化已经取，人源化已经取得成功得成功偶联其他分子容易偶联其他分子容易 约为完整分子的约为完整分子的1/80-1/701/80-1/70大小，一般由一个大小，一般由一个CDRCDR构构成，它也保持着抗体的特异性。成，它也保持着抗体的特异性。CDR( (四四) )最小识别单位（最小识别单位（minmalminmal recognition unit) recognition unit)超变区多肽超变区多肽( (hypervariablehypervariable region region polypeptide, polypeptide, HRP)HRP)提高抗体提高抗体效应功能效应功能抗体融合蛋白抗体融合蛋白双特异性抗体双特异性抗体偶连细胞毒物质偶连细胞毒物质细胞内抗体细胞内抗体1 小分子抗体小分子抗体3 3 鼠单抗人源化鼠单抗人源化基基因因工工程程改改造造的的抗抗体体2